CR样品DNA或RNA的提取ppt课件

1、蜜蜂分子生物学通用技术蜜蜂分子生物学通用技术-PCR-PCR检测运用实例检测运用实例. 蜜蜂样本的采集、标志及保管蜜蜂样本的采集、标志及保管时间时间样品样品编号编号地点地点经度经度 纬度纬度 海拔海拔mm生境生境蜂群情况蜂群情况样本数量样本数量只只保管方法保管方法2021.09.07A.f-1景洪基诺山 E101 N22 1130蜂群筑巢于茶园小灌木茶树上，周边有橡胶林和次林，植被覆盖率高。巢脾完好，均有储蜜，无明显病虫害发病病症。200一切工蜂活体样本均标志分装于清洁样品管中，并立刻置于液氮罐中保管，之后移入-80冰箱保管。A.f-2200A.f-3200A.f-42002021.09.08

2、勐仑植物园E10116 N218 552蜂群筑巢于森林边缘草丛中，植被茂密。巢脾小，无储蜜，迁飞至此不久，无明显病虫害发病病症。A.f-5A.f-6200200表表2-1 2-1 小蜜蜂样本采集信息表小蜜蜂样本采集信息表Table 2-1 Sample collection information of A. floreaTable 2-1 Sample collection information of A. florea. 蜜蜂样本分布图蜜蜂样本分布图图图2-1 2-1 西双版纳蜜蜂种类分布调查表西双版纳蜜蜂种类分布调查表Fig. 2-1. Distribution of three ho

3、ney bee species of Xishuangbanna CountyFig. 2-1. Distribution of three honey bee species of Xishuangbanna County.主要试剂主要试剂TRIzol ReagentTRIzol ReagentLife Technologies Co.Life Technologies Co.、氯仿、氯仿Invitrogen Co.Invitrogen Co.、异丙、异丙醇醇Invitrogen Co.Invitrogen Co.、70%70%乙醇、去乙醇、去RNARNA酶水酶水Invitrogen Co.

4、Invitrogen Co.。.制冰机、低温离心机eppendorf centrifuge 5004R、移液枪Gilson，10l、20 l、100 l、200 l、1000 l量程、无菌枪头10l、20 l、100 l、200 l、1000 l、漩涡混合器Labnet VX100、掌式离心机ISC BioExpress、电子天平Mettler AE100、超净任务台PCR Chamber主要实验仪器主要实验仪器. 从-80冰箱中取出单个蜜蜂样本放入已标志的1.5ml离心管中，用一次性塑料研磨棒快速捣碎，在无菌任务台内参与500l细胞裂解剂TRIzol，漩涡震荡1min。室温孵育3min，充分

5、降解样品中的核酸蛋白； 每个离心小管参与100l氯仿后盖好盖子，上下猛烈震荡50次后置于室温下孵育3分钟； 放入低温离心机内，在4下10,000rpm离心10min。样本混合液分别为下层的红色的苯酚氯仿层和无色上清水溶液。样品总RNA被溶解在上清水溶液中；TrizolTrizol法提取蜜蜂样本总法提取蜜蜂样本总RNARNA实验步骤实验步骤. 将离心管内的上清水溶液移入另一个1.5ml离心管中，参与500l乙丙醇，上下倒置混匀后，室温静置10min后，4下12,000rpm离心15min。粉红色RNA析出物沉淀于离心管壁内侧； 倒掉离心管内溶液，参与70%乙醇500l，漩涡震荡20sec清洗RN

6、A沉淀物，4下9,000rmp离心5min； 倒掉管内乙醇溶液，并用高压灭菌滤纸吸去离心管内剩余乙醇； 参与100 l去RNA酶无菌水溶解RNA沉淀，立刻放入-80冰箱保管。TrizolTrizol法提取蜜蜂样本总法提取蜜蜂样本总RNARNA实验步骤实验步骤.总RNA的纯度和浓度检测 纯DNA：OD260/OD2801.8 (1.9,阐明有RNA污染；1.6，阐明有蛋白质、酚等污染 纯RNA：1.7 OD260/OD2802.01.7时阐明有蛋白质或酚污染；2.0时阐明能够有异硫氰酸残存.病毒病毒引物引物基因组位置基因组位置前引物前引物(Forward5-3)(Forward5-3)后引物后引

7、物(Reverse5-3)(Reverse5-3)PCRPCR产物长度产物长度(bp )(bp )ABPVABPV1&ABPV24039-4930ggtgatatggtaccgctgctaatcaccagcaacatgaattc900BQCVBQCV1&BQCV27850-8580tggtcagctcccactaccttaaacgcaacaagaagaaacgtaaaccac700CBPVCBPV1&CBPV22580-3034agttgtcatggttaacaggatacgagtctaatcttagcacgaaagccgag455DWVDWVExt1&DWVE

8、xt2 6255-6965atcagcgcttagtggaggaatcgacaattttcggacatca702IAPVIAPVFla& IAPVR23-609gcggaggaatataaggctcagcttgcaagataagaaaggggg586KBVKBV1&KBV2 5405-5820gatgaacgtcgacctattgatgtgggttggctatgagtca415SBVSBVExt1&SBVExt24957-5781gctgaggtaggatctttgcgttcatcatcttcaccatccga824表表 2-3 2-3 七种蜜蜂病毒引物碱基序列七种蜜蜂

9、病毒引物碱基序列Table 2-3 Seven pairs base sequence for RT-PCRTable 2-3 Seven pairs base sequence for RT-PCRPCRPCR反响引物设计反响引物设计.试剂试剂ReagentReagent储液浓度储液浓度Liquid storage Liquid storage concerntrationconcerntration体积体积VolumeVolume终浓度终浓度Terminal Terminal concerntrationconcerntrationNuclease-free water13.5 lAMV/

10、TfI 5Reaction Buffer55 l1dNTPMgSO410 mmol/L25 mmol/L0.520.2 mmol/L1 mmol/LPrimer-F20 mmol/L1.251 mol/LPrimer-R20 mmol/L1.251 mol/LAMV Reverse Tfanscriptase5mol/L0.50.1 mol/LTfI DNA Polymerase合计5mol/L0.524 l0.1 mol/L表表2-4 RT-PCR2-4 RT-PCR反响体系配制表反响体系配制表Table 2-4 RT-PCR reaction systemsTable 2-4 RT-PCR

11、 reaction systemsPCRPCR反响体系配制反响体系配制.将配好的RT-PCR反响液放入PCR仪中进展扩增，反响程序如下： 逆转录，48,45min； 逆转录酶灭活，94,2min； 变性，94，30sec； 退火，60，60sec； 延伸，68，120sec； 35进展40个循环； 最后在68条件下，延伸7min后，终了反响， 产物保管于4冰箱中。PCRPCR反响程序反响程序.PCRPCR反响产物凝胶电泳检测反响产物凝胶电泳检测 配置1%的低熔点琼脂凝胶，准确称量1g低熔点琼脂糖粉参与到已装有100ml 1TAE缓冲液的600ml锥形瓶中，放入微波炉内加热至琼脂糖粉完全溶解。

12、待1%的琼脂溶液冷却至60，参与5l溴化乙碇储存浓度为10mg/ml，最终浓度为0.5g/ml，混合均匀。 将配好的琼脂溶液倒入两端胶带封口并插入梳子的模具中，待其完全凝固后取下封口胶带，放入电泳槽内，参与1TAE缓冲液浸没琼脂凝胶，小心拔出梳子。 在每个RT-PCR反响管中参与6l DNA凝胶loading buffer并混合均匀，按以下顺序上样到琼脂凝胶孔内： No.1 100bp Marker No.2 H2O S1 S2 S3 . . No.4 H2O No.5 Negative Control No.6 Positive Control.PCRPCR反响产物凝胶电泳检测反响产物凝胶电泳检测 接上电源，100V恒定电压电泳1hr，至二甲苯条带挪动至琼脂胶的2/3位置，终了电 泳。 取出琼脂凝胶，放入凝胶成像仪内，显像察看并打印图2-2。.PCRPCR反响产物回收反响产物回收 经过凝胶电泳分别不同长度的DNA片断，然后在紫外灯下，用无菌刀片切下目 的条带约300mg，放入一个1.5ml离心管内，密封后置于70水浴，待其完全 融 化， 运用DNA纯化试剂盒Promega按操作步骤回收所需的PCR产物，将回收的DNA置于-20冰箱内保管。 分子克隆PCR片断：衔接