标准应用方法-水溶性维生素的检测方法(20130319)

1、饲料添加剂中七种水溶性维生素的检测1. 摘要 应用HALO柱，建立一种用反相高效液相色谱测定饲料添加剂中7种水溶性维生素的分析方法。方法采用HALO C18色谱柱（4.6×50 mm，2.7 m），以乙腈磷酸二氢钠缓冲溶液（pH=6.2）为流动相进行梯度洗脱，流速1.5 mL/min，检测波长200 nm，7种水溶性维生素在5 min内完成分离检测。测得维生素的检测限介于0.5×10-9 g/mL1.0×10-8 g/mL之间(S/N>2)。回收率91%-115%。这一方法操作简便快速、准确可靠，适用于饲料中水溶维生素的测定。2. 关键词 反相高效液相色谱；

2、水溶性维生素；HALO柱。3. 范围本方法适用于饲料中水溶维生素的检测。本方法适用于高效液相色谱法分析水溶性维生素。本方法可测定7种维生素，包括烟酸、叶酸、维生素B1、维生素B2、维生素B5、维生素B6、维生素B12。本方法测定各维生素最低检测限不高于1×10-8 g/mL。4. 规范性引用文件 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法。5. 定义5.1 维生素维生素又名维他命，通俗来讲，即维持生命的物质，是维持生物体生命活动必须的一类有机物质，也是保持生物体健康的重要活性物质。维生素在体内的含量很少，但不可或缺。各种维生素的化学结构以及性质不同。维生素是个庞大的家族，目前所

3、知的维生素就有几十种，大致可分为脂溶性和水溶性两大类。6. 原理 样品经提取后，用反相高效液相色谱进行色谱分析，采用外标法定量。7. 试剂与材料 除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。7.1乙腈：色谱纯7.2磷酸二氢钠：分析纯7.3磷酸氢二钠：分析纯7.420 mM磷酸二氢钠缓冲溶液（pH=6.2）：精密称取磷酸二氢钠（NaH2PO4·12H2O） 0.6625 g，磷酸氢二钠（Na2HPO4·2H2O）1.9070 g完全溶于500 mL水，以0.22 um水系滤膜过滤即得。7.5 标准品：烟酸、叶酸、维生素B1、维生素B2、维生素B5、维

4、生素B6、维生素B12，纯度均大于等于98%。7.6 5种维生素标准储备液：分别称取烟酸 10.0 mg、维生素B1 50.0 mg、维生素B5 20.0 mg、维生素B6 50.0 mg、维生素B12 100.0 mg标准品，分别置于100 mL棕色容量瓶中，加纯水溶解并定容即为水溶性维生素的标准品储备溶液，低温保存。7.7 维生素B2标准储备液：称取维生素B2标准品50.0 mg，置于洁净小烧杯中，加500 ul冰乙酸，补加少量纯水，沸水浴至完全溶解后冷却至室温，移至100 mL棕色容量瓶中。以纯水定容至100 mL即为维生素B2的标准储备溶液，低温保存。7.8 叶酸标准储备液：称取叶酸标

5、准品10 mg置于洁净小烧杯中，加0.10 mol/L磷酸氢二钠溶液10 ml溶解后移至100 mL棕色容量瓶中，以纯水定容至100 mL即为叶酸标准储备液，低温保存。7.9 7种维生素混合标准溶液：分别精确量取烟酸标准储备液2.0 mL、叶酸标准储备液2.0 mL、维生素B1标准储备液0.8 mL、维生素B2标准储备液2.0 mL、维生素B5标准储备液2.0 mL、维生素B6标准储备液0.8 mL、维生素B12标准储备液0.4 mL 置于10 mL容量瓶中混匀，即为7种维生素标准溶液。7.9 微孔滤膜：0.22 m水系7.10 微孔滤膜：0.22 m有机系8. 仪器与设备8.1 EasySe

6、pTM -1020型高效液相色谱仪（上海通微分析技术有限公司）8.2 FA1004型电子天平：感量0.1 mg8.3 AS5150A型超声波水浴（奥特赛恩斯仪器有限公司）8.4 AP-01型真空抽滤装置（奥特赛恩斯仪器有限公司）9. 高效液相色谱测定9.1 推荐色谱条件a) 色谱柱：HALO C18，2.7 m，4.6×50 mmb) 流动相：溶剂A：20mM磷酸二氢钠水溶液（pH=6.2）；溶剂B：乙腈c) 梯度洗脱：梯度条件见表1d) 流速：1.5 mL/mine) 检测波长：200 nmf) 进样量：20 L表1. 梯度条件时间（min）055.01A%10022100B%07

7、80表2. 七种维生素的基本分离情况序号组分名称保留时间（min）拖尾因子分离度R（与下一峰）1烟酸0.651.556.512维生素B51.221.181.883维生素B61.621.395.534维生素B12.121.735.425叶酸2.791.4627.126维生素B124.631.422.867维生素B24.831.369.2 标准曲线和检测限吸取7种维生素混合标准储备液5.0mL、1.0mL、0.5 mL、0.05mL，用纯水定容至10 mL，取各稀释液及储备液原液进行测试。以各维生素标准品浓度与对应维生素色谱峰面积绘制标准曲线。以信噪比S/N>2方法计算维生素的检测限。表3.

8、 7种水溶性维生素的线性回归方程、相关系数、线性范围和检测限序号组分名称线性方程Regression equation相关系数(r)线性范围Linear rang（µg/mL）检测限LOD(ng/mL)1烟酸y = 256400x + 292080.99980.1-20.00.62维生素B5y = 21388x + 4257.60.99940.240.08.73维生素B6y = 81588x - 1838.70.99990.240.03.04维生素B1y = 47513x + 7999.80.99990.240.04.05叶酸y = 97340x - 3152.60.99990.1-

9、20.01.26维生素B12y = 86630x + 192450.99980.240.01.37维生素B2y = 126027x + 8333.71.00000.05-10.00.69.3 精密度实验吸取7种维生素混合标准储备液5.0mL用纯水定容至10 mL，按照实验条件连续进样6针，计算各维生素的保留时间RSD6和峰面积RSD6。表4. 7种维生素的精密度实验序号组分名称保留时间RSD（n=6，%）峰面积RSD（n=6，%）1烟酸0.6760.1996742维生素B51.3890.4868373维生素B61.84540.2633094维生素B11.9410.3280425叶酸0.9922

10、1.3980716维生素B120.5420.2241777维生素B20.5790.524411备注：由于样品保留时间极短，微弱的保留时间差异也会严重影响保留时间的重现性。9.4 回收率实验取某样品处理液三份，分别添加等体积各维生素标准品5ug/ml，作为样品进行分析测试，计算回收率。结果如下：表5 7种维生素的加样回收率实验结果序号组分名称第一组回收率第二组回收率第三组回收率1烟酸115%92932维生素B5951031023维生素B6103101954维生素B1951041015叶酸99931086维生素B1210299987维生素B21109991备注：各样品回收率介于91%至115%之间

11、。10 定量测定 按外标法使用标准曲线进行定量测定。以峰面积计算供试样品中各维生素含量。待测样液中各维生素的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围则应稀释后再进样分析。附录A安全注意事项1环境要求1.1仪器工作室温为常温，相对湿度30%85%。1.2室内不得存放腐蚀性气体、液体和易燃易爆物，防止振动和强光直射，应通风良好。2安全事项2.1电源应良好接地，仪器应有单独接地线。2.2应在通风橱内使用有毒、易燃易爆的有机溶剂和试剂。2.3废弃流动相应专门处理。附录B（资料性附录）维生素标准品色谱图（1）烟酸、（2）维生素B5、（3）维生素B6、（4）维生素B1、（5）叶酸、（6）维生素B12、（

12、7）维生素B2附录C水溶性维生素分析方法包配置清单序号名称品种或规格备注1维生素分析专用色谱柱HALO，C18色谱柱（2.7m，4.6 mm×50 mm）2维生素标准品（混标，7种）2×10-5 g/mL，4×10-5 g/mL（5mL,10mL）饲料专用3维生素标准品（单标，7种）浓度同储备液饲料专用；4固体缓冲盐标准包磷酸二氢钠（NaH2PO4·12H2O） 0.6625 g，磷酸氢二钠（Na2HPO4·2H2O）1.9070 g可配制缓冲液500mL附录D水溶性维生素检测方法注意事项（1） 本方法包所提供标准品溶液需避光密闭保存，储备液保存于4冰箱内，开封后保质期为一周，稀释液配制后当天使用。（2） 本分析方法所用体系中含有缓冲盐，每日使用后色谱柱应需用20%的甲醇水溶液对液相泵、色谱柱及管路系统进行清洗。（3） 色谱柱如需长期保存应在使用20%甲醇清洗10分钟后再用纯甲醇清洗10分钟以上，两端以色谱柱堵头封闭后保存。（4） 本分析方法要求实验用水洁净，需满足分析实验室用水要求。（5） 本分析方法要求高压