《蛋白质的化学修饰》ppt课件

1、化学修饰的原理化学修饰的原理化学修饰的方法学化学修饰的方法学蛋白质侧链的修饰蛋白质侧链的修饰蛋白质肽链的交联蛋白质肽链的交联亲和标志亲和标志蛋白质化学修饰的运用蛋白质化学修饰的运用内内 容容 提提 要要第九讲第九讲三、羧基的修饰三、羧基的修饰用水溶性碳二亚胺作催化剂，经过胺专注地修饰蛋白质中的羧用水溶性碳二亚胺作催化剂，经过胺专注地修饰蛋白质中的羧基。基。ENZOCO+HNNCRRH+C+ENZHHONCON RRC+ENZHHONCON RR+ HXENZOCXC+HHNON RRH+C+ENZHHONCON RRCHNONRRHENZOC+碳二亚胺碳二亚胺构成相应酰胺构成相应酰胺重排重排四

2、、巯基的修饰四、巯基的修饰由于半胱氨酸时蛋白质中反响性最强的残基，所以很多试剂可用由于半胱氨酸时蛋白质中反响性最强的残基，所以很多试剂可用来修饰巯基侧链。来修饰巯基侧链。常用的有三类：常用的有三类：1.碘乙酸、碘乙酰胺或环乙烯亚胺碘乙酸、碘乙酰胺或环乙烯亚胺2.马来酰亚胺或马来酸酐马来酰亚胺或马来酸酐3.有机汞试剂有机汞试剂一一1类试剂是烷化剂，此类试剂还能与甲硫氨酸、赖氨酸或类试剂是烷化剂，此类试剂还能与甲硫氨酸、赖氨酸或 组氨酸反响。组氨酸反响。ENZS+ICH2COO-pH7ENZCH2+SCOO-I-碘乙酸碘乙酸半胱氨酸半胱氨酸副反响：副反响：HENZNN+ICH2COO-pH5.5E

3、NZCH2NNH+COO-I-+组氨酸组氨酸CH3ENZSICH2COO-+pH=28.5CH3CH2ENZ+SCOO-I-NH2ENZICH2COO-+pH=8.5甲硫氨酸甲硫氨酸HNCH2HENZ+COO-I-+二二2类试剂能与巯基构成对酸稳定的衍生物，而与其它基团类试剂能与巯基构成对酸稳定的衍生物，而与其它基团构成的产物那么对酸不稳定。构成的产物那么对酸不稳定。HENZSCH3CH2ONO+pH 5CCH3CHCCH2ONHENZCOSH副反响：副反响：NH2ENZCH3CH2ONO+pH 7CCH3CHNCCH2HONHENZCOH半胱氨酸半胱氨酸三三3类试剂对巯基专注性最强。常用的是

4、对氯汞苯甲酸，类试剂对巯基专注性最强。常用的是对氯汞苯甲酸，S-汞汞-N-5-二甲氨基萘磺酰半胱氨酸是对氯汞苯甲酸的衍生物，也可与二甲氨基萘磺酰半胱氨酸是对氯汞苯甲酸的衍生物，也可与巯基反响。巯基反响。马来酸酐马来酸酐ENZCH2HSCOO-HgCl+ENZ CH2SCOO-HgH+Cl对氯汞苯甲酸对氯汞苯甲酸+N（CH3）2SO2NHCHCOOHCH2SHg+S-汞汞-N-5-二甲氨基萘磺酰半胱氨酸二甲氨基萘磺酰半胱氨酸ENZSN（CH3）2SO2NHCHCOOHCH2SHgHENZS四四5，5-二硫双硝基苯甲酸二硫双硝基苯甲酸DTNB也常用于修饰巯基，也常用于修饰巯基，它与半胱氨酸构成混合

5、二硫化物。它与半胱氨酸构成混合二硫化物。HENZS+SCOO-OOCO2NSNO2pH 6.5ENZSCOO-SNO2+H+SCOO-NO2DTNB2-硝基硝基-5-硫代苯甲酸硫代苯甲酸释放出的释放出的2-硝基硝基-5-硫代苯硫代苯甲酸阴离子在甲酸阴离子在412nm处有处有吸收，可用光谱法测定其吸收，可用光谱法测定其含量。含量。五、组氨酸咪唑基的修饰五、组氨酸咪唑基的修饰常用试剂是焦碳酸二乙酯和碘乙酸。常用试剂是焦碳酸二乙酯和碘乙酸。NHHONCNNHONCNCH2COO-NHONCNCH2COO-+NHONCNCH2COO-CH2COO-1-羧乙基组氨酸羧乙基组氨酸3-羧乙基组氨酸羧乙基组氨

6、酸1，3-二羧乙基组氨酸二羧乙基组氨酸HENZNN+CCH3CCH2OOOOOCH2CH3pH 47+HOCH2CH3CO2+焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯碘乙酸碘乙酸ICH2COO-+ICH2COO-+CCH3CH2ENZNNOO用碘乙酸烷化组氨酸用碘乙酸烷化组氨酸残基可得单取代或双残基可得单取代或双取代衍生物。取代衍生物。焦碳酸二乙酯能使咪唑环上的一个氮原子羧乙基化焦碳酸二乙酯能使咪唑环上的一个氮原子羧乙基化.羟胺可使反响可逆进展，回收组氨酸。羟胺可使反响可逆进展，回收组氨酸。NH2OH+pH =7CCH3CH2ENZNNOOHENZNNCCH3CH2HNOHOO+羟胺羟胺六、色氨酸吲哚基的修饰

7、六、色氨酸吲哚基的修饰一一N-溴琥珀酰亚胺溴琥珀酰亚胺NBS常用来修饰色氨酸。常用来修饰色氨酸。它氧化吲哚基成为羟吲哚衍生物。酪氨酸也能与它氧化吲哚基成为羟吲哚衍生物。酪氨酸也能与NBS作用。作用。二各种苄基卤化物能使吲哚环烷基化二各种苄基卤化物能使吲哚环烷基化最常用的是最常用的是2-羟基羟基-5-硝基苄基溴，由于溶解度的问题，常用硝基苄基溴，由于溶解度的问题，常用它的类似物二甲基它的类似物二甲基2-羟基羟基-5-硝基苄基锍盐。硝基苄基锍盐。应留意应留意的问题的问题该试剂在水介质、高该试剂在水介质、高pH下不稳定，迅速水解为下不稳定，迅速水解为CO2和乙醇。和乙醇。试剂大大过量时可与咪唑环上的

8、两个氮都作用，构成双取代衍试剂大大过量时可与咪唑环上的两个氮都作用，构成双取代衍生物。生物。羟胺不能使双取代物发生可逆反响，而是去除咪唑环。羟胺不能使双取代物发生可逆反响，而是去除咪唑环。NO2CH2BrOHENZNH2-羟基羟基-5-硝基苄基溴硝基苄基溴+pH 7.5NO2ENZNHCH2OH+ HBrENZNHNO2ClS醋酸醋酸+NO2ENZNHS+ H+ + Cl-对氯硫硝基苯对氯硫硝基苯带硝基苯取代基的硫基卤化物的专注性与锍盐类似，但能产生单带硝基苯取代基的硫基卤化物的专注性与锍盐类似，但能产生单一产物，防止了锍盐修饰产物的不均一性，而且产物的光谱性质一产物，防止了锍盐修饰产物的不均

9、一性，而且产物的光谱性质可用来定量测定色氨酸。可用来定量测定色氨酸。七、酪氨酸酚基的修饰七、酪氨酸酚基的修饰四硝基甲烷在温暖条件下可高度专注地硝化酪氨酸残基，产生可四硝基甲烷在温暖条件下可高度专注地硝化酪氨酸残基，产生可电离的发色基团电离的发色基团3-硝基酪氨酸。硝基酪氨酸。色氨酸色氨酸八、甲硫氨酸甲硫基的修饰八、甲硫氨酸甲硫基的修饰用用H2O2和过甲酸可将甲硫氨酸氧化成甲硫氨酸亚砜，用碘乙酸和过甲酸可将甲硫氨酸氧化成甲硫氨酸亚砜，用碘乙酸烷化甲硫氨酸残基，能构成正甲硫盐。烷化甲硫氨酸残基，能构成正甲硫盐。九、丝氨酸羟基的修饰九、丝氨酸羟基的修饰甲苯磺酰氟甲苯磺酰氟PMSF)可与丝氨酸残基作用

10、。可与丝氨酸残基作用。ENZOHCHC(NO2)4+ENZOHNO2CH-C(NO2)3 + H+四硝基甲烷四硝基甲烷3-硝基酪氨酸硝基酪氨酸试试 剂剂修修 饰饰 的的 侧侧 链链Lys Glu Cys Arg Ser His Tyr Trp Met醋酸酐醋酸酐 酰基酸酐酰基酸酐 醛醛 N-溴琥珀酰亚胺溴琥珀酰亚胺 碳二亚胺碳二亚胺 苯异硫氰苯异硫氰 四硝基甲烷四硝基甲烷 三硝基苯磺酸三硝基苯磺酸 焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯 碘乙酸碘乙酸 环乙烯亚胺环乙烯亚胺 甲苯磺酰氟甲苯磺酰氟 马来酰胺马来酰胺 常用重要修饰剂的专注性常用重要修饰剂的专注性第四节第四节 蛋白质肽链的交联蛋白质肽链的交联双功能

11、试剂：具有两个反响活性部位，可以在相隔较近的两个氨双功能试剂：具有两个反响活性部位，可以在相隔较近的两个氨基酸残基间搭桥、构成多肽链内、多肽链间或者蛋白质分子之间基酸残基间搭桥、构成多肽链内、多肽链间或者蛋白质分子之间的交联，而不引起蛋白质构象的艰苦改动的试剂。的交联，而不引起蛋白质构象的艰苦改动的试剂。一、设计或选择交联剂要思索的要素一、设计或选择交联剂要思索的要素一反响的专注性一反响的专注性交联剂交联剂分为分为同型双功能试剂同型双功能试剂异型双功能试剂异型双功能试剂二交联间隔二交联间隔随着交联剂两个功能基之间间隔跨度的添加，构成交联的能够性随着交联剂两个功能基之间间隔跨度的添加，构成交联的

12、能够性也随之添加。也随之添加。三可裂解性三可裂解性研制可裂解交联剂有助于分别和表征交联片断。研制可裂解交联剂有助于分别和表征交联片断。四反响活性部分四反响活性部分可以在某种程度上控制交联剂的反响部位，可以经过交联剂反响可以在某种程度上控制交联剂的反响部位，可以经过交联剂反响活性部位的疏水性、亲水性或电荷来控制反响。活性部位的疏水性、亲水性或电荷来控制反响。二、交联剂的类型二、交联剂的类型交联剂交联剂类型类型同型双功能试剂同型双功能试剂异型双功能试剂异型双功能试剂可被光活化试剂可被光活化试剂.可裂解性可裂解性不可裂解性不可裂解性反响基团反响基团间隔基团间隔基团反响基团反响基团CH3OCNH2CH

13、3OCNH2同型双功能试剂同型双功能试剂(CH2)n，长度可变，长度可变SSN异型双功能试剂异型双功能试剂-S-CH2n-2可被硫醇裂解可被硫醇裂解长度可变长度可变OCCHOH（）2可被高碘酸裂解可被高碘酸裂解亚氨酯亚氨酯光活化双功能试剂光活化双功能试剂OHN3CNCF3OCNOC Cl能与胺反能与胺反应的基团应的基团能与巯基反能与巯基反应的基团应的基团一同型双功能试剂一同型双功能试剂交联剂两端具有一样的反响活性部分。交联剂两端具有一样的反响活性部分。双亚氨酯，可与氨基反响。两端间的间隔基团是双亚氨酯，可与氨基反响。两端间的间隔基团是CH2nOCNH2(CH2)nClCH3OC CH3NH2C

14、l假设间隔基团含有二硫桥，那么成为可裂解同型双功能试剂。假设间隔基团含有二硫桥，那么成为可裂解同型双功能试剂。CSCH3ONH2Cl(CH2)2CSCH3ONH2Cl(CH2)2一切同型双功能试剂都对氨基有专注性，但戊二醛例外，它一切同型双功能试剂都对氨基有专注性，但戊二醛例外，它除了与氨基反响外，还可与羟基反响。除了与氨基反响外，还可与羟基反响。双亚氨酸酯非裂解双亚氨酸酯非裂解二甲基二甲基-3，3-二硫代二硫代-双丙基亚氨酯可裂解双丙基亚氨酯可裂解二异型双功能试剂二异型双功能试剂这类试剂的一端与氨基作用，另一端与巯基侧链作用，但用碳二这类试剂的一端与氨基作用，另一端与巯基侧链作用，但用碳二亚

15、胺时，另一端反响基团是羧基。亚胺时，另一端反响基团是羧基。这类交联剂的一端含有氨基反响部分，这类交联剂的一端含有氨基反响部分，N-羟琥珀酰亚胺，另一羟琥珀酰亚胺，另一端含有巯基反响部分，马来酰亚胺或联硫基。端含有巯基反响部分，马来酰亚胺或联硫基。COON(CH2)3OO2N-羟琥珀酰亚胺辛二酸酯羟琥珀酰亚胺辛二酸酯非裂解非裂解CSO(CH2)2SONOONN-琥珀酰胺琥珀酰胺-3-2-吡啶二硫吡啶二硫代代)丙酸酯丙酸酯三可被光活化的试剂三可被光活化的试剂这类试剂是异型双功能试剂的扩展。这类试剂是异型双功能试剂的扩展。当交联剂一端的反响基团与蛋白质作用之后，经光照另一端那么当交联剂一端的反响基团

16、与蛋白质作用之后，经光照另一端那么产生一个反响活性部分，这部分即可是碳烯，也可是氮烯。产生一个反响活性部分，这部分即可是碳烯，也可是氮烯。这类交联剂一端普通含有能与氨基或巯基反响的基团，而另一端这类交联剂一端普通含有能与氨基或巯基反响的基团，而另一端那么含有对光敏感的基团。那么含有对光敏感的基团。三、交联剂的运用三、交联剂的运用蛋白质与交联剂的反响直接有助于蛋白质构象的稳定性蛋白质与交联剂的反响直接有助于蛋白质构象的稳定性交联剂可用来测定蛋白质亚基的量交联剂可用来测定蛋白质亚基的量能构成分子间的交联键，使蛋白质对变性稳定。能构成分子间的交联键，使蛋白质对变性稳定。两种酶经过交联构成杂化酶。两种

17、酶经过交联构成杂化酶。交联可提高酶分子构象的稳定性。交联可提高酶分子构象的稳定性。可测定齐聚体蛋白质的分子量和亚基数目。可测定齐聚体蛋白质的分子量和亚基数目。测定蛋白质上残基间的间隔。测定蛋白质上残基间的间隔。测定酶的活性部位。测定酶的活性部位。第五节第五节 亲和标志亲和标志亲和标志：部位专注性标志，是利用酶和底物的亲和性，亲和标志：部位专注性标志，是利用酶和底物的亲和性，运用与酶底物类似的修饰剂，对酶活性部位上的氨基酸运用与酶底物类似的修饰剂，对酶活性部位上的氨基酸残基进展共价标志。残基进展共价标志。亲和试剂作为底物类似物的规范：亲和试剂作为底物类似物的规范：1.在使蛋白质不可逆失活以前，亲

18、和试剂要与酶构成可逆复合物；在使蛋白质不可逆失活以前，亲和试剂要与酶构成可逆复合物；2.亲和试剂的修饰程度是有限的；亲和试剂的修饰程度是有限的；3.没有反响性的竞争性配位体的存在，应减弱亲和试剂的反响速没有反响性的竞争性配位体的存在，应减弱亲和试剂的反响速 度；度；4.亲和试剂的体积不能太大，否那么产生空间位阻；亲和试剂的体积不能太大，否那么产生空间位阻；5.修饰产物该当稳定，便于表征和定量。修饰产物该当稳定，便于表征和定量。亲和试亲和试剂分类剂分类内生亲和试剂内生亲和试剂外生亲和试剂外生亲和试剂一、内生亲和试剂一、内生亲和试剂IO4-+ENZ-(CH2)4-NH2NaBH4O-ATP与氨基反

19、响与氨基反响过碘酸氧化的过碘酸氧化的ATPO-ATP与氨基侧链的能够反响与氨基侧链的能够反响希夫碱化合物希夫碱化合物OOOHOHNH2NNNNCH2OPOOOONH2NNNNCH2POOHHOOPOOOO POOCCOOONH2NNNNCH2HHORC(CH2)4ENZCNOOHNH2NNNNCH2OR(CH2)4ENZCH2H2CHN+ENZ-(CH2)4-NH2+ENZ-CH2SHO-ATPO-ATP与巯基反响与巯基反响与氨基反响与氨基反响过碘酸氧化的过碘酸氧化的ATPO-ATP与赖氨酸侧链的能够反响与赖氨酸侧链的能够反响过碘酸氧化的过碘酸氧化的ATPO-ATP与巯基侧链的能够反响与巯基侧

20、链的能够反响吗啉型加合物吗啉型加合物OONH2NNNNCH2POOHHOOPOOOO POOCCOOONH2NNNNCH2POOHHOOPOOOO POOCCOOOOHNH2NNNNCH2OR(CH2)4ENZNHOONH2NNNNCH2HOORCCH2SCHHENZ缺陷：产生的二醛几乎全部与赖氨酸侧链反响，不能与缺陷：产生的二醛几乎全部与赖氨酸侧链反响，不能与更多类型侧链反响。更多类型侧链反响。嘌呤核苷酸的烷基卤化衍生物也可看作是亲和试剂，各种亲和嘌呤核苷酸的烷基卤化衍生物也可看作是亲和试剂，各种亲和侧链如侧链如Cys、His、Lys、Met等能与试剂上的卤原子反响。等能与试剂上的卤原子反响

21、。OPOOPOOOOPOOOHCH2AdenOCH2OPOOOOPCH2AdenClOCH2OOOPCH2AdenClCH2ATP腺苷腺苷-5-氯代甲烷焦磷酸酯氯代甲烷焦磷酸酯腺苷腺苷-5-(-磷酸氯乙酯磷酸氯乙酯Aden-为腺苷为腺苷ATP的烷基卤化衍生物的烷基卤化衍生物由于这两种试剂由于这两种试剂的构造与的构造与ATP相相似，才看作是内似，才看作是内生亲和试剂。生亲和试剂。二、外生亲和试剂二、外生亲和试剂一将卤代烷基衍生物经过腺嘌呤的一将卤代烷基衍生物经过腺嘌呤的N-6连到腺嘌呤连到腺嘌呤上，那么可构成有效的外生亲和试剂。上，那么可构成有效的外生亲和试剂。N-6-对对-溴乙酰胺溴乙酰胺-苄

22、基苄基-ADP二经过腺嘌呤核苷酸的磷酸基可参与另一类反响二经过腺嘌呤核苷酸的磷酸基可参与另一类反响基团。基团。OOOOOPOCH2AdenSF腺苷腺苷-5-(对对-氟磺酰苯酰磷酸氟磺酰苯酰磷酸这类试剂对赖氨酸这类试剂对赖氨酸和酪氨酸的反响性和酪氨酸的反响性很强。很强。合成具有两个反响基的嘌呤合成具有两个反响基的嘌呤核苷酸衍生物，它既含卤代核苷酸衍生物，它既含卤代烷基部分又含二羰丁基部分，烷基部分又含二羰丁基部分，不仅对能与卤代烷反响的侧不仅对能与卤代烷反响的侧链有专注性，还对精氨酸残链有专注性，还对精氨酸残基有专注性。基有专注性。OOPOOOHNNNNCH2ONHCOCH2BrOHCHNH三光

23、亲和试剂是一类特殊的外生亲和试剂。三光亲和试剂是一类特殊的外生亲和试剂。优点：光活化产生的自在基碳烯或氮烯能无选择地与各优点：光活化产生的自在基碳烯或氮烯能无选择地与各类侧链反响。类侧链反响。8-叠氮腺苷三磷酸叠氮腺苷三磷酸芳基叠氮芳基叠氮-丙氨酸丙氨酸NAD试剂中的光亲和基团试剂中的光亲和基团是经过核糖的羟基连是经过核糖的羟基连接的。接的。ONH2OOPOOOPOCOOHNH2NNNNO(CH2)2COOHNHN3NO2NOOHOHNH2OOOOPOOOPOOOOHNNNNCH2OOHN3P叠氮衍生物可看作是内生亲和试剂，而芳基叠氮衍生物叠氮衍生物可看作是内生亲和试剂，而芳基叠氮衍生物是外生

24、亲和试剂。是外生亲和试剂。第六节第六节 蛋白质氨基酸的敏化光氧化蛋白质氨基酸的敏化光氧化蛋白质的敏化光氧化：当敏化剂与蛋白质共存时，假设用可见蛋白质的敏化光氧化：当敏化剂与蛋白质共存时，假设用可见光照射，那么敏化剂产生化学变化，使蛋白质侧链氧化。光照射，那么敏化剂产生化学变化，使蛋白质侧链氧化。敏化光氧化需分子氧，而启动光氧化反响的是处于激发三重态的敏化光氧化需分子氧，而启动光氧化反响的是处于激发三重态的敏化剂。敏化剂。敏化光氧化的反响机理，有两种解释：敏化光氧化的反响机理，有两种解释：1.敏化光氧化并不决议于敏化剂与蛋白质之间的结合。敏化光氧化并不决议于敏化剂与蛋白质之间的结合。2.蛋白质先

25、与三重态的敏化剂发生专注性的结合反响，产生蛋白质先与三重态的敏化剂发生专注性的结合反响，产生自在基离子，再与分子氧反响，构成蛋白质氧化产物。自在基离子，再与分子氧反响，构成蛋白质氧化产物。影响光敏化反响效率和选择性的主要要素是敏化剂对蛋白质的影响光敏化反响效率和选择性的主要要素是敏化剂对蛋白质的结协作用。结协作用。运用能与蛋白质共价结合的敏化剂，可以了解某些氨基酸残基运用能与蛋白质共价结合的敏化剂，可以了解某些氨基酸残基在蛋白质空间构象中配置情况，也可测定蛋白质中包埋的和暴在蛋白质空间构象中配置情况，也可测定蛋白质中包埋的和暴露的基团。露的基团。第七节第七节 蛋白质化学修饰的运用蛋白质化学修饰的运用一、用来测定蛋白质分