禽流感细胞灭活苗研究与H亚型

1、研究背景研究背景: 文献综述文献综述禽流感细胞灭活疫苗的研究禽流感细胞灭活疫苗的研究H9亚型禽流感感染猪的血清学调查亚型禽流感感染猪的血清学调查 全病毒灭活疫苗全病毒灭活疫苗 基因工程亚单位疫苗基因工程亚单位疫苗 重组活载体疫苗重组活载体疫苗 核酸疫苗核酸疫苗 流感减毒活疫苗流感减毒活疫苗 禽流感疫苗禽流感疫苗冷适应减毒活疫苗冷适应减毒活疫苗 重配减毒活疫苗重配减毒活疫苗基因工程减毒活疫苗基因工程减毒活疫苗 复制缺陷型流感复制缺陷型流感减毒活疫苗减毒活疫苗 表位疫苗表位疫苗 通用疫苗通用疫苗 病毒的别离鉴定病毒的别离鉴定 琼脂凝胶扩散试验琼脂凝胶扩散试验AGP 血凝血凝HA和血凝抑制试验和血凝

2、抑制试验HI 神经氨酸酶抑制试验神经氨酸酶抑制试验NIT病毒中和试验病毒中和试验NT 免疫荧光技术免疫荧光技术IFT 酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验ELISA 分子生物学诊断技术分子生物学诊断技术 禽流感的检测方法禽流感的检测方法灭活疫苗平安性好，免疫原性强，给免疫鸡群提供良好的免疫保护。目前已得到广泛的应用。细胞苗与传统的鸡胚苗相比，抗原性更接近自然流行株，可减少宿主蛋白成分，减少变态反响，防止鸡胚传代后引起抗原性变异。 本试验将禽流感病毒H5N1接种MDCK细胞，通过收获细胞病变液经灭活制成细胞灭活疫苗，为HPAI的防控提供新的疫苗储藏。 敏感细胞株的挑选敏感细胞株的挑选 代次细胞F1F

3、2F3F4F5CEF2626252625MDCK2928282729Vero2525262422BHK-21232324240“2n表示血凝价为nlog2 表2-1 禽流感病毒在4种细胞上的血凝价 结果说明，病毒在MDCK细胞上增殖的血凝价最高，到达27以上，且比较稳定。病毒在CEF、 Vero和 BHK细胞上的增殖滴度都比较低在26以下，也不适于选用。因此我们选用MDCK细胞用于细胞苗制备的细胞系。l禽流感病毒接种MDCK细胞后2036h开场出现呈现明显的细胞病变l正常的MDCK 细胞排列整齐，界限明晰l病变的细胞变圆，脱落、颗粒增多，成片细胞之间有丝相连，成“ 拉网 构造 。图2-1 正常

4、MDCK细胞与细胞病变 F1F2F3F4F5F6F7F8F9XSHA26262525262524230TCID5010-6.010-6.110-5.810-5.510-4.810-5.210-4.010-3.10JXHA252524242524232322TCID5010-5.210-5.010-4.510-4.010-4.010-4.210-4.210-3.00XFYHA262525242424252324TCID5010-4.310-4.010-4.010-3.510-4.510-3.010-4.010-4.010-3.5DWHA292828272728282928TCID5010-7.0

5、10-7.110-7.510-7.510-7.010-7.210-7.110-7.510-7.1表2-2 4个AIV毒株在MDCK上传10代后的血凝HA效价和TCID50TCID50/0.1mL毒株XS、JX和XFY的血凝价和TCID50较低且不稳定，随着连续传代呈下降趋势。DW毒株的血凝价最高达210 ，TCID5010。因此我们确定DW毒株为制苗用毒株。A/Chicken/HuBei/327/2002(H5N1) AIV代次F1F2F3F4F5F6F7F8F9F10血凝价血凝价28282727262828282829TCID5010-6.810-6.810-7.010-7.110-7.51

6、0-7.210-7.510-7.310-7.310-7.8AIV代次F11F12F13F14F15F16F17F18F19F20血凝价血凝价28292122122102928282929TCID5010-7.510-7.410-7.510-7.810-7.510-7.510-7.810-7.710-7.610-7.7AIV代次F21F22F23F24F25F26F27F28F29F30血凝价血凝价210292921029282112921029TCID5010-7.510-7.410-7.510-7.610-7.910-7.810-7.810-7.410-7.810-7.5表2-3 不同代次禽

7、流感病毒在MDCK细胞上的血凝价和TCID50 TCID50 /0.1mL结果说明H5N1毒株经MDCK细胞接种培养30代后，血凝价稳定在28以上，TCID50稳定在10以上。随着代次的增加，血凝价和TCID50都逐渐上升且稳定，为疫苗的制备提供了高免疫原性的抗原。灭活：以终浓度为的甲醛溶液灭活。灭活：以终浓度为的甲醛溶液灭活。灭活检验：将灭活的病毒液接种灭活检验：将灭活的病毒液接种910日龄鸡胚，盲传日龄鸡胚，盲传3代后，全部鸡胚发育正常。说明病毒灭活彻底，代后，全部鸡胚发育正常。说明病毒灭活彻底，保证了疫苗的生物平安。保证了疫苗的生物平安。平安性试验：用制备的细胞灭活苗双倍剂量接种28日龄

8、H5-AIV抗体阴性鸡10只，只，鸡群未出现异常反响和部分损伤。说明所制备的细胞苗平安性良好。组 别免疫剂量攻毒时间攻毒剂量免疫保护力健活数死亡数H5细胞灭活苗细胞灭活苗0.2mL免疫后21天0.2mL8/80/8H5尿囊液毒灭活苗8/80/8禽流感灭活苗（N28株，哈兽研）8/80/8空白对照（无菌DMEM培养基）0/88/8 将疫苗免疫H5抗体阴性鸡21d 测得HI抗体程度到达29，用100LD50的H5N1-AIV进展攻毒。表表2-4 各免疫组攻毒保护试验各免疫组攻毒保护试验 结果说明，各免疫组鸡全部健活，保护率为100%。空白对照组鸡攻毒后24h开场出现精神萎靡、流泪、呼吸困难、颜面水

9、肿、羽毛松散等病症，并出现死亡，在5天内全部死亡。 说明研制的H5亚型禽流感病毒细胞灭活苗免疫效果良好，与尿囊液灭活苗和禽流感灭活苗N28株，哈兽研的免疫保护率相当，可以对同亚型的病毒攻击起到保护作用。 疫苗免疫后7天开场检测到抗体，至第3周抗体程度上升较快，HI效价均到达29以上。从第3周至第7周，抗体程度持续缓慢地上升至29211。到第8周抗体程度开场缓慢下降，至36周细胞苗组的抗体在25左右。空白对照组鸡的抗体一直在24以下，禽流感抗体阴性。说明制备的细胞苗免疫效果可以维持9个月以上。 HI 效 价 (log2)免疫后时间周 存放时间HI抗体7d14d21d28d35d60d6个月25.

10、226.029.8210.129.829.210个月25.026.229.5210.029.829.0对照组000000 疫苗保存10个月后免疫鸡， 28d顶峰可达2。 因此该疫苗保存期暂定10个月4-8。 将疫苗置于4保存6、10个月后均未出现分层破乳现象。 疫苗免疫鸡后，无不良反响。 表2-5 保存期试验结果免疫抗体程度 本试验挑选了MDCK细胞和DW毒株A/Chicken/HuBei/327 /2002(H5N1)为本试验制苗用细胞系和毒株。研制了H5亚型禽流感细胞灭活苗，并对其免疫效果进展了评价，该疫苗对同亚型病毒的攻击能提供100%保护。抗体持续时间到达9个月， 4 保存期为10个月

11、。禽流感已打破种属障碍感染人并致人死亡。H9N2在猪中也别离到，且能直接感染人。猪是禽流感病毒和其他流感病毒的混合器，在禽猪人的种间传播中起到非常重要的作用。做好对猪群的监测，建立一套早期预警体系，即可提早预报流感大流行。 本实验利用建立的H9HA-ELISA诊断方法，对来自湖北、湖南和安徽三省的949份猪血清进展了血清学分析。图图3-1 原核表达载体原核表达载体pKG-H9HAM诱导表达产物的诱导表达产物的SDS-PAGE检测检测1: pKG-H9HAM; 2: pGEX-KG 结果显示：含pKG-H9HAM重组质粒的E.coli BL21在约90KDa处有明显的表达带，H9HA蛋白约63K

12、Da，与GST交融后约为90KDa。而含pGEX-KG的 BL21的对照在约26KDa有明显的表达带，相当于GST蛋白的分子量。说明目的基因获得了表达。 Ag DilutionSerum DilutionABCDEFGH1:101:201:401: 801:1601:3201:6401:1280+11：102.0111.8021.7961.6131.5641.5321.2011.01821：201.9211.7191.6161.5991.5541.5191.0780.93531：401.8221.6831.6591.5161.5141.4580.9760.84541：801.8101.6171

13、.6511.4631.4461.1730.6700.45151：1601.5981.5081.5571.1271.0310.6530.4130.35561：3201.4271.3421.4161.0160.7730.4620.4180.311_71：100.5010.4540.3520.2620.2530.1780.1760.13581：200.4840.4670.2490.2350.2060.1390.1080.09891：400.4450.4460.2590.2080.1840.0670.0590.045101：800.4180.4080.2150.1510.1240.0780.0550.

14、057111：1600.3650.3540.1260.0920.0630.0290.0410.045121：3200.2470.2760.1030.0530.0400.0180.0210.021表3-1 ELISA方阵滴定结果 将临床送检经HI检测为阴性的100 份猪血清，进展ELISA检测均为阴性，计算该100份血清的OD630nm平均值，标准差，因此根据公式X+3SD求得阴阳界限为。结果断定：以空白孔调零，在酶标仪上测各孔OD630nm值 OD630nm0. 404判为阳性； OD630nm判为阴性。批内重复的吸收变异系数在之间；批间重复的吸收变异系数在之间。说明该诊断方法具有良好的重复性

15、具有良好的重复性。血 清阳 性 血 清血清样品12345678910OD6300.1020.1230.0980.1040.0890.1010.1110.0791.3050.1031)弓形虫；2)猪瘟；3)胸膜肺炎；4)口蹄疫病毒；5)伪狂犬病毒；6)细小病毒；7)乙脑病毒；8)猪繁殖与呼吸道综合症；9)猪抗H9-AIV阳性血清；10)阴性血清上述结果说明该ELISA方法检测弓形虫、猪瘟等8种猪病阳性血清均无穿插反响，检测H9-AIV猪阳性血清结果为阳性，阴性血清结果为阴性，说明该方法的分析特异性良好。表3-4 分析特异性试验结果血凝抑制试验（HI）合计ELISA 142251671123624

16、7合计153261414根据公式计算得该ELISA方法的诊断敏感性为92.8%； 特异性为90.4%；总符合率为说明该方法具有良好的诊断特异性、敏感性与符合率良好的诊断特异性、敏感性与符合率。表表3-5 ELISA方法的诊断特异性、敏感性与符合率方法的诊断特异性、敏感性与符合率湖北湖北湖南湖南安徽安徽2-3月份月份9-10月份月份2-3月份月份9-10月份月份2-3月份月份9-10月份月份哺哺乳乳仔仔猪猪检测数434045313235阳性数211001阳性率4.7%2.5%2.2%0.0%0.0%2.9%保保 育育猪猪检测数404129413642阳性数320011阳性率7.5%4.9%0.0

17、%0.0%2.8%2.4%育育 肥肥 猪猪检测数503843474538阳性数303243阳性率6.0%0.0%7.0%4.3%8.9%7.9%种种猪猪检测数383536345040阳性数531253阳性率13.2%8.6%2.8%5.9%10.0%7.5%合合 计计检测数171154153153163155阳性数13654108表表3-6 猪的血清学调查结果猪的血清学调查结果检测猪血清949份，总阳性数为46份，阳性率为4.8%。各地都检测到一定的阳性率。多数猪场只检测到1、2头阳性，说明只是有零星感染。三省2-3月份的阳性率均高于9-10月份，这与初春季节天气寒冷有关。从哺乳仔猪到种猪的阳性率根本呈上升趋势。利用表达的HA蛋白，建立了用于诊断猪H9亚型禽流感抗体的ELISA诊断方法。利用建立的ELISA方法对2005年2-3月份、9-10月份期间来自湖北、湖南、安徽地区的949份送检猪血清进展检测，抗体