第2章氨基酸与蛋白质的一级结构

1、第一节：氨基酸，第一节：氨基酸，2.5学时学时第二节：氨基酸的分离分析，第二节：氨基酸的分离分析，0.5学时学时第三节：肽和蛋白质，第三节：肽和蛋白质，0.5学时学时第四节：蛋白的分离，第四节：蛋白的分离，0.5学时学时第五节：一级结构测定，第五节：一级结构测定，1学时学时蛋白质种类与功能的多样性蛋白质种类与功能的多样性 1010-1012结构蛋白贮藏蛋白收缩蛋白转运蛋白l180180多种天然多种天然AAAA，大多数是不参与蛋白质组，大多数是不参与蛋白质组成的。这些成的。这些AAAA被称为非蛋白质被称为非蛋白质AAAA。l参与蛋白质组成的参与蛋白质组成的AAAA为为蛋白质蛋白质AAAA，常见的

2、常见的只有只有2020种种 基本氨基酸，标准氨基酸基本氨基酸，标准氨基酸l 表达方式：表达方式：三字母三字母或或单字母的简写符号单字母的简写符号l除脯氨酸外，其他除脯氨酸外，其他1919种均具有如下结构通式。种均具有如下结构通式。各种氨基酸的区别在于侧链各种氨基酸的区别在于侧链R R基基的不同。的不同。 -氨基酸氨基酸可变部分可变部分不变部分不变部分COOHCHH2NR一、基本氨基酸1, 1, 按按侧链侧链R R基的化学结构基的化学结构，分为三类，分为三类l脂肪族氨基酸脂肪族氨基酸15种种C2:1 C3:3 C4:3 C5:4 C6:4l芳香族氨基酸芳香族氨基酸3种种l杂环族氨基酸杂环族氨基酸

3、2种种GlyAlaValLeuIlePheTyrTrpCysMetSS氨基酸氨基酸的的R R基大小基大小l分为分为4 4类：类：l非极性氨基酸：非极性氨基酸：9 9l 极性不解离：极性不解离：6 6l极性氨基酸极性氨基酸 解离带负电荷：解离带负电荷：2 2酸性酸性l 极性解离极性解离l 解离带正电荷：解离带正电荷：3 3碱性碱性lPOLARNON-POLARTyrHisGly酸性酸性中性中性BasicAspGluGlnCysAsn SerThrLysArgAlaValIleLeuMetPheTrpPro氨基酸的极性分类氨基酸的极性分类极极性或非性或非极极性，是性，是影响影响蛋白蛋白质结构与性质

4、的关键质结构与性质的关键-+SS有大有小有正有负有极性非极性 形形色色的氨基酸側基 l含硫氨基酸含硫氨基酸l含羟基氨基酸含羟基氨基酸l-C-C带分支氨基酸带分支氨基酸l二羧基一氨基氨基酸二羧基一氨基氨基酸l二氨基一羧基氨基酸二氨基一羧基氨基酸l亚氨基酸亚氨基酸COOHCHH2NR除甘氨酸外，除甘氨酸外，皆含皆含手性手性C C，皆为，皆为L-L-构型（构型（蛋白中的蛋白中的氨氨基酸）；基酸）；旋光方向不同。左或右旋。旋光仪测定。旋光方向不同。左或右旋。旋光仪测定。比旋光度比旋光度D D2525( (单位浓度、单位长度下的旋光度，单位浓度、单位长度下的旋光度，/c/c* *l)l)是氨基酸的重要物

5、理常数之一，是鉴别各种是氨基酸的重要物理常数之一，是鉴别各种氨基酸的重要依据氨基酸的重要依据 。l在近紫外区在近紫外区(200-400nm)(200-400nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能和色氨酸有吸收光的能力。力。l酪氨酸酪氨酸的的 maxmax275nm275nm，l色氨酸色氨酸的的 maxmax280nm280nml苯丙氨酸的苯丙氨酸的 maxmax257nm257nml一）氨基酸的兼性离子形式：一）氨基酸的兼性离子形式： 氨基酸的两个重要性质：氨基酸晶体的氨基酸的两个重要性质：氨基酸晶体的熔点高（熔点高（ 200200 C C）；氨基酸使水的介电）；氨

6、基酸使水的介电常数增高。常数增高。 AA是两性电解质COOHNH2 H+COO-R - C - HNH2 H+R - C - HCOO-NH2R - C - H酸性环境酸性环境中性中性环境环境碱性环境碱性环境+1-10pK1 2pK2 9.4等电点等电点6.0等等电点电点pIpI：所带净电荷为零。电场中不移动。：所带净电荷为零。电场中不移动。此此氨基酸氨基酸在在 pH pH 2 2 或或 9 9 附近，有附近，有缓冲缓冲作用作用。赖氨酸的解离及等电点计算赖氨酸的解离及等电点计算HA2+A+A0A-l等电点等电点(isoelectric point,pI)(isoelectric point,p

7、I)：l中性氨基酸：酸性和碱性基团的算术平均值：中性氨基酸：酸性和碱性基团的算术平均值： p pI I = (p = (pK K-COO-COO- + p- + pK K-NH2 -NH2 )/2)/2， l l酸性氨基酸：两个酸性解离基团的算术平均值酸性氨基酸：两个酸性解离基团的算术平均值p pI I = (p = (pK K-COO-COO- + p- + pK KR-COOR-COO- - )/2 )/2 ， l碱性氨基酸：两个碱性解离基团的算术平均值碱性氨基酸：两个碱性解离基团的算术平均值p pI I = (p = (pK K-NH2-NH2+ p+ pK KR-NH2 R-NH2 )

8、/2 )/2 ， COOHCHH2NR亚硝酸反应亚硝酸反应烃基化反应烃基化反应酰化反应酰化反应脱氨基反应脱氨基反应西佛碱反应西佛碱反应成盐成酯反应成盐成酯反应成酰氯反应成酰氯反应脱羧基反应脱羧基反应叠氮反应叠氮反应侧链反应侧链反应茚三酮反应茚三酮反应成成 肽肽 反反 应应用途用途：常用于氨基酸的定性或定量分析。常用于氨基酸的定性或定量分析。CCCOOO茚三酮茚三酮CCCOOOHOHH2OH2O水合茚三酮水合茚三酮CO2NH2RCHO+CCCOOHOHH2NCHCOOHRCCCOOOHOH+2NH3CCCOOCCCOO-NH4+NH2O2+CCCOOOCCCOOHHOl氨基酸的结构通式为氨基酸的

9、结构通式为氨基酸。蛋白质氨基酸。蛋白质除含除含C,H,OC,H,O外，还含有外，还含有N N。AAAA平均分子量平均分子量为为110110。l不同蛋白的含氮量皆在不同蛋白的含氮量皆在16%16%左右。只需测左右。只需测定定N N含量，含量， N N含量含量/16%/16%即为蛋白含量。即为蛋白含量。l l - -凯氏定氮法的理论基础凯氏定氮法的理论基础l根据根据R R基的极性。原理：分配层析。基的极性。原理：分配层析。l 滤纸层析滤纸层析：l 薄层层析薄层层析：l根据氨基酸的净电荷及根据氨基酸的净电荷及R R基的极性：基的极性：l 离子交换层析离子交换层析：l阴离子交换树脂-N(CH3)3OH

10、，阳离子交换树脂-SO3Hl根据氨基酸的净电荷及质点大小：根据氨基酸的净电荷及质点大小：l 电泳电泳：l层析法层析法色层分析法（色谱）色层分析法（色谱）系统的组成固定相（静相）系统的组成固定相（静相）流动相（动相）流动相（动相）l分配定律分配定律当溶质在两种给定的当溶质在两种给定的互不相互不相溶溶的溶剂中分配时，在一定的温度下达到的溶剂中分配时，在一定的温度下达到平衡后，溶质在两相中的浓度比值为一常平衡后，溶质在两相中的浓度比值为一常数数. .此比值即分配系数（此比值即分配系数（kdkd）。）。l 固定相：固定相：纤维素上吸附的水纤维素上吸附的水流动相：展层溶剂，有机相流动相：展层溶剂，有机相

11、层析时，混合层析时，混合AAAA在两相中不断分配，在两相中不断分配，疏水性强的疏水性强的AAAA在固定相水中溶解度在固定相水中溶解度较较小，与水的作用力也较小，与水的作用力也较小，小，随展层剂的展层（移动）也移动较远距离随展层剂的展层（移动）也移动较远距离（迁移率（迁移率RfRf大）。大）。l极性强的极性强的RfRf值小，疏水性强的值小，疏水性强的RfRf大。大。l分离、鉴定分离、鉴定AAAA混合物的方法。混合物的方法。l将下列每组混合物分别用正丁醇将下列每组混合物分别用正丁醇- -醋酸醋酸- -水进行纸层析，指出每组的相对迁移率。水进行纸层析，指出每组的相对迁移率。l(1) Val(1) V

12、al和和Lys;Lys;l(2) Phe(2) Phe和和Ser;Ser;l(3) Leu(3) Leu、AlaAla、SerSerl一个氨基酸的羧基一个氨基酸的羧基与另一个氨基酸的与另一个氨基酸的氨基之间失水形成氨基之间失水形成的酰胺键称为的酰胺键称为肽键肽键，所形成的化合物称所形成的化合物称为肽。为肽。由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由几个到几十由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由几个到几十个氨基酸组成的肽称为寡肽，由更多个氨基酸组个氨基酸组成的肽称为寡肽，由更多个氨基酸组成的肽则称为多肽。组成肽链的氨基酸单元称为成的肽则称为多肽。组成肽链的氨基酸单元称为氨基酸残基氨基酸残基。CCNCCNCCN

13、CCNCCH2CHCH2CH2CH2COO-OHCO2HCH2CONH2OHCH3H3N+OOOOHHHHHHHHHSerValTyrAspGlnCH3N-端C-端肽键l在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序。顺序称为氨基酸顺序。l方向性：方向性：一条多肽链有两个末端，自由 - -氨基，称为氨基，称为氨基端或氨基端或N-N-端；端；游离 - -羧基，称为羧基端或羧基，称为羧基端或C-C-端。端。l氨基酸的顺序：氨基酸的顺序：N-N-端端C-C-端端l如上述五肽可表示为：Ser-Val-Tyr-Asp-Glun 丝氨丝氨酰酰缬氨缬氨

14、酰酰酪氨酪氨酰酰天冬氨天冬氨酰酰谷氨谷氨酸酸肽单位肽单位主链：侧链 肽具有酸碱两性性质和等电点。肽具有酸碱两性性质和等电点。肽的酸肽的酸碱性质主要来自游离末端碱性质主要来自游离末端 -NH-NH2 2和游离和游离末端末端 -COOH-COOH以及侧链以及侧链R R上可解离的基上可解离的基团。每一种肽都有其相应的等电点。团。每一种肽都有其相应的等电点。末末端端 - -NHNH2,2, - -COOHCOOH比游离氨基酸的比游离氨基酸的酸碱度降低。酸碱度降低。 l在生物体中，多肽最重要的存在形式是在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。作为蛋白质的亚单位。l但是，也有许多分子量比较小

15、的多肽以但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。殊的生理功能，常称为活性肽。l如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；肽；谷胱甘肽谷胱甘肽；蛇毒多肽等。；蛇毒多肽等。l部分肽中含有部分肽中含有D-D-氨基酸。氨基酸。l CO-NH-CH-CO-NH-CH2-COOHCHCH2 2CHCH2 2CHNHCHNH2 2COOHCOOHCHCH2 2SHSH 1.参与体内氧化还原反应参与体内氧化还原反应 2.作为辅酶参与氧化还原反应作为辅酶参与氧化还原反应 保护巯基酶或含保护巯基

16、酶或含Cys的蛋白质中的蛋白质中 SH的还原性的还原性 防止氧化物积累防止氧化物积累GSH+GSH-GSSG根据：根据：所要提取的蛋白（目的蛋白）与其它所要提取的蛋白（目的蛋白）与其它蛋白（杂蛋白）的不同进行分离。蛋白（杂蛋白）的不同进行分离。 溶解度不同溶解度不同: : 反相柱层析；反相柱层析；盐析盐析 分子量不同分子量不同: : 透析；透析；凝胶过滤法凝胶过滤法 所带电荷不同所带电荷不同: : 电泳；离子交换层析电泳；离子交换层析 特有的亲和力：特有的亲和力：亲和层析亲和层析l不同的蛋白质溶解度不同。且溶解度随外不同的蛋白质溶解度不同。且溶解度随外界条件如盐浓度，界条件如盐浓度，pHpH值

17、，温度等而变。值，温度等而变。 盐对蛋白质浓度的影响 盐溶盐溶 Salting-in:加少量盐使蛋白质溶解度变大 盐析盐析 Salting-out: 加大量盐使蛋白质由溶液中沉淀出來 蛋白质蛋白质溶解度溶解度和和pH值及盐浓度有关值及盐浓度有关0.0010.0050.01 0.02 NaCl(mol/L)pI4.8 5.0 5.2 5.4 5.6pH溶解度蛋白的稳定因素：蛋白的稳定因素：（1 1）带电层）带电层（2 2）水化层）水化层加入少量盐：增加入少量盐：增加带电层，促进加带电层，促进溶解。溶解。 -盐溶盐溶Aggregate蛋白质蛋白质分子表面的疏水性分子表面的疏水性区域区域，聚集許多水

18、分子，聚集許多水分子，当当加入加入盐时盐时，這些水分子被抽出，暴露出來的疏水，這些水分子被抽出，暴露出來的疏水性性区域区域互相互相结合结合，形成，形成沉淀沉淀。 盐析盐析 Salting-out Salting-out ：Ionic strength溶解度+-+-+AmmoniumsulfateSodiumsulfateA little salting-in effectNH4+SO42-= hydrophobic硫酸铵分级沉淀硫酸铵分级沉淀l又称为分子筛层析。依蛋白质分子量的差异，又称为分子筛层析。依蛋白质分子量的差异，通过具有通过具有分子筛性质的凝胶分子筛性质的凝胶而分离。而分离。l葡聚糖

19、凝胶葡聚糖凝胶G10-G200G10-G200l琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶2B,4B,6B2B,4B,6Bl聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶S100S100S600S600 凝胶颗粒小分子进入凝小分子进入凝胶分子内，被胶分子内，被滞留滞留大分子在凝大分子在凝胶颗粒间移胶颗粒间移动，较快流动，较快流出出溶剂流动方向溶剂流动方向按按分分子子量量从从大大到到小小依依次次流流出出l如两分子间有如两分子间有专一性亲和力专一性亲和力（特别的结（特别的结合和识别能力，具有合和识别能力，具有针对性针对性），以其中一种以其中一种作为作为“鱼饵鱼饵”，可把另外一种，可把另外一种“钓钓”出来。出来。其它蛋白不被吸引而结合不上

20、。其它蛋白不被吸引而结合不上。 亲和层析亲和层析法的作用法的作用机理机理：固相载体(1)(2)(3)ABSampleWashingElutionXB亲和基团的配体XBAAl在外电场的作用下，带电颗粒向着与其电性在外电场的作用下，带电颗粒向着与其电性相反的电极移动，这种现象称为电泳。相反的电极移动，这种现象称为电泳。l蛋白质有各自的等电点。在非等电点时，蛋蛋白质有各自的等电点。在非等电点时，蛋白质颗粒均带有不同的电荷。白质颗粒均带有不同的电荷。l蛋白质颗粒在电场中移动的速度（蛋白质颗粒在电场中移动的速度（v v）取决于）取决于电场强度电场强度(E)(E)，所带的，所带的净电荷净电荷(q)(q)以

21、及与以及与介质介质的摩擦系数的摩擦系数(f(f，即颗粒大小及形状，即颗粒大小及形状) )。lSDSSDS（十二烷基（十二烷基磺酸钠磺酸钠）是一种阴离子型表）是一种阴离子型表面活性剂，它能够与蛋白质中的氨基酸残面活性剂，它能够与蛋白质中的氨基酸残基按大约基按大约1 1 2 2比例结合，使比例结合，使蛋白以一条无蛋白以一条无构型的长条分子存在构型的长条分子存在，且分子表面均匀结，且分子表面均匀结合一层负的合一层负的SDSSDS的电荷，蛋白质分子的电荷，蛋白质分子原有电原有电荷间的差别则可以忽略荷间的差别则可以忽略。l用已知分子量的蛋白质作为标准，则可以用已知分子量的蛋白质作为标准，则可以估算出不同

22、蛋白质的分子量。估算出不同蛋白质的分子量。 定义定义 1969年年，国际纯化学与，国际纯化学与应用化学委员会应用化学委员会（IUPAC） 规定规定：蛋白质的一级：蛋白质的一级结构指结构指蛋白质多蛋白质多肽连中肽连中AA的排列的排列顺序，包括二硫顺序，包括二硫键的位置。键的位置。F. Sanger (1953, Cambridge U) Insulin 胰岛素 (A, B chains)以传统氨基酸定序法决定蛋白质序列S SSSS S+NH3NH3+-OOCQGIVEQCCTSI C SLYLENYCNCOO-FSFVNQHLCGHLVEALYLVCGERGFYTPKT B-chain A-ch

23、ainl（1） 测定多肽链的数目，拆分多肽链，测定多肽链的数目，拆分多肽链，分析分析多肽链的多肽链的N末端和末端和C末端残基末端残基l（2）断裂多肽链内、间的二硫键）断裂多肽链内、间的二硫键l（3） 测定每条多肽链的测定每条多肽链的AA组成组成l（4） 多肽链断裂成小肽段多肽链断裂成小肽段 （5） 测定各个肽段的测定各个肽段的AA顺序顺序 l（6） 确定肽段在多肽链中的次序确定肽段在多肽链中的次序（7） 确定原多肽链中二硫键的位置确定原多肽链中二硫键的位置lSangerSanger法。法。2,4-2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链够与肽链N-N-端的游离氨基作

24、用，生成二硝基苯端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（衍生物（DNP-DNP-肽）。肽）。l酸解，得黄色酸解，得黄色DNP-DNP-氨基酸，用乙醚抽提分离。氨基酸，用乙醚抽提分离。不同的不同的DNP-DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。氨基酸可以用色谱法进行鉴定。（一）一）N N末端分析法末端分析法O2NFNO2+ H2NCHCROHNCHCROO2NNO2H+H2OO2NNO2HNCHCROOH+氨基酸DNFBN-端氨基酸DNP衍生物DNP-氨基酸是游离氨基酸、多肽及蛋白共有的一个反应是游离氨基酸、多肽及蛋白共有的一个反应用途用途：可以用来鉴定多肽或蛋白质可以用来鉴定多肽或蛋白质NH2末端氨

25、基酸末端氨基酸.DNSDNS + + AA AA 多肽多肽 蛋白蛋白弱碱弱碱DNS-DNS-AA AA 多肽多肽 蛋白蛋白酸酸DNS-AADNS-AA + +游离游离AAAA（乙醚抽提，有荧光）（乙醚抽提，有荧光）l在可用在可用8mol/L8mol/L尿素或尿素或6mol/L6mol/L盐酸胍（使盐酸胍（使蛋白变性，亚基分开）存在下，蛋白变性，亚基分开）存在下，使使用过用过量的量的 - -巯基乙醇巯基乙醇，使二硫键还原为巯基，使二硫键还原为巯基，然后用然后用烷基化试剂烷基化试剂保护生成的巯基，以保护生成的巯基，以防止它重新被氧化防止它重新被氧化。(三三)氨基氨基酸组成的酸组成的分析：分析：酸，

26、碱解后酸，碱解后氨基酸分析氨基酸分析仪测定仪测定l1 1、 酶裂解法酶裂解法 胰胰蛋白酶蛋白酶蛋白水解酶（蛋白酶）：蛋白水解酶（蛋白酶）： 糜糜蛋白酶（肽链内切酶）蛋白酶（肽链内切酶）嗜嗜热菌蛋白酶热菌蛋白酶胃胃蛋白酶蛋白酶l胰蛋白酶胰蛋白酶Trypsin ：R R1 1= =赖氨酸赖氨酸LysLys和精氨酸和精氨酸ArgArg侧链（专一性较强，水解速度快）侧链（专一性较强，水解速度快）。l胰凝乳（糜）蛋白酶：专一性胰蛋白酶胰凝乳（糜）蛋白酶：专一性胰蛋白酶断裂断裂Phe,Trp,TyrPhe,Trp,Tyr等芳香族等芳香族AAAA的羧基形成的肽键。的羧基形成的肽键。NHCHCOR4NHCHC

27、OR3NHCHCOR2NHCHCOR1水解位点水解位点2、化学试剂法：溴化氰。R1=R1=甲硫氨酸。l1 1、EdmanEdman化学降解法化学降解法lEdmanEdman（苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分（苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种析法实际上也是一种N-N-端分析法端分析法。此法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链的特点是能够不断重复循环，将肽链N-N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。端氨基酸残基逐一进行标记和解离。 用途用途：可以用来鉴定多肽或蛋白质可以用来鉴定多肽或蛋白质NH2末端氨末端氨基酸。基酸。亦称亦称EdmanEdman反应反应弱碱弱碱 AAAAPITC+ PITC+ 多肽多肽 蛋白蛋白 AAAAPTCPTC多肽多肽 蛋白蛋白无水甲酸无水甲酸或或HFHFPTH-AA + PTH-AA + 少一个少一个AAAA的多肽或蛋白的多肽或蛋白（乙酸乙酯抽提）（乙酸乙酯抽提）此反应可循环进行此反应可循环进行 进行进行n n