弓形虫环介导等温扩增快速检测方法的建立_图文

1、弓 形 虫 环 介导 等 温 扩 增快 速检 测 方 法的 建 立李月梅 , 薛书江 , 其木格 , 邢 莹 , 张守发 3(延边大学农学院动物医学系 , 吉林 龙井 133400摘要 :为了建立弓形虫的快速检测方法 , 本研究建立了一种灵敏、 特异 、 快速的分子生物学检测方法 环介导等温扩增技术 (LAMP 。用 10倍系列稀释的 DNA 样品对该检测方法的灵敏度进行了测试 , 同时通过对扩增产物做内切酶验证 ; 为证明 LAMP 技术的特异性 , 对新孢子虫、附 红细胞体、 瑟氏泰勒虫等病原体进行检测。 结果显示 :利用 LAMP 技术成功检测到弓形虫基因区 , 此方法的灵敏度可达到能检

2、测 5个拷贝 DNA 分子水平 , 酶切分析结果正确 , 并且特异性强 , 对新孢子虫 、 附红细胞体、 瑟氏泰勒虫等病原体检测均为阴性。 说明 LAMP 技术可应用于弓形虫 的快速检测 。关键词 :弓形虫 ; 环介导等温扩增技术中图分类号 :S85217 文献标识码 :A 文章编号 :05292 0030D evelop m en ed l am pli f i ca ti on a ss ay fora gondiiL I Yue 2mei, XUE Shu 2jiang, Q IMu 2ge, X I N G Ying, ZHANG Shou 2fa 3(Veterinary Depar

3、t m ent of Agricultural College, Yanbian University, Longjing 133400, China Abstract:I n order t o devel op a rap id and si m p le method f or Toxoplas m a gondii infecti on, a novel l oop 2mediated is other mal amp lificati on (LAMP assay f or T 1gondii was established . Ten serial diluti ons of DN

4、A sa mp le was used t o evaluate the sensitivity of assay, and the accu 2 racy was de monstrated by incisi on enzy me . The pathogens, N eospora, Eperythrozoon and Sergenti, were detected in order t o evaluate the s pe 2 cificity . The result showed that T 1gondii gene could be detected by LAM P, an

5、d the detecti on li m it was 5cop ies . The result of incisi on en 2 zy me was correct . The s pecificity of LAMP assay was good and no amp lificati on p r oduct was found in the sa mp les of N eospora, Eperythrozoon and Sergenti . It suggested LAMP assay was feasible for detecti on of T 1gondii .Ke

6、y words:Toxoplas m a gondii ; l oop 2mediated is other mal a mp lificati on (LAMP 弓形虫 (Toxoplas m a gondii 是一种严重危害人 类及家畜的机会性致病原虫 , 呈世界性分布 , 可侵犯 除成熟红细胞以外的任何有核细胞 , 引起多种组织 、 器官病变和损害 1。对于一般人群 , 弓形虫可引起 慢性隐性感染 2; 对于特殊人群 , 如艾滋病患者 、 妊娠期妇女 、 器官移植者等可引起严重的后果 , 甚至 死亡 3。 弓形虫在畜禽中传播 、流行 , 导致家畜大 批死亡 , 给 畜牧 业造成 重大 的

7、经 济 损 失 4。我 国 中华人民共和国动物防疫法 将其列为多种动物共 患病二类疫病 。环介导等温扩增 (l oop 2mediated is other mal a mp li 2 ficati on, LAMP 反应在等温条件下进行 , 没有核酸 收稿日期 :2009205223作者简介 :李月梅 (19842 , 女 , 硕士研究生。3通讯作者 。 变复性过 程 , 不 但节省 了大 量的时 间 , 又 减少 了 RNA 酶和扩增核酸污染的机会 。更重要的是 , 扩增 反应只有在 4条引物完全与识别的靶序列 6个结合区 匹配的情况下才能顺利进行 , 所有这些特性都在很大 程度上减少了扩

8、增反应的背景 , 从而使检测特异性得 到改善 。1 材料和方法111 材料 B st DNA 聚合酶购自 NE B 公司 ; SY BR Green 购自上海百维信公司 ; 限制性内切酶 B an 为 TaKa 2 Ra 公司产品 ; 弓形虫 GRA3基因序列的质粒 pGEX 2 GRA3、 菌株 BL 221、新孢子虫 、附红细胞体 、瑟氏 泰勒虫病原体由本校预防兽医学实验室保存 。3 Ani m al Husbandry &VeterinaryMedicine 2009 Vol 141 No 111112 引物的设计与合成根据 Gen Bank AF414079中 已 发 表 的

9、弓 形 虫 GRA3致密颗粒蛋白基因序列 , 利用 DNAStar 610进 行引物设计 。 引物包括 F3、 B3、 F I P 、 B I P 4条引物 , 分别识别 6个基因位点 。113 弓形虫 LAMP 检测方法的建立11311 LAMP 反应体系的建立 弓形虫 LAMP 的反应体系为 25L, 各组份的终 浓 度 为 :F3/B3各 012mol/L、 F I P /BI P 各 116mol/L、 d NTP 114mmol/L(each 、 Tris 2HCl 20 mmol/L、 (NH 4 2S O 410mmol/L、 KCl 10mmol/L、 MgS O 46mmol

10、/L、 Trit on X 2100011%、 B st DNA 聚合 酶 8U 、 模板 2L 。将水浴锅温度调至 63 后 , 将 含 LAMP 反应液的 PCR 反应管置于水浴锅内等温扩 增 3060m in, 结束后 80 加热 2m in 。11312 弓形虫 LAMP 检测反应结束后 ,于 115%LAMP 扩 增产 物 中 加 入 1的 SY BR Green 染 料 , 观 察 LAMP 反应液是否发生颜色变化 , 再将 PCR 反应管 置于紫外灯下照射 , 观察是否有强烈的荧光产生 。 114 LAMP 扩增产物的酶切鉴定对 LAMP 扩增产物用限制性内切酶 B an 进行

11、消化 , 水浴消化 4h, 115%琼脂糖凝胶电泳 , 观察结 果 。115 LAMP 的敏感性试验将得到的模板进行 10倍系列稀释成 5到 5×105 5个稀释度 。 用所建立的 LAMP 检测方法和 PCR 检测 方法进行敏感性比对试验 。116 LAMP 的特异性试验抽提新孢子虫 、 附红细胞体 、 瑟氏泰勒虫基因组 DNA , 按照所建立的弓形虫 LAMP 检测方法 , 进行特 异性试验 。2 结果211 LAMP 扩增产物的检测对 弓 形 虫 重 组 质 粒 pGEX 2GRA3样 品 进 行 了 LAMP 检测 , 电泳结果显示条带呈阶梯状分布 , 与理 论结果相符 (图

12、 1 。在加入弓形虫重组质粒 pGEX 2 GRA3样品反应管中加入染料后置紫外灯下照射 , 发 出强烈的绿色荧光 (图 2 。212 LAMP 扩增产物的酶切鉴定用 B an 对 LAMP 产物进行限制性内切酶切分 析 , 酶切产物与 115%浓度的琼脂糖凝胶中电泳 。结 果显示 , 经 B an 酶切 , 得到了 90bp 和 150bp 的 2条特异性条带 , 与预期的大小相符 (图 3 。 213 LAMP 的敏感性试验将得到的模板 10倍系列稀释成 5到 5×105共 1 3畜牧与兽医 2009年 第 41卷 第 11期5个稀释度 。 结果显示 5拷贝以上的稀释度均显示了典

13、型的 LAMP 扩增带型 , 且信号依次递增 。 说明该检 测方法的灵敏度理论上可达到大约 5个拷贝的水平 (图 4 。1. 5个拷贝 2. 51; 3. 5×3DNA LAMP 扩增产物 ; 4. 5×104个拷贝 DNA LAMP 扩增产物 ; 5. 5×106个拷贝 DNA LAMP 扩增产物 ; M. 100bp DNA 标准分子量图 4 LA M P 敏感性试验结果214 LAMP 特异性试验所建立的弓形虫 LAMP 检测方法可以检测出弓形 虫的核酸 。 但将等温扩增时间延长至 2h, 仍不能检 测出新孢子虫 、 附红细胞体 、 瑟氏泰勒虫的核酸 。3

14、讨论环介导等温扩增技术依赖于能够识别靶序列上 6个特异区域的引物和一种具解旋功能且呈瀑布式扩增 的 B st DNA 聚合酶 , 在等温条件下可高效 、 快速 、 特 异地扩增靶序列5。 LAMP 是呈瀑布式扩增 , 扩增效率高 ; 由于 LAMP 识别的是核酸上的 68个特异性 的位点 , 所以其特异性强 ; LAMP 只在 6065 进 行恒温扩增 , 只要水浴锅即可 , 也不需要特殊的仪器 , 因此非常简便 ; 而且由于 LAMP 是恒温扩增 , 不 需要反转录步骤 , 不需要 PCR 仪升降温的时间 , 所 以扩增时间短 。 为了提高检测准确性和检测效率 , 缩 短检测周期 , 本研究

15、建立了检测弓形虫的 LAMP 检测 方法 , 结果显示该方法是一种新型 、 快速 、 实用 、 灵 敏的检测技术 。目前大多数弓形虫病原体的基因检测中都选用保 守区基因 , 本试验选择了 GRA3基因 , 该基因是在基 因保守区内选择的 , 这样就提高了扩增的特异性 。 对于梯度稀释的模板检测结果显示 , 该 LAMP 方法的灵 敏度比普通 PCR 方法高 , 能够检测到 5拷贝的模板 ; 特异性和重复性试验结果表明 , 该方法是可靠的 , 对 于其他的病原体都没有出现非特异 性扩 增 。由 于 LAMP 具有快速 、灵敏 、特异 、简便的特点 , 因此 , 非常适合基层部门和养殖场使用 ,

16、尤 其适 合现 场 检测 。LAMP 技术与 PCR 相比具有以下优点 6-8: 反 应条件简单 , 在一恒温水箱中即可完成 ; 优化步骤 非常简单 , 由于 LAMP 反应体系中起决定作用的是引物浓度 、 dNTP 浓度和 Mg 2+浓度 , 所以只要将这 3个 因素的浓度调至最佳 , 即可实现对 LAMP 的优化 ; 快速高效 , LAMP 在 1h 10910; 6个特异序, ; 结 , , 从 dNTP 析出的焦磷Mg 2+结合 , 产生大量的副 产物焦磷酸镁沉淀 , 肉眼即可直接观察结果 。 总之 , LAMP 是一种便捷 、特异而又灵敏的快速 基因检测技术 , 如果进一步优化 、

17、完善和推广 , 该技 术将会在遗传和传染病的早期诊断及预防控制方面发 挥重要作用 。参考文献 :1 LUfr B J. Toxoplas m a vencephalitis in MDS J .Clin I nf D is,1992, 15(2 :2112222.2 斯特劳 , 阿莱尔 , 蒙加林 , 等 . 猪病学 M.赵德明 , 张中秋 , 沈建 中 , 等 译 . 北 京 :中 国 农 业 大 学 出 版 社 , 2000:6812685.3 Bout D T, Mevelec M N, Velge Roussel F, et al . Pr os pects for ahuman To

18、xoplas m a vaccine J .CurrD rug Targets I m mune Endocr Metabol D is ord, 2002, 2(3 :2272234.4 Hol m gren J, Czerkinsky C . Mucosal i m munity and vaccines J .NatMed, 2005, 11(4 :45253.5 Not om i T, Okaya ma H, Masubuchi H, et al . Loop 2mediated is other 2mal a mp lificati on of DNA J .Nucleic Acids Research, 2000, 28(12 :63.6 Naga m ine K, W atanage K, Ohtsuka K .et al