实时荧光定量PCR具体实验步骤

1、实时荧光定量 PCR 操作步骤以下实验步骤仅供参考：1 样品 RNA 的抽提 取冻存已裂解的细胞，室温放置 5分钟使其完全溶解。 两相别离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中参加0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30 C孵育2到3分钟。4 C下12000rpm 离 心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相 上层。 RNA 全部被分配于水相中。 水相上层的体积大约是匀浆时参加的 TRIZOL 试剂的 60% 。 RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无 RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇 混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30 C孵育10

2、分钟后，于4 C下12000rpm 离心 10 分钟。此时离心前不可见的 RNA 沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉 淀块。 RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中参加至少 1ml的 75%乙醇75%乙醇用DEPCH2O配制，清洗 RNA沉淀。混匀后，4 C下 7000rpm 离心 5 分钟。 RNA枯燥 小心吸去大局部乙醇溶液，使 RNA沉淀在室温空气中枯燥 5-10 分钟。 溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先参加无RNA酶的水40山用枪反复吹打几次， 使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80 C待用。2 RNA 质量检测1 紫外吸收法测定 先用稀释用的 TE 溶液将分光

3、光度计调零。然后取少量 RNA 溶液用 TE 稀释 1:100 后，读取其在分光光度计 260nm 和 280nm 处的吸收值，测定 RNA 溶液 浓度和纯度。 浓度测定A260下读值为1表示40 pg RNA/mI。样品RNA浓度(pg/ml)计算公式为：A260 X稀释倍数X 40 pg/ml。具体计算如下：RNA溶于40 p DEPC水中，取5ul , 1:100稀释至495 p的TE中，测得A260 = 0.21RNA 浓度= 0.21 X100 X40 pg/ml = 840 pg/ml 或 0.84 pg/ pl取5ul用来测量以后，剩余样品 RNA为35 p，剩余RNA总量为：3

4、5 pl X 0.84 pg/ pl = 29.4 pg 纯度检测RNA 溶液的 A260/A280 的比值即为 RNA 纯度，比值范围 1.8 到2.1。2变性琼脂糖凝胶电泳测定 制胶1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60 C，10 ml的10 X MOPS电泳缓冲液和18 ml 的 37% 甲醛溶液 (12.3 M) 。10XMOPS 电泳缓冲液浓度 成分0.4M MOPS， pH 7.00.1M 乙酸钠0.01M EDTA 灌制凝胶板，预留加样孔至少可以参加 25 d溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1 XMOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。 准备 RNA 样品取 3

5、 dgRNA ，加 3 倍体积的甲醛上样染液， 加 EB 于甲醛上样染液中至终浓度为10 dg/ml o加热至70 C孵育15分钟使样品变性。 电泳上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品参加上样孔。5 6V/cm电压下2h，电 泳至溴酚兰指示剂进胶至少2 -3cm o 紫外透射光下观察并拍照28S 和 18S 核糖体 RNA 的带非常亮而浓其大小决定于用于抽提 RNA 的物种 类型 ，上面一条带的密度大约是下面一条带的 2 倍。还有可能观察到一个更小 稍微扩散的带， 它由低分子量的 RNAtRNA 和 5S 核糖体 RNA 组成。在 18S 和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的 EB染色物质

6、，可能是由mRNA和其 它异型 RNA 组成。 RNA 制备过程中如果出现 DNA 污染，将会在 28S 核糖体 RNA 带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带， RNA 的降解表现为 核糖体 RNA 带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。3 样品 cDNA 合成 反响体系序号 反响物 剂量1 逆转录 buffer 2dl2 上游引物 0.2dl3 下游引物 0.2dl4 dNTP 0.1 山5逆转录酶MMLV 0.5山6 DEPC水5山7 RNA模版2讪8总体积10讪轻弹管底将溶液混合， 6000rpm 短暂离心。 混合液在参加逆转录酶 MMLV 之前先70 C干浴3分钟，取出后立即冰

7、水浴 至管内外温度一致，然后加逆转录酶 0.5山,37 C水浴60分钟。 取出后立即95 C干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为 cDNA溶液，保存于 -80 C待用。4梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因B -actin丨实时定量PCR B-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011，反响前取3山按10倍稀释加水27山并充分混匀为1010，依次稀释至109、108、107、106、 105、 104，以备用。 反响体系如下：标准品反响体系序号 反响物 剂量1 SYBR Green 1 染料 10 pl2阳性模板上游引物F 0.5 p3 阳性模板下游引物 R 0.5pl4 dNTP

8、 0.5pl5 Taq酶1讪 6阳性模板DNA 5讪7 ddH 20 32.5 山8总体积50讪轻弹管底将溶液混合， 6000rpm 短暂离心。管家基因反响体系：序号 反响物 剂量1 SYBR Green 1 染料 10 山2内参照上游引物F 0.5 pl3内参照下游引物R 0.5 p4 dNTP 0.5pl5 Taq 酶 1 pl6 待测样品 cDNA 5pl7 ddH 20 32.5pl8 总体积 50pl轻弹管底将溶液混合， 6000rpm 短暂离心。 制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反响条件为：93 C 2分钟，然后93 C 1分钟，55 C 2分钟，共40个循环。5 制备用于绘

9、制梯度稀释标准曲线的 DNA 模板针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进展PCR反响。反响体系：序号 反响物 剂量1 10 X PCR 缓冲液 2.5 ul2 MgCl 2 溶液 1.5 ul3 上游引物 F 0.5 ul4 下游引物 R 0.5 ul5 dNTP 混合液 3 ul6 Taq 聚合酶 1 ul7 cDNA 1 ul8 加水至总体积为 25ul 轻弹管底将溶液混合， 6000rpm 短暂离心。35个PCR循环94 C 1分钟；55 C 1分钟；72 C 1分钟；72oC延伸5分钟。 PCR产物与DNA Ladder在2%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测 P

10、CR 产物是否为单一特异性扩增条带。 将PCR产物进展10倍梯度稀释：将PCR产物进展10倍梯度稀释：设定PCR 产物浓度为1 X1010，依次稀释至109、108、107、106、1o5、104几个浓度梯 度。6 待测样品的待测基因实时定量 PCR所有 cDNA 样品分别配置实时定量 PCR 反响体系。体系配置如下：序号 反响物 剂量1 SYBR Green 1 染料 10 ul2 上游引物 1ul3 下游引物 1ul4 dNTP 1ul5 Taq 聚合酶 2ul6 待测样品 cDNA 5ul7 ddH 2O 30ul8 总体积 50 ul轻弹管底将溶液混合， 6000rpm 短暂离心。将配

11、制好的PCR反响溶液置于Realtime PCR仪上进展PCR扩增反响。反响 条件为：93 C 2分钟预变性，然后按93 C 1分钟，55 C 1分钟，72 C 1分钟， 共40做个循环，最后72 C 7分钟延伸。7 实时定量 PCR 使用引物列表引物设计软件： Primer Premier 5.0 ，并遵循以下原那么：引物与模板的序列严 密互补；引物与引物之间防止形成稳定的二聚体或发夹构造； 引物不在模板的非 目的位点引发 DNA 聚合反响 （即错配）。8 电泳各样品的目的基因和管家基因分别进展 Realtime PCR反响。PCR产物与DNALadder 在 2 琼脂糖凝胶电泳， Gold

12、View ?染色，检测 PCR 产物是否为单一 特异性扩增条带。实时荧光定量 PCR组织RNA提取:一般认为100mg肝组织提取RNA 500ng , 100mg肺提取RNA 200ng ,脑 内的RNA丰度适中，100mg脑组织，提取RNA 5-200ng。所以一个10mg的海 马可匀出RNA约为20ng。反转录反响反转录反响参照TaKaRa RT-PCR说明书。反转录反响条件如下。37 C 15 min 反转录反响85 C 5 sec反转录酶的失活反响Real Time PCR 反响选用脑源神经营养因子BDNF为目标基因，核糖体18S rRNA(18S rRNA)做为内参。基因引物序列扩增

13、片段长度NR2BNR2B(+)CCGCAGCACTATTGAGAACA213 bpNR2B(-ATCCATGTGTAGCCGTAGCC18s18sTTTGTTGGTTTTCGGAACTGA198 bprRNArRNA(+)18sCGTTTATGGTCGGAACTACGArRNA(-1按以下组份配制PCR反响液反响液配制请在冰上进展试剂使用量终浓度?SYBR? Premix Ex Taq TM2 x12.5 山1 xPCR Forward Primer 101山0.4 pMPCR Reverse Primer 10 (JM 1山0.4 pM模板cDNA溶液0.5讪dH2O10山Total25讪全

14、班40人，分为5组，每组做8管。4管做BDNF , 4管做18S rRNA。4管BDNF或者18S rRNA，采用相应的正反PCR引物。每种基因做两个模板，一个模板采 用原液浓度，一个模板采用稀释一倍浓度，体积均为 0.5讪。2三步法PCR首先95 C作用3 minPCR进展35个循环。步骤温度时间变性95 C30秒退火58 C30秒延伸72 C30秒融解曲线温度时间变温速度95 C0秒20 C/ 秒55 C15秒20 C/ 秒95 C0秒0.1 C/ 秒PCR疑难解答当PCR结果不甚满意时，首先检查以下几方面并遵照执行：1将PCR反响的试管与反响板紧贴。2当酶反响混合物以70 C “热启动开

15、场循环时，切记在参加酶后稍3微振荡一下，因为在0.2-ml的PCR管中不能均匀传热。4不要随意减少dNTP的用量，它是一个系统的因素，必须与其它成份保持平衡。5对于有问题的PCR反响，例如模板的量少，模板不纯和环状模板等，先尝试加Taq酶前的体系进展预变性，后加模板进展正常PCR扩增。没有扩增产物：1在提供MgCI2缓冲液中，以0.25mmol/L 为梯度增加MgCI2浓度；无MgCI2 的缓冲液以0.5 mmoI/L为梯度增加MgCI2浓度。2泳道中出现模糊条带，如果DNA模板中存在RNA，那么按上述提示浓度补加MgCI2，因为在PCR反响中可能缺少游离的 Mg2+ 。3检查退火温度和变性条

16、件，如果有需要的话，可降低退火温度。4检查模板和引物的用量。5增加循环次数和/或模板DNA的用量。泳道中出现模糊条带：1减少循环次数或模板DNA的用量2提高退火温度，但不要超过68 C3重新设计引物或设计更长的引物。其他值得注意的条件：1建议使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92 C时不能有效地使模板变性。2最正确反响体积为50ml，推荐用30ml矿物油覆盖对盖子加热的PCR仪可 以不加。3大多数反响中，0.75ml0.51ml的酶量在大多数情况下可以得到满意的结 果。4 建议使用 1.75mmol/L MgCI2: 350mmol/L dNTP 或 2.25mmol/L MgCl2500mmo

17、l/L dNTP 组合的混合物。然而要得到最正确结果，优化 Mg2+的浓度 是必需的。5基因组DNA模板的质量显著影响PCR反响。因此推荐使用琼脂糖凝胶电泳来 检测DNA的长度。DNA片段长度可以超过50kb，传统的基因组DNA能扩增 片段至10kb。6要扩增更长的片段应使用超纯或高分子量的DNA。请查阅高分子量DNA提取操作过程相关文献。7降低二级构造和引物二聚物形成的可能性。进展长片段PCR扩增时，引物长度一般为2434个核苷酸，溶点在6068 C间。使用这类引物可提高 PCR反 响的退火温度来增加反响的特异性。 这点非常重要，长片段扩增的效果往往受到 非特异性短片段优先扩增的影响。8变性

18、：第一步变性在94 C下进展2分钟。在循环过程中尽可能缩短变性时间94 C下进展20-30秒，除非模板中富含 GC,那么95 C下变性30秒。这 可以防止DNA脱嘌啉和链断裂，对于所需扩增的基因组 DNA片段终长度超过 12 kb时，应该尽可能的降低变性温度。9延伸：68-72 C下进展延伸操作。10循环延伸：尽量采用循环延伸的条件，假设 PCR仪无此功能，那么必须增加 延伸的时间，例如在扩增10kb片断时，延伸时间用10分钟替代原来的8分钟。11长片断PCR系统扩增的片断其3-末端带有一个突出的 A，因此建议采用 T/A克隆。假设要进展平端可隆，可用 Klenow酶和T4 DNA多聚酶将PC

19、R产 物补平后再进展。12测序时因酶的混合物带有3 5 外切酶活性，用San ger方法进展测序不 能产生均一的染色体带型。13在无菌的0.5ml或0.2ml离心管中按以下操作程序加样：14反响物加样顺序体积(pl)终浓度去离子水1 29.4 10 XBuffer B 2 5 1 X10 XPCR Buffer 成分：Tris-HCl pH8.5 100 mMKCl500 mMMgCI15 mM4 XdNTP 混合物 3 5 各 200 pmol/LMgCl 24 3 1.5mmol/L有义引物 5 2.6 0.25 ymol/L反义引物 6 2.6 0.25 ymol/L模板7 2 0.1他

20、TaqDNA 聚合酶 8 0.4 1unit2. 用微量可调加样器和一次性 Tip向每一管中加50山矿物油。每加一管换一次Tip。3. 振荡每只管，然后短暂离心。4. 将管放到预热的热循环中，按以下程序开场循环：预变性94 C 4分钟1次变性94 C 1分钟退火37-65 C 1分钟延伸72 C 1分钟循环 30 次终延伸72 C 7分钟1次保存4C讨论1. 假阴性，不出现扩增条带PCR反响的关键环节有模板核酸的制备，引物的质量与特异性，酶的质量，PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进展分析研究模板：模板中含有Taq酶抑制剂，在提取制备模板时丧失过多，或吸 入酚。模板核酸变性不彻底。在酶和

21、引物质量好时，不出现扩增带，有可能是 模板核酸提取过程出了毛病，可使用阳性对照的 DNA 模板配合检查模板质量。酶失活：需更换新酶， 或新旧两种酶同时使用， 以分析是否因酶的活性丧失 或不够而导致假阴性。引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是 PCR 失败或 扩增条带不理想、 容易弥散的常见原因。 有些批号的引物合成质量有问题， 两条 引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个 好的引物合成单位。 引物的浓度不仅要看 OD 值，更要注重引物原液做琼脂糖 凝胶电泳， 一定要有引物条带出现， 而且两引物带的亮度应大体一致， 如一条引 物有条带，一条引物无条

22、带，此时做 PCR 有可能失败，应和引物合成单位协商 解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。引物应 高浓度小量分装保存， 防止屡次冻融或长期放冰箱冷藏， 导致引物变质降解失效。 引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。Mg 2+浓度:Mg 2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR 扩增的特异性，浓度过低那么影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩 增条带。反响体积的改变：通常进展 PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul、或 100ul，应用多大体积进展PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定， 在做小体积如 20u

23、l 后，再做大体积时，一定要模索条件，否那么容易失败。物理原因：变性对 PCR 扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间短， 极有可能出现假阴性；退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率， 退火温度过高影响引物与模板的结合而降低 PCR扩增效率。有时还有必要用标 准的温度计，检测一下 扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR 失败的原因之一。靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序 列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其 PCR扩增是不会成功的。2. 假阳性出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。引物设计不适宜：

24、选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性， 因而在进展PCR扩增 时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新设计引物。靶序列或扩增产物的穿插污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段 的穿插污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔， 防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。 除酶及不能耐高温的物质外，所 有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要 时，在加标本前，反响管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中 的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接， 与引物互补后

25、，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式 PCR方法来减轻或消除3. 出现非特异性扩增带PCR 扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性 扩增带与非特异性扩增带。 非特异性条带的出现， 其原因： 一是引物与靶序列不 完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是 Mg 2+ 离子浓度过高、退火温度过低， 及 PCR 循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特 异条带而另一来源的酶那么不出现， 酶量过多有时也会出现非特异性扩增。 其对 策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量， 适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采

26、用二温度点法（93 C变性，65 C左右退火与延伸）。4. 出现片状拖带或涂抹带PCR 扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多 或酶的质量 差， dNTP 浓度过高， Mg 2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过 多引起。其对策有：减少酶量，或调换另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓度。增加模板量，减少循环次数。PCR技术类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补 的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个根本反响步骤构成：模板DNA 的变性：模板DNA经加热至93 C左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR 扩增形成的双链 DNA 解

27、离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反响作 准备；模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温 度降至55 C左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸:DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反响原料，靶序列为模板， 按碱基配对与半保存复制原理， 合成一条新的与模板 DNA 链互补 的半保存复制链重复循环变性 -退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保存复 制链，而且这种新链又可成为下次循环的模板。 每完成一个循环需24分钟， 23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。至U达平台期 (Plateau)所需循 环次数取决于样品中模

28、板的拷贝。PCR的三个反响步骤反复进展，使DNA扩增量呈指数上升。反响最终的DNA 扩增量可用丫二(1 + X)n计算。丫代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y) 均每次的扩增效率， n 代表循环次数。平均扩增效率的理论值为 100% ，但在实 际反响中平均效率达不至理论值。反响初期，靶序列 DNA 片段的增加呈指数形 式，随着 PCR 产物的逐渐积累，被扩增的 DNA 片段不再呈指数增加，而进入 线性增长期或静止期，即出现“停滞效应，这种效应称平台期数、 PCR 扩增 效率及 DNA 聚合酶 PCR 的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数 情况下，平台期的至来是不可防止的。PCR

29、 扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两局部。短产物片段的长度严 格地限定在两个引物链 5端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产 物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的， 以一个原始模板为例， 在第一 个反响周期中，以两条互补的 DNA 为模板，引物是从 3端开场延伸，其 5 端是固定的， 3端那么没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段。 进入第二周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链 (即“长产物片 段)结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段 3端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于 引物扩增序列以内、形成长短一

30、致的“短产物片段。不难看出“短产物片段 是按指数倍数增加， 而“长产物片段那么以算术倍数增加， 几乎可以忽略不计， 这使得 PCR 的反响产物不需要再纯化，就能保证足够纯 DNA 片段供分析与检 测用。基因表达谱基因表达谱 (gene expression profile) ：指通过构建处于某一特定状态下的 细胞或组织的非偏性 cDNA 文库 ,大规模 cDNA 测序,收集 cDNA 序列片段、定 性、定量分析其 mRNA 群体组成 ,从而描绘该特定细胞或组织在特定状态下的基 因表达种类和丰度信息 ,这样编制成的数据表就称为基因表达谱基因表达谱的获得与表示在基因芯片的实验中， 首先选取来自不同

31、状态的样本， 如正常组织与肿瘤组 织、不同发育阶段组织， 或用药前后的细胞或组织等。 其中一种被称为实验样本， 另一种就是相应地被称为参考样本。实验样本和参考样本 mRNA 在逆转录过程 中，分别用不同的红、绿荧光基团标记，并将它们混合，与微阵列上的探针序列 进展杂交， 经过适当的洗脱步骤后， 用激光扫描仪对芯片进展扫描， 获得对应于 每种荧光的荧光强度图像， 通过专用的图像分析软件， 可获得微阵列上每个点的 红、绿荧光强度Cy5和Cy3，其比值Cy5/Cy3丨称为该基因在实验样本中 的表达水平。Step1 ：基因芯片的制备。在硅胶、玻璃片、聚丙烯或尼龙膜等载体上按特 定的排列方式固定大量的探

32、针，形成 DNA 芯片。芯片种类较多，制备方法也不 尽一样，根本上可以分为两大类：原位合成和直接点样法。Step2 ：荧光标记探针的制备。将待分析的基因探针在芯片杂交之前进展纯 化、逆转录或扩增级荧光标记。 最普遍的荧光标记法是用 Cye3-dUTP（ 绿色荧光 ） 标记对照样本， Cye5-dUTP（ 红色荧光 ）标记实验室样本。Step3 ：标记探针与芯片杂交。选择杂交条件，将制备的荧光探针与芯片进 展杂交，一定时间以后，洗去未结合探针，然后进展荧光信号的扫描与分析。Step4 ：杂交芯片的扫描。杂交后的芯片用特定波长的激光进展激发，此时 芯片上的探针会发出不同波长的荧光。用共聚焦激光扫描

33、仪检测探针的荧光强 度，可以得到Cy5和Cy3的两幅单色图像。分别对这两幅图像进展伪色彩处理， 然后叠加称为一幅图像，这就是实验所得到的原始数据杂交图像。图像中 样点的荧光强度值间接给出了基因芯片中对应探针的相对丰度值。 如果来自测试 样本的表达丰度高， 那么样点呈红色； 如果来自参考细胞样本的表达丰度高， 那 么样点呈绿色； 如果两者丰度相当， 样点就呈黄色；如果二者没有进展杂交反响， 那么样点保持背景黑色不变。 通过这种方法， 取自两个不同样本的基因相对表达 水平差异就可以表现出来。Step5 ：将基因表达谱数据从杂交图像中提取出来，即将原始杂交图像转化 为基因表达谱数据。研究意义肿瘤在组

34、织形态学上被划分为多种不同的类型和亚型， 而肿瘤亚型的准确诊 断对肿瘤的临床治疗具有重要意义， 然而肿瘤的分型在临床上一直处于难以处理 的状态，许多形态学上相似的肿瘤， 如白血病的许多亚型等都会有相似的临床病 症，但却需要不同的治疗方法，从分子生物学的角度上看 ，肿瘤是由于某些染 色体上 DNA 损伤致使细胞内基因异常表达，导致细胞生长失控、缺乏分化和异 常增生的一类复杂基因疾病。 正因为肿瘤开展机制的复杂性， 100 多年来的研究 仍未揭开其中的奥秘。 研究肿瘤基因表达谱、 选取信息基因是从信息学角度出发 以寻找肿瘤相关基因、 发现肿瘤基因表达特征的直接手段。 肿瘤基因表达谱数据 显著特点是

35、样本的位数高而样本很小、 噪声冗余大而信息基因少。 每个样本都记 录了组织细胞中所有可测基因的表达水平， 但实际上只有少数基因才真正同样本 类别相关， 它包含了样本分类的信息。 信息基因选取问题是肿瘤基因表达谱分析 的核心内容。 它既是建立有效分类模型的关键， 也是发现肿瘤分类与分型的基因 标记物以及药物治疗潜在靶点的重要手段， 目前人们对该问题已进展了一定程度 的探索。然而，如何在基因表达谱的成千上万个基因中有效选出样本的分类特征， 一直是肿瘤基因表达谱分析中的难点所在，这个问题仍有待深入研究。当前的肿瘤分类技术高度依赖病理学工作者对肿瘤组织的主观判断， 而基于 微阵列技术， 即使一些组织没

36、有显著变化， 利用基因表达谱也能够对之做出早期 诊断；基于基于基因表达谱的肿瘤分型和分类研究为理解肿瘤的发生的机制， 以 及肿瘤的临床治疗提供了重要依据； 研究人员可以根据基因表达谱的变化来区分 形态学上相似的肿瘤， 而肿瘤类型的准确诊断将有助于制定配套的最正确治疗方表达谱基因芯片实验操作流程一、试剂1. TRIzol2. 异丙醇3. 氯仿4. 75% 乙醇 RNase-free 5. Milli-Q 水 RNase-free 6. 无水乙醇7. dNTPs8. Cy5-dCTP 和 Cy3-dCTP9. 杂交试剂 110. 标记试剂 I11. 杂交试剂 212.标记试剂 II13.反转录酶1

37、4.标记试剂 III15.反转录引物16.洗片试剂 117.反转录酶缓冲液18.洗片试剂 219.DTT20.洗片试剂 3*试剂720为产品芯片杂交试剂盒中的组分二、仪器与设备1. 电动玻璃匀浆机2.电子天平3.低温高速离心机4.低温高速台式离心机5.超净工作台6.制冰机7.电热恒温水槽8.电泳槽9.电泳仪10.微波炉11. 凝胶成像仪12.台式离心机13.核酸定量分析仪14.移液枪15.可调电炉16.旋涡混合器17.杂交箱18.杂交舱19.S-200 纯化柱20.真空浓缩仪21.盖玻片22.芯片扫描仪三、总 RNA 提取1）将超低温保存的样品除去样品袋， 在电子天平上称重后， 转移至用液氮预

38、冷的 碾钵中，用杵子碾磨组织，其间不断参加液氮，直至碾磨成粉末状。2）将碾磨成粉末状的样品，转移至已经参加适量 TRIzol 试剂的匀浆管中， 把匀浆管置于冰浴中， 在组织匀浆粉碎机上进展匀浆。 匀浆至匀浆液不粘且无颗 粒即可。3）将匀浆液转移至15ml离心管中，于4C, 12000g，离心10min 。4）小心吸取上清液转入新的15ml离心管，在1530 C放置5min 。5）向匀浆液中参加氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管，在1530 C放置 3min 。6）于 4C， 12000g ，离心 15min 。7）从离心机中小心地取出离心管，吸取上清至另一 15ml 离心管。8）向上清参加异丙

39、醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，在1530 C放置10min 。9）于 4 C, 12000g，离心 10min。10）弃去上清，缓慢地沿管壁参加 75%乙醇 5ml ，轻轻颠倒洗涤离心管管壁， 小心弃去乙醇。11）再参加 75%乙醇 10ml ，在涡旋器上短暂涡旋；于 4C， 8000g 离心 10min 。12）小心弃上清，短暂离心，用移液枪吸去所有上清，在超净工作台中枯燥 沉淀 5min 。13）参加RNase-free的Milli-Q 水完全溶解RNA沉淀后，-80 C保存。四、探针标记与杂交1 、预杂交1）配制预杂交液：杂交试剂 1 参加到的 Eppenderf 管中，振荡混匀后，参

40、加杂 交试剂 2 混匀。2）将配制好的预杂交液放入95 C水浴锅内变性2min ,将待预杂交的玻片放 入95 C水浴锅内变性30sec，玻片取出后即放入无水乙醇中 30sec，晾干。3）将已变性的预杂交液加到玻片的点样区域内，盖上盖玻片， 放入杂交箱内42 C预杂交56hr。2、标记探针以下在冰浴中进展1）于一已灭菌的1.5mlEppendorf 管内依次参加以下试剂反响终体积为50讪， 以下试剂均为 RNase-free ：ddH20 23 讪逆转录引物5 pl总 RNA50 100 p振荡混匀，置于70 C水浴10min。取出后，迅速置于冰上。2）分别参加以下试剂：逆转录酶缓冲液 10pl

41、DTT5pldNTPs4 pl3）而后在暗室中参加以下试剂：逆转录酶 2plCy5-dCTP 或 Cy3-dCTP 3 pl4）用手指弹打管壁以混匀样品，手浴 2min。将Eppendof 管置于42 C水 浴 2hr 。5）依次在Eppendof 管中参加标记试剂I 4讪,65 C水浴10min后参加标记试剂II 4讪。混匀，合并对照组、实验组。避光，真空抽干至50 p左右。6）使用 DNA 纯化柱或乙醇沉淀纯化 DNA 。7）将柱体在旋涡混合器上剧烈振荡摇匀，悬浮内溶的树脂。 将柱顶端的小帽旋松四分之一圈，掰断柱下端的密封头。8）将柱置于一个 1.5ml 的 Eppendorf 管中，以

42、3000rpm 离心 1min 将柱 置于另一个新的 1.5ml Eppendorf 管中，去掉顶端的帽，将样品慢慢加到树脂 上外表的中间，注意不要搅动柱体。以 3000rpm 离心 2min ，经纯化的样品流 出，被收集在支持用的 Eppendorf 管中9）参加标记试剂III 8山，真空抽干。3、杂交1）在抽干的探针管中加6.5讪杂交试剂I，充分混匀，使探针溶解。再参加6.5 d 杂交试剂II，混匀备用。2）将预杂交的玻片取出，用 ddH2O 冲去盖玻片。3）将探针置于95 C水浴中变性2min ;玻片置于95 C水浴中变性30sec， 玻片取出浸无水乙醇30sec，探针取出后迅速置于冰上

43、。4）将探针置于芯片上，用盖玻片覆盖，置于杂交舱中，用Parafilm 密封，放入42 C杂交箱内杂交过夜1618h丨。4、洗片1）用 0.5%的洗涤液 1 冲洗玻片，去除盖玻片。2）准备两个染色缸， 分别装有 0.5%的洗片试剂 1+2% 的洗片试剂 2、5%的 洗片试剂3，放入60 C水浴锅中。3）将玻片依次浸入以上两个染色缸中洗涤10min 。4）用 0.5%的洗涤液 1 冲洗玻片，晾干后扫描。基因芯片技术原理及其在表达谱中的应用摘要：基因芯片Gene chip，又称DNA芯片DNA chip丨或cDNA微矩 阵cDNA Microarray ，是利用光刻合成、高速打印或电定位等技术在硅、玻璃或尼龙膜上按照特定的排列方式固定有大量