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文档简介
1、检测马铃薯环腐病菌的 PCR 、 ELISA 和 DNA 杂交等方法的比较 S. A. Slack 等著 刘学敏译尽管在种用马铃薯中 , 对细菌性环腐病 的不容许残留 限制超过 了 50年 , 但 在北美 洲 , 该病仍然是马铃薯种薯的主要限制因素。 由于实施不容许残留限制主要是通过观察大 量种用马铃薯 , 因而检测这种病害时干扰观 察者能力的因素如无症状侵染、 对症状发展 不利的环境条件、 栽培品种对马铃薯环腐病 菌 (Clavibacter michiganensis subsp. sepe-donicus 反应的变异、 以及其它病害的干扰或 寄主直接自然衰老等都影响检测的有效性。 只基于
2、症状表现来诊断细菌性环腐病的困难 使得几种检测方法得到运用和发展 , 其中包 括革兰氏染色 , 茄子生物检测和几种血清试 验 , 如胶乳凝集作用 , 免疫荧光 , 酶联免疫吸 附测定 (ELISA 。虽然已经证实这些方法是 有用的 , 但它们的使用受劳动力、 空间、 灵敏 度或特异 性以及检测所 需时间等因 素的限 制。最近 , DNA 杂交测定 (DHAs 法在检测 和诊断细菌性环腐病中显示出了魅力。这种 方法对于马铃薯环腐病菌的检测是高度特异 的 , 但其检测灵敏度是个限制因素。克服这 个问题的方法是利用聚合酶链反应 (PCR 。 本研究详述了利用 PCR 检测和诊断田间生 长马铃薯粗提取
3、液中细菌性环腐病的调查结 果 , 并提供了 PCR 同 ELISA 和 DHA 的比较 数据 , 这个数据的报告已发表。1材料和方法1. 1细菌培养和接种体的准备马铃薯 环腐病菌菌株 SS43在 7g /100g 的蛋白胨和 7g/100g 的蔗糖溶液中以冻干的 形式保 存 , 于室温 下 (接近 23e 在肉汁 -酵 母琼脂培养基上 (NBY 培养。生长 5d7d 后 , 细菌被转移到装有 500m l NBY 培养液的 1L 烧瓶中 , 室温下在 Labline3520摇床上以 150r/m in 的速度振荡培养 1周。于 4e , 以 15000x g 离心 30min 收集菌体 , 重
4、新悬浮于 0105mol/LpH712的磷 酸缓冲溶 液 (PB 中 , 根据 A 600相当于 110108CFU/m l 调整悬浮 液浓度为 104CFU /ml 或 1011CFU /ml 。 1. 2试验设计和准备接种剂量和栽培品种 (32 因子处理采 用完全随 机区组设计 , 由 6个小 区 (每小区 15株 组成 , 试验在北达克他州法戈和纽约 州伊萨卡进行。种薯准备和接种在伊萨卡进 行 , 种薯在法戈种植 , 隔夜邮递。经过检验的 马铃 薯 种薯 (品 种 Bel Rus 和 Russet Bur -bank 切割前 1周从冷藏中取出 , 切下含有单 个芽眼同样大小的种薯 (约
5、40g 保存于纸袋 中 , 纸袋用 3g/L Penncozeb 溶液浸湿并酸化 2d3d 。在种块发芽的一侧以 15b 角插入移 液管尖端 , 用 10L l 细菌悬浮液接种 , 最终接 种剂量为 102或 109CFU, 对 照植株 用 10L l 无菌 PB 接种。接种 后 , 将种 子送回前面所 述的纸袋中 , 于室温下贮存直至种植。 1. 3样品准备和试验定植后 35d 和 90d, 在每个小 区选取 5株地上或土中的主茎样本 , 在北达克他收集 的样本通过特快邮递送至纽约 , 样品用冷自收稿日期 :1997-04-025680(5 :国外农学 杂粮作物 1998, 18(1 :49
6、52来水冲洗 , 按先前描述的方法直接用尼龙膜 吸印 , 然 后 样 品密 封 于 塑 料 袋 中 , 保 存 在 -135e 下。至少 24h 后把样品从冷冻中取 出 , 缓缓融化 , 再在尼龙膜上吸印 , 尼龙膜按 前面描述的方法进行杂交 , 然后 , 从样品上切 下一小块 (110g 放入 2ml TE 溶液 (10mmol/L Tris -H Cl, 110m mol/L EDTA, pH 810 中研 磨 , 准备进行 ELISA 和 PCR 试验。这些提 取液放在微形试管中于 -80e 下保存。用于 ELISA 检测的样品 , 先将 100ml TE 提取液 加入 900ml 提取
7、缓 冲溶液中 014g /100g 牛 血 清 白蛋白 (BSA , 2g/100g 聚乙烯 基吡咯 烷 酮 mol/L r 2400040000, 0113g/100gNa 2H PO 4, 0102g/100g KH 2PO 4, 0102g/100gKCl, 0105g/100g 吐温 20, pH714根据 制造者提供的方案进行检测。用于本研究的 ELISA 系统是以 De Boen 等 (1989和 1988 描述的马铃薯环腐病菌的单克隆抗体 (1H3 为基础的。1. 4 聚合酶链反应一个 合 成 的 20-bp 低 聚 核 苷 酸 引 物 CSRS -C (5p -GGCCATGA
8、CGTTG -GTGACAC 用于扩增一个细菌质粒 pCS1的 重复序列的 11054-kb 片断 , 将 2L l TE 提取 的原始样品加入 198L l 蒸馏水中 , 轻轻混匀。 取 20L l 稀释的提取液 , 加到 20L l 新配制的溶 菌缓冲 溶液 1125g/100g 十 二 烷基 磺 酸钠 (SDS , 015m mol/LNaOH 中 , 于 90e 下加热 15min, 取 5L l 溶胞悬浮液加到 45L l PCR 混 合物 (50mmol/L KCl, 10m mol/L Tris -HCl, pH 813, 200mmol/L dNTP, 1mmol/L 引 物
9、CSRS -C,20g/100g去 离 子 乙 酰 胺 ,1125UAmpliTaq DNA 聚合酶 , 3m mol/L Mg -Cl 2, 0175g/100g 吐温 20 中 , 上面 覆盖矿物 油。 PCR 反应在 Perkin -ElmerDNA 热 循环 仪 480上 按下 面 程序 循 环 36次 :循环 1:94e /3min, 50e /60s, 73e /90s; 循环 236:94e /60s, 50e /60s, 73e /90s 。 PCR 反应产 /溴化乙锭染色 , 在紫外灯下观察。 1. 5 数据分析测定结果以二进制变量输入计算机并用 逻辑算符 (如和 , 如果
10、, 或 进行比较 , 根据制 造者 的 推 荐 , A 405=012的 吸 收 值 作 为 ELISA 样 品的 界 限值 , 记为 阳 性。 PCR 和 DHA 样品分别以在凝胶上存在相应大小的 谱带或放射性自显影上产生明显的标志记为 阳性。所有样品的分析结果用 Cochran 测验 进行比较。接种剂量、 品种、 地点和取样日期 对每种方法检测性能的影响利用 SAS 系统 中的 PROC GLM 程序分析 协方差确 定 , 除 非另有记录 , 本文数据为所有样品的最终测 验结果。2 结果和讨论我们的 PCR 反应程序中使用了一个 20-bp 低聚核苷酸引物 (CSRS -C 该引物是带有
11、质粒 pCS1中一个长度为 11078-kb S mal 片 断的重复序 列的 , 除 P40外 , 测验 的所有马 铃薯环腐病菌菌株都含有这个质粒。这个重 复序列含有所有的倒置重复 , 因此用于扩增 仅需单个引物。引物结合到 S mal 片断的核 苷酸 20bp39bp(互补链的同源部分 处 , 扩 增时产生一个 11054kb 的产物 , 这个产物代 表原始 Sm al 片断的 剩余 20bp1073bp 部 分 , 这个引物是从用于 DHA 研究的同一个 DNA 序列上得到的。从纯细菌培养试验获得的结果与前面报 道的 DHA 结果一样。所有的马铃薯环腐病 菌菌株试验都得到阳性 PCR 结
12、果。除了马 铃薯环腐病菌的 4个菌株外 , 与一些棒状杆 菌以及其它细菌的细菌环腐病 PCR 试验的 预计阳性 PCR 相比 , 其它棒状杆菌的结果都 没有导致非特异性 PCR 产物 , 它能明显地区 分于马铃薯环腐病菌的 PCR 产物 , 其在凝胶 上的 带大 小和 数 量不 同。 在 Curtobacteri-um , 欧氏杆菌属和假单胞杆菌属的试验中产 #50#国外农学 杂粮作物 第 18卷当一系列马铃薯环腐病菌的纯培养稀释 用于测试时 , 我们发现普遍用于检测细菌性 环腐病的方法中 PCR 是最灵敏的 , 在这些试 验中 , 每个反应 PCR 常规检测少于 10CFU 。 在纯培养极高
13、稀释情况下 (如小于 1CFU/反 应 , 结果不一致 , 可能是由于反应混合物中 目标 DNA 概率较低造成的。 PCR 似乎不受 马铃薯环腐病菌菌系的影响 , 因为我们可以 以相同的灵敏度检测这个细菌的流动的和非 流动的菌株 , 这与根据马铃薯环腐病菌胞外 抗原产物的血清学检测的结果相反。测试原始植物材料方案的最初过程显示 出 PCR 反应混合液中 M gCl 2和 SDS 的浓度 对于检测的成功是很关键的 , 还发现粗样的 稀释对 于排除 PCR 反 应的抑 制是必 需的。 运用试 验原 始植物 材料 的最 适方 案 , 证明 PCR 是特异而灵敏的检测田间样品的方法。 本研究中 , 使
14、用了所有检测马铃薯环腐病菌 的方 法 , 716个样 品 中 2412%得 到 了阳 性 PCR 反 应 , 对应 的 ELISA 和 DHA 分别 是 2319%和 2019%(PCR, ELISA 和 DHA 的接 种样品分别为 3612%, 3518%, 2911% 。总 之 , 在 检 测 中 观 察 到 的 差 异 统 计 显 著 (Cochran 测验 , P<010001 , PCR 和 ELISA 与 DHA 相 比 具 有 明 显 较 高 的 检 测 率 (Cochran 测验 , P 01001 。总体上 , 在 DHA 检测中 , 当样品在尼龙膜上吸印前经过冷冻 时
15、 , 所获得的阳性反应数目有略微显著的增 加 , 大概冷冻提高了植物组织中细菌的释放。 田间小区的试验设计是在大范围条件下 进行样品检测 , 会遇到种子自身检验和 /或诊 断 , 以及包括 /最好情况 0和 /最坏情况 0在内 的各种情况。例如 , 高 接种剂量、 易 感品种 (Russet Burbank 和取样日期晚的组合就与 低接种剂量 , 耐性品种 (Bel Rus 和取样日期 早的组合截然不同。本研究采用的每一检测 手段均受接种剂量、 品种和取样日期的显著 影响 (协方差分析每一种 检测 P=010001 , 素时 , 通常用 PCR 比用其它的检测方法具有 更大的检测频率。在 /最
16、好情况 0下。来自纽 约和北达可他的样品马铃薯环腐病菌的检出 率分别 为 70%和 9313%, 而在 /最 坏情况 0下 , 检出率较低 , 甚至根本检测不出细菌。一 些处理组合中 , 检出率低是令人担忧的。然 而是否阴性试验结果就说明了在植物中不能 检测出群体数量低的细菌 , 或是否接种后不 能侵染还不清楚。数据表明后者的解释可以 说明许多阴性的试验结果。对照植株的大部 分 (96% 的 ELISA 值 在 -01025A 405 01038范围内。接种植 株的 84%由 ELISA 检测为阴性的 , 其吸收值在此范围内。因此 , 可能是真正的阴性。前人的研究表明侵染植 株的细菌群体数量在
17、生长季节早期即达到检 测水平 , 我们观察确定播种后 35d 能检测到 细菌。本研究中包括了许多处理组合 (如北 达科他州样 品和 低接 种 剂量 的 Bel Rus 植 株 , 然而随着生长季节的进程 , 阳性植株的 数量不是持续增加 , 表明受侵染的植株趋向 于扩增细菌的数量。此外 , 接种剂量、 地点、 品种或取样日期与被侵染植株体内的细菌数 量之间没有明显的关系 , 这与前人报道的耐 性品种体内马铃薯环腐病菌数量低 , 并且这 能反映这些品种具有对侵染的一些抗性的结 论相反。检测马铃薯环腐病菌的能力的地区 间差异可 以表明抗侵染 能力受制 于环境条 件 , 这可以帮助我们解释环境对症状
18、表达的 影响。尽管 PCR 比 ELISA 有较高的 检测率 , 但这种差 异统计 不显 著 (Cochran 测验 P= 015639 。然而发现 ELISA 的性能主要依赖 于区分所 采用样品是阳 性还是阴 性的界限 值。正如 DeBoer 所述 , 对 细菌 性环腐 病用 ELISA 检测的样品 在低的和高的 吸收读数 间倾向于形成连续性 , 而不是对确定界限呈 理想的双峰分布。本研究中可以观察到对照 和接种植株得到的吸收值间大量的交迭 , 如 ,# 51 #第 1期 S. A. Slack 等 :检测马铃薯环腐病菌的 PCR 、 EL ISA 和 DNA 杂交提高杂交玉米种子质量和产量
19、的探讨 赵桂萍(辽宁省铁岭市种子管理站 铁岭 112000玉米杂交种子现在已普遍应用于农业生 产 , 全国每年需玉米杂交种约 8105t 9 105t, 可见杂交玉米种子质量的好坏、 产量的 高低直接影响农业生产及粮食产量。 玉米杂种优势的充分利用 , 关键取决于 种子的质量 , 而高质量的种子一是要有遗传 力强、 高纯度、 高配合力的亲本自交系组配 ; 二是严格掌握制种技术 , 玉米制种技术包括 种子质量与种子产量两个方面。 1保证种子质量1. 1亲本纯度的高低是决定种子质量的最 关键因素 如果亲本纯度本身不达标 , 特别 是父本 , 在制种的其它环节 , 无论怎样严格也 将无济于事 , 所
20、以选择亲本时一定要注意纯 度 , 有必要用电泳或种植手段进行纯度鉴定。 1. 2安排好隔离区是提高种子质量的前提 隔离区要求空间距离在 300m 以上 , 时间 隔离在 40d 以上 (指春播 , 高秆作物或自然收稿日期 :1997-12-10性 , 使用高界值 (如 A 405=012 完全排除了记 录对照植株是阳性的问题 , 但试验结果中潜 在的错误的阴性结果数量增加。相反 , PCR 和 DHA 的结果在琼脂糖凝胶或放射性自显 影上非常清晰 , 或有一强信号或无信号。在 植株样品试验中只观察到了马铃薯环腐病菌 11054kb PCR 产物用缓冲液接种植株试验 , PCR 或 DHA 都不是阳性。本研究采用的检测方法具有一致性。这 表明绝大多数供试样品获得了明确的试验结 果。通常这些结果是经过重复试验而加以肯 定的。然而 28个样品 (占
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