显微技术作业课后作业C

1、生物电子显微技术作业 课后作业C1. 简述超高压电子显微镜的优点，以及切片与普通超薄切片的不同 。答：超高压电镜不但分辨率高、单色性好，而且电子穿透力强，对材料的损伤较小，可以观察较厚的材料(0.5-10m)，场深大，成像有立体感，而且不会影响分辨率 。主要用于观测材料、矿物、生物样品、器件透射电子显微象及电子衍射图，对样品微观组织、结构、缺陷等定性、定量分析。 可对样品在加热、拉伸、电子辐照等条件下微观组织的变化过程进行动态观测。一般透射电镜观察样品时，电子束无法穿过 0.1 m m 以上的切片，所以需将样品切成 5070nm 的薄片才能观察。与光镜观察的 37 m m 切片对比而言，常将透

2、射电镜的切片称为超薄切片。用于超高压电镜的厚切片制备与普通超薄切片相似，只是有一些特殊要求:其切片材料的制备与普通电镜有所不同。样品块要相对软一些，以保护刀口和便于制作连续切片。覆盖的支持膜要厚，并喷碳加固，以抗高压电子轰击。选用折叠式载网或单缝载网，以防切片脱落和阻挡视野。采用浸没法染色，并适当延长染色时间。包埋前可先进行整体染色。 2.比较透射电镜与扫描电镜在观察效果和研究用途上的不同？它们各自的优缺点是什么？透射电镜扫描电镜观察效果电子显微镜是使用电子来展示物件的内部或表面的显微镜。高速的电子的波长比可见光的波长短（波粒二象性），而显微镜的分辨率受其使用的波长的限制，因此电子显微镜的理论

3、分辨率（约0.1纳米）远高于光学显微镜的分辨率（约200纳米）。分辨率为0.10.2nm，放大倍数为几万几十万倍它能够直接观察直径100mm，高50mm，或更大尺寸的试样，对试样的形状没有任何限制，粗糙表面也能观察，这便免除了制备样品的麻烦，而且能真实观察试样本身物质成分不同的衬度（背反射电子象）。分辨率可达3-10nm,放大倍数可达10万倍研究用途用以观察为亚显微结构或超微结构。观察样品形貌、原位分析样品的晶体结构主要是用来观察物体表面超微形态,适合观察固态的生物材料,也可以观察生物材料断面或剥蚀面的结构（亚细胞形态），不过需要预先进行切割或蚀刻处理。有时甚至也可进行细胞化学标记物的形态观察

4、。由于具有很高的分辨率，多以被广泛用于观察纳米材料。优点1.制样过程对芯片内部结构影响较小2.透射电子穿过样品内部，同样品内部的所有东西发生相互作用，从而直接获得内部结构信息，因此得到综合的高分辨率结果3.易于调整，通过改变线圈中流过电流的强度，可以改变磁场强度，达到变化折 射率和焦距的目的4.像差较小，且较为容易消除或校正5.对电子束流的能量损耗小 1.具有很高的分辨率2.制样方便，制样周期短，有时可以作非破坏性的分析3.观察范围大，倍率变化大，立体感强，景深大，观察效果好缺点1. 结构复杂，对制作材料的纯度、元件几何形状尺寸的加工精密度等都要 求极高2. 制样的技术难度大，观察点的定位难，

5、有时需借用聚焦离子束刻蚀才能完成3.分析周期长4.成本较高1.只能在样品表面扫描，信号来自样品表面，不能获得样品内比较深的部位的情况2.显微像一般不包含结构信号，不能区分单晶、多晶、非晶，不能区分位错、层错、晶界等3.不适合厚度在微米以下的薄膜的分析需求3.采用低温处理制作电镜样品的优缺点是什么？优点缺点1.固定形态和结构，且固化结构使之易于进一步处理2.在保存生物活性的基础上储存生物材料3.在制作冷冻超薄切片时，不需经化学药剂固定、脱水、过渡、聚合等，减少了处理过程造成的阎像低温处理依旧不能解决永久活体，并且制作过程容易产生冷冻损伤和干燥损伤。并且切片太厚，不能做连续切片，并且容易破碎。4.

6、为什么要采用临界点干燥来处理扫描电镜样品？哪些材料不用临界点干燥来处理也能获得满意的图像？答：临界点干燥就是利用物质在临界状态下，液体表面张力消除的特性，克服样品干燥过程中所发生的变形，保持样品原状，达到干燥的目的。其原理是在一定的温度和压力下，物质的液态和气态界面将会消失，液态瞬间转化为气态，形成非液非固的状态，即达到临界点（C.P）状态。在临界点时，表面张力消失，分子间的内聚力等于零，因此，利用临界点状态对材料进行干燥，材料理论上不会产生收缩和形变，对于质地较软的材料这种方法是最好的干燥方法。所以说，对于比较坚硬的材料，及时不使用临界点干燥法也可以实现较好的图像观察。5. 查找采用了低温制

7、样技术的研究文献，搜集精美图片，分析这些工作的技术难点和发表图片的质量。 答：技术难点：1、冰晶 冰晶是组织在冷冻固化过程中, 由于冷冻缓慢, 冷冻时间过长, 使细胞质和组织间隙内未结合的水逐渐析出形成解决办法: 取材大小、厚薄要适宜, 过大过厚影响冷冻速度。 2、组织挤压、皱缩。常见于组织结构软硬不同的组织，如皮肤。解决方法：将表皮面放在标本的上端, 先切较软的皮下组织, 依次切真皮、表皮, 同时用毛笔轻轻展开, 或用抗卷板才能切出完整的切片3、冷冻切片一般不会脱片, 偶见于坏死组织或含水量大的组织, 如子宫肌瘤黏液变性时。解决方法: 首先切片不能太厚, 其次切片固定后用吹风机吹干再染色。4

8、、 甲状腺等有腔洞的组织，组织冷冻过头, 使之发脆就会破碎形成空洞, 这时可用手贴在组织上或用嘴向组织哈气稍加温使其软化即可切出完整的切片。5、组织贴附不平或者有皱褶 切片切好后用载玻片贴片时手不能颤抖, 而且在贴附组织时手要有一个向下伸展的动作。 文献一 密方元,李凤山,马邦磊,钱宁.冷冻切片5m in快速制片染色法. 临床与实验病理学杂志，2009，Oct25. 图 1 A进口OCT包埋的腮腺混合瘤冷冻切片 B 胶片包埋的腮腺混合瘤冷冻切片图2 肾粗针穿刺小标本, 先制成冷冻 图3 脂肪组织冷冻切片, 脂肪细胞组织结构平后做冷冻切片, 保持了组织保持完整，细胞边界清晰，染色鲜艳 图4 甲状

9、腺组织, HE 染色前未经二 图 5甲状腺组织, H E 染色前经二甲苯脱脂甲苯脱脂处理, 胞核较模糊 处理后，胞核、质结构清晰、透明 我认为这几张图片比较好，清晰，甲状腺组织切片中破碎形成空洞，染色很均匀。 文献二 胥维勇，杨红，李科，杨群.介绍一种FAAPT冷冻切片快速固定液.临床与实验病理学杂志.2002Apr;18摘要手术中冷冻切片的病理诊断是根据冷冻切片组织学形态来进行,以确定病变组织的良恶性为目的。制作冷冻切片包括制片、固定、染色三个环节,在冷冻切片中固定液的选择是不可忽视的一个因素。我们在工作中经反复试验在众多固定液中选择FAA液( 福尔马林- 醋酸- 乙醇), 经改良配成一种适合于冷冻切片