第六讲序列分析一般程序中的一个实例

1、 对一条新的基因序列进行生物信息学的分析前言对从真菌tabescens中克隆出一个基因的全长cDNA进行生物信息的分析，预测这个未知cDNA的功能目前因特网上有许多生物学信息库，采用不同的算法，对生物学数据进行从序列水平到结构层次，进而到功能的多种分析。本章的分析主要利用这些数据库和相关软件完成。材料和仪器（1）生物技术实验室从一株产-甘露聚糖酶的新菌种A.tabescens EJLY2098克隆出一个全长cDNA（命名为man）（2）可以连接国际互联网的计算机核酸序列的基本分析运用DNAMAN软件分析核酸序列的分子质量、碱基组成和碱基分布。同时运用BioEdit（版本）软件对m

2、an做酶切谱分析。碱基同源性分析运用NCBI信息库的BLAST程序对man进行碱基同源性分析(Translated query tien database(blastx)网站如下：参数选择：TRANSLATEDquery-PROTEIN database blastx； nr;stander1开放性阅读框（ORF）分析利用NCBI的ORF Finder程序对man做开放性阅读框分析，网址如下：参数选择：Genetic Codes：1 Standard对蛋白质序列的结构功能域分析运用简单模块构架搜索工具（Simple Modular Architecture Research Too

3、l,SMART）对manORF出的蛋白质序列进行蛋白质结构功能域分析。该数据库由EMBL建立，其中集成了大部分目前已知的蛋白质结构功能域的数据。12网址如下：运用NCBI的BLAST程序再对此蛋白质序列进行rpsBlast分析参数选择：Search Database：CDD v2.0711937PSSMs Expect：0.01Filter：Low complexitySearch mode：multiple hits 1pass同源物种分析用DNAMAN软件将蛋白质序列与GHF5的-甘露聚糖酶序列和GHF6的-甘露聚糖酶序列序列比对，根据结果绘出系统进化树，并进行分析。蛋白质一级序列的基本分

4、析运用BioEdit（版本）软件对man ORF翻译的蛋白的一些基本性质，对分子量、等电点、氨基酸组成等作出分析。二级结构和功能分析信号肽预测利用丹麦科技大学（DTU）的CBS服务器蛋白质序列的信号肽（signal peptide）预测，进入Prediction Serves 页面。网址如下：参数选择：Eukaryotes；Both；GIF (inline)；Standard；疏水性分析利用瑞士生物信息学研究所（Swiss Institute of Bioinformatics， SIB）的ExPASy服务器上的ProtScale程序13对ORF 翻译后的氨基酸序列做疏水性分析网

5、址如下：参数选择：蛋白质溶解能力和PROSITE motif search的分析利用美国哥伦比亚大学（Columbia University）的PredictProtein服务器（PHD）14对ORF 翻译后的氨基酸序列通过发邮件的方式获得蛋白质溶解能力和PROSITE motif search分析的结果。网址如下：磷酸化位点分析磷酸化和去磷酸化是细胞内信号传导的重要方式，利用丹麦科技大学（DTU）的CBS服务器上的NetPhos2.0 Server程序15做磷酸化位点分析。NetPhos2.0 Server程序是基于神经网络算法，对蛋白序列中的Ser、Thr和Tys三种氨基酸残基可能成为的磷

6、酸化位点作出预测，网址如下：跨膜区分析蛋白质序列含有跨膜区提示它可能作为膜受体起作用，也可能是定位于膜的锚定蛋白或者离子通道蛋白等，从而，含有跨膜区的蛋白质往往和细胞的功能状态密切相关。12利用丹麦科技大学（DTU）的CBS服务器上的TMHMM Server v. 2.0程序进行蛋白序列跨膜区分析。网址如下：参数选择：Extensive with graphics亚细胞定位通过WoLF PSORT工具基于其氨基酸序列预测蛋白质亚细胞定位点网址如下：参数选择：Fungi；From Text Area二硫键分析运用SCRATCH Protein Predictor 对蛋白质的二硫键做出分析。网址如

7、下：/baldig/scratch/index.html参数选择：Dlpro(Disulfide Bonds)二级结构预测运用PBIL LYON-GERLAND信息库对蛋白质序列进行二级结构预测（Secondary structure prediction），主要用Hopfield神经网络（HNN）预测。网址如下：结果从一株产-甘露聚糖酶的新菌种A.tabescens EJLY2098获得的全长cDNA序列如下：ACGCGGGGGAAAGATGCATCTGCTCGCTTTTCTGTCTCTGAGTACATTCCTGTGCTCTGCGTTCGCTGCTG

8、TTCCTGAGTGGGGCCAATGTGGCGGCATTGGATGGACAGGACAGACCACTTGCGTTAGTGGTACAGTATGCGCAGCTCTCAATGACTATTATTCTCAATGTGTGCCTGGAACGGCCACAACAACGGCCGCTCCCACGACTGCTACATCAACAACCATTTCTTCCACTTCTCGCACAACTGCTACGTCGACCACAGCTTCCGCACCATCTTCTACTGGCTTTGTAACTACCTCTGGCACAGAGTTCCGCCTCAACGGTGCCAAATTTACTATCTTCGGCGCCAACTCATACTGGGTCGGGT

9、TGATGGGCTATAGCACTACAGATATGAATAAAGCCTTCGCAGACATCGCGGCTACAGGTGCCACCGTCGTCCGCACATGGGGCTTCAATGAGGTAACGAGTCCTAACGGGATTTATTACCAGAGTTGGTCCGGAAGTACACCAACTATCAACACAGGTTCTACGGGTCTTCAAAACTTTGATGCCGTCGTCGCTGCTGCTGCTGCACATGGCTTGAGGCTTATTGTTGCCATAACGAACAACTGGTCCGACTATGGTGGAATGGATGTATACGTTAACCAAATTGTCGGGTCTGGCTCTG

10、CGCACGATTTATTCTATACCGACTGTGAGGTTATATCTACTTACATGAACTACGTCAAGACCTTCGTCTCGCGCTATGTGAACGAACCTACTATTTTAGGTTGGGAGCTTGCAAATGAACCTAGATGCAAGGGGAGTACCGGGACGACCTCTGGATCATGCACTGCAACGACTATCACAAAATGGGCCGCGGCAATTTCAGCGTACATCAAGTCGATCGATCCCAACCATCTTGTCGGGATAGGAGATGAAGGGTTCTACAATGAACCTAGCGCACCAACATATCCATATCAAGGTAGCG

11、AAGGTATCGATTTTGATGCAAATTTGGCCATTAGTAGCATTGATTTCGGTACATTCCATTCCTATCCTATCAGCTGGGGTCAAACCACTGATCCTCAGGGATGGGGTACGCAATGGATCGCTGATCATGCAACGTCAATGACAGCTGCGGGAAAGCCCGTAATCTTAGAGGAGTTTGGAGTCACCACTAATCAAGCAACTGTTTATGGCGCCTGGTATCAGGAAGTTGTCTCTTCGGGTCTTACTGGTGCTCTTATTTGGCAAGCTGGTTCTTATTTATCATCCGGAGCTACTCCGGACG

12、ACGGATATGCAATTTATCCTGATGATCCTGTATATTCCCTGGAAACCTCCTATGCGGTTACATTGAAAGCGCGGGCGTAGGATAGGGTACAGAATAAATTTTGCTCCGATGTGGTACTGTAGCCGAGCGGCTTGACTATGTGAATAAAAATAGCACTGTTGTCACGATCGATCAACACCTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA核酸序列的基本分析核酸序列的基本分析结果如下：SEQ New: 1483 bp;Composition 388 A; 358 C; 351 G; 386 T; 0 OTHERP

13、ercentage: 26.2% A; 24.1% C; 23.7% G; 26.0% T; 0.0%OTHERMolecular Weight (kDa): ssDNA: 457.73 dsDNA: 914.24ORIGIN1 ACGCGGGGGA AAGATGCATC TGCTCGCTTT TCTGTCTCTG AGTACATTCC TGTGCTCTGC61 GTTCGCTGCT GTTCCTGAGT GGGGCCAATG TGGCGGCATT GGATGGACAG GACAGACCAC121 TTGCGTTAGT GGTACAGTAT GCGCAGCTCT CAATGACTAT TATT

14、CTCAAT GTGTGCCTGG181 AACGGCCACA ACAACGGCCG CTCCCACGAC TGCTACATCA ACAACCATTT CTTCCACTTC241 TCGCACAACT GCTACGTCGA CCACAGCTTC CGCACCATCT TCTACTGGCT TTGTAACTAC301 CTCTGGCACA GAGTTCCGCC TCAACGGTGC CAAATTTACT ATCTTCGGCG CCAACTCATA361 CTGGGTCGGG TTGATGGGCT ATAGCACTAC AGATATGAAT AAAGCCTTCG CAGACATCGC421 GGC

15、TACAGGT GCCACCGTCG TCCGCACATG GGGCTTCAAT GAGGTAACGA GTCCTAACGG481 GATTTATTAC CAGAGTTGGT CCGGAAGTAC ACCAACTATC AACACAGGTT CTACGGGTCT541 TCAAAACTTT GATGCCGTCG TCGCTGCTGC TGCTGCACAT GGCTTGAGGC TTATTGTTGC601 CATAACGAAC AACTGGTCCG ACTATGGTGG AATGGATGTA TACGTTAACC AAATTGTCGG661 GTCTGGCTCT GCGCACGATT TATTC

16、TATAC CGACTGTGAG GTTATATCTA CTTACATGAA721 CTACGTCAAG ACCTTCGTCT CGCGCTATGT GAACGAACCT ACTATTTTAG GTTGGGAGCT781 TGCAAATGAA CCTAGATGCA AGGGGAGTAC CGGGACGACC TCTGGATCAT GCACTGCAAC841 GACTATCACA AAATGGGCCG CGGCAATTTC AGCGTACATC AAGTCGATCG ATCCCAACCA901 TCTTGTCGGG ATAGGAGATG AAGGGTTCTA CAATGAACCT AGCGCAC

17、CAA CATATCCATA961 TCAAGGTAGC GAAGGTATCG ATTTTGATGC AAATTTGGCC ATTAGTAGCA TTGATTTCGG1021 TACATTCCAT TCCTATCCTA TCAGCTGGGG TCAAACCACT GATCCTCAGG GATGGGGTAC1081 GCAATGGATC GCTGATCATG CAACGTCAAT GACAGCTGCG GGAAAGCCCG TAATCTTAGA1141 GGAGTTTGGA GTCACCACTA ATCAAGCAAC TGTTTATGGC GCCTGGTATC AGGAAGTTGT1201 CT

18、CTTCGGGT CTTACTGGTG CTCTTATTTG GCAAGCTGGT TCTTATTTAT CATCCGGAGC1261 TACTCCGGAC GACGGATATG CAATTTATCC TGATGATCCT GTATATTCCC TGGAAACCTC1321 CTATGCGGTT ACATTGAAAG CGCGGGCGTA GGATAGGGTA CAGAATAAAT TTTGCTCCGA1381 TGTGGTACTG TAGCCGAGCG GCTTGACTAT GTGAATAAAA ATAGCACTGT TGTCACGATC1441 GATCAACACC TAAAAAAAAA

19、AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAA对其所做对其所做的酶切谱分析结果如下： 对DQ286392的酶切图（见附录1） 单酶切统计，见下表：Restriction table:Enzyme Recognition frequency Positions_AccI GTmk_AC 2 258, 640AloI GAACnnnnnnTCCnnnnnnn_nnnnn 1 632AloI GGAnnnnnnGTTCnnnnnnn_nnnnn 1 600AlwI GGATCnnnnn_ 5 833, 885, 1056, 1095, 1290ApoI rAATT_y 3 333, 992, 1

20、368BanI GGyrC_C 4 327, 348, 429, 1179BbeI G_GCGCC 2 352, 1183BbsI GAAGACnnnnnn_ 1 531BbvI GCAGCnnnnnnnnnnnn_ 7 53, 156, 551, 554, 557, 560, 1103BceAI ACGGCnnnnnnnnnnnnnn_ 3 199, 211, 540BcgI CGAnnnnnnTGCnnnnnnnnnn_nn 3 1003, 998, 1294BcgI GCAnnnnnnTCGnnnnnnnnnn_nn 3 969, 1032, 1260BclI TGATC_A 1 109

21、4BfrBI ATGCAT 1 17BglI GCCn_nnnnGGC 1 91BmrI ACTGGGnnnn_n 1 371BpuEI CTTGAGnnnnnnnnnnnnnn_nn 1 605BsaHI GrCG_yC 2 349, 1180BsaJI CCnnG_G 2 859, 1309BsaWI wCCGG_w 3 501, 1254, 1265BsaXI ACnnnnnCTCCnnnnnnn_nnn 1 215BsaXI GGAGnnnnnGTnnnnnnnnn_nnn 1 185BseMII CTCAGnnnnnnnn_nn 3 30, 67, 1080BseRI GAGGAGn

22、nnnnnnn_nn 1 1155BseYI CCCAG_C 1 1045BsgI GTGCAGnnnnnnnnnnnnnn_nn 1 559BsiEI CG_ryCG 3 199, 889, 1440BsiHKAI G_wGCwC 2 57, 1223BslI CCnn_nnnnnGG 4 81, 449, 963, 1272BsmAI GTCTCnnnnn_ 3 40, 743, 1205BsmBI CGTCTCnnnnn_ 1 743BsmFI GGGACnnnnnnnnnnnnnn_ 1 827Bsp1286I G_dGChC 2 57, 1223BspCNI CTCAGnnnnnnn

23、_nn 3 31, 68, 1079BspEI TCCGG_A 3 501, 1254, 1265BsrI ACTG_Gn 4 290, 366, 618, 1220BsrBI CCGCTC 2 201, 1399BsrDI GCAATG_nn 1 1089BstF5I GGATG_nn 4 108, 641, 1077, 1251BstZ17I GTATAC 1 641Bsu36I CCTnA_GG 1 1066BtgI CCryG_G 1 859BtsI GCAGTG_nn 1 832Cac8I GCnnGC 4 25, 781, 1234, 1345ClaI ATCG_AT 3 889,

24、 979, 1440EaeI yGGCC_r 3 184, 196, 997EagI CGGCC_G 1 196EarI CTCTTCnnnn_ 1 1208EciI GGCGGAnnnnnnnnn_nn 1 306FauI CCCGCnnnnnn_ 2 1112, 1336FokI GGATGnnnnnnnnnnnnn_ 4 115, 648, 1084, 1238FspI TGCGCA 2 143, 673HaeII r_GCGCy 2 352, 1183Hin4I GAynnnnnvTCnnnnnnnn_nnnnn 3 690, 1079, 1111Hin4I GAbnnnnnrTCnn

25、nnnnnn_nnnnn 3 722, 1079, 1111HincII GTyrAC 2 259, 647HpaI GTTAAC 1 647HphI GGTGAnnnnnnn_n 1 1145Hpy8I GTnnAC 5 259, 510, 641, 647, 752Hpy188III TCnn_GA 10 75, 502, 728, 823, 908, 1191 1255, 1266, 1290, 1435HpyF10VI GCn_nnnnnnGC 11 67, 92, 418, 430, 452, 562, 571 574, 871, 997, 1099KasI GGCGC_C 2 34

26、8, 1179MboII GAAGAnnnnnnn_n 5 223, 271, 335, 531, 1195MlyI GAGTCnnnnn 2 479, 1159MmeI TCCrACnnnnnnnnnnnnnnnnnn_nn 1 643MnlI CCTCnnnnnn_n 9 311, 330, 455, 580, 692, 830, 1075 1133, 1328MscI TGGCCA 1 999MslI CAynnnnrTG 1 50MspA1I CmGCkG 3 861, 1045, 1116MwoI GCnn_nnnnnGC 11 66, 91, 417, 429, 451, 561,

27、 570 573, 870, 996, 1098NarI GGCG_CC 2 349, 1180NlaIV GGnnCC 5 84, 329, 350, 431, 1181NsiI A_TGCAT 1 19PleI GAGTCnnnnn_ 2 478, 1158PshAI GACnnnnGTC 1 735PvuI CG_ATCG 2 889, 1440PvuII CAGCTG 2 1045, 1116SacII CC_GCGG 1 862SalI GTCGA_C 1 257SfaNI GCATCnnnnnnnnn_ 5 4, 26, 542, 786, 977SfcI CTryA_G 4 38

28、0, 388, 424, 1389SfoI GGCGCC 2 350, 1181SmlI CTyrA_G 1 584TatI wGTAC_w 2 42, 507TspDTI ATGAAnnnnnnnnn_nn 5 411, 732, 802, 934, 949TspGWI ACGGAnnnnnnnnn_nn 1 1288TspRI _nnCAsTGnn 3 839, 1064, 1432Enzymes that cut five or fewer timesEnzyme Recognition frequency Positions_AccI GTmk_AC 2 258, 640AloI GA

29、ACnnnnnnTCCnnnnnnn_nnnnn 1 632AloI GGAnnnnnnGTTCnnnnnnn_nnnnn 1 600AlwI GGATCnnnnn_ 5 833, 885, 1056, 1095, 1290ApoI rAATT_y 3 333, 992, 1368BanI GGyrC_C 4 327, 348, 429, 1179BbeI G_GCGCC 2 352, 1183BbsI GAAGACnnnnnn_ 1 531BceAI ACGGCnnnnnnnnnnnnnn_ 3 199, 211, 540BcgI CGAnnnnnnTGCnnnnnnnnnn_nn 3 10

30、03, 998, 1294BcgI GCAnnnnnnTCGnnnnnnnnnn_nn 3 969, 1032, 1260BclI TGATC_A 1 1094BfrBI ATGCAT 1 17BglI GCCn_nnnnGGC 1 91BmrI ACTGGGnnnn_n 1 371BpuEI CTTGAGnnnnnnnnnnnnnn_nn 1 605BsaHI GrCG_yC 2 349, 1180BsaJI CCnnG_G 2 859, 1309BsaWI wCCGG_w 3 501, 1254, 1265BsaXI ACnnnnnCTCCnnnnnnn_nnn 1 215BsaXI GG

31、AGnnnnnGTnnnnnnnnn_nnn 1 185BseMII CTCAGnnnnnnnn_nn 3 30, 67, 1080BseRI GAGGAGnnnnnnnn_nn 1 1155BseYI CCCAG_C 1 1045BsgI GTGCAGnnnnnnnnnnnnnn_nn 1 559BsiEI CG_ryCG 3 199, 889, 1440BsiHKAI G_wGCwC 2 57, 1223BslI CCnn_nnnnnGG 4 81, 449, 963, 1272BsmAI GTCTCnnnnn_ 3 40, 743, 1205BsmBI CGTCTCnnnnn_ 1 74

32、3BsmFI GGGACnnnnnnnnnnnnnn_ 1 827Bsp1286I G_dGChC 2 57, 1223BspCNI CTCAGnnnnnnn_nn 3 31, 68, 1079BspEI TCCGG_A 3 501, 1254, 1265BsrI ACTG_Gn 4 290, 366, 618, 1220BsrBI CCGCTC 2 201, 1399BsrDI GCAATG_nn 1 1089BstF5I GGATG_nn 4 108, 641, 1077, 1251BstZ17I GTATAC 1 641Bsu36I CCTnA_GG 1 1066BtgI CCryG_G

33、 1 859BtsI GCAGTG_nn 1 832Cac8I GCnnGC 4 25, 781, 1234, 1345ClaI ATCG_AT 3 889, 979, 1440EaeI yGGCC_r 3 184, 196, 997EagI CGGCC_G 1 196EarI CTCTTCnnnn_ 1 1208EciI GGCGGAnnnnnnnnn_nn 1 306FauI CCCGCnnnnnn_ 2 1112, 1336FokI GGATGnnnnnnnnnnnnn_ 4 115, 648, 1084, 1238FspI TGCGCA 2 143, 673HaeII r_GCGCy

34、2 352, 1183Hin4I GAynnnnnvTCnnnnnnnn_nnnnn 3 690, 1079, 1111Hin4I GAbnnnnnrTCnnnnnnnn_nnnnn 3 722, 1079, 1111HincII GTyrAC 2 259, 647HpaI GTTAAC 1 647HphI GGTGAnnnnnnn_n 1 1145Hpy8I GTnnAC 5 259, 510, 641, 647, 752KasI GGCGC_C 2 348, 1179MboII GAAGAnnnnnnn_n 5 223, 271, 335, 531, 1195MlyI GAGTCnnnnn

35、 2 479, 1159MmeI TCCrACnnnnnnnnnnnnnnnnnn_nn 1 643MscI TGGCCA 1 999MslI CAynnnnrTG 1 50MspA1I CmGCkG 3 861, 1045, 1116NarI GGCG_CC 2 349, 1180NlaIV GGnnCC 5 84, 329, 350, 431, 1181NsiI A_TGCAT 1 19PleI GAGTCnnnnn_ 2 478, 1158PshAI GACnnnnGTC 1 735PvuI CG_ATCG 2 889, 1440PvuII CAGCTG 2 1045, 1116SacI

36、I CC_GCGG 1 862SalI GTCGA_C 1 257SfaNI GCATCnnnnnnnnn_ 5 4, 26, 542, 786, 977SfcI CTryA_G 4 380, 388, 424, 1389SfoI GGCGCC 2 350, 1181SmlI CTyrA_G 1 584TatI wGTAC_w 2 42, 507TspDTI ATGAAnnnnnnnnn_nn 5 411, 732, 802, 934, 949TspGWI ACGGAnnnnnnnnn_nn 1 1288TspRI _nnCAsTGnn 3 839, 1064, 1432Enzymes tha

37、t do not cut:_AarI, AatII, Acc65I, AclI, AfeI, AflII, AflIII, AgeI, AhdI, AleI, AlwNI, ApaIApaLI, AscI, AseI, AsiSI, AvaI, AvrII, BaeI, BaeI, BamHI, BanII, BbvCI, BciVIBglII, BlpI, Bme1580I, BmgBI, BmtI, BplI, BpmI, Bpu10I, BsaI, BsaAI, BsaBI, BsiWIBsmI, BspHI, BspMI, BsrFI, BsrGI, BssHII, BssSI, Bs

38、tAPI, BstBI, BstEII, BstXIBstYI, DraI, DraIII, DrdI, Eco57I, EcoICRI, Eco57MI, EcoNI, EcoO109I, EcoRI, EcoRVFalI, FseI, FspAI, HgaI, HindIII, KpnI, MfeI, MluI, NaeI, NcoI, NdeI, NgoMIV, NheINotI, NruI, NspI, PacI, PciI, PflMI, PmeI, PmlI, PpiI, PpiI, PpuMI, PsiI, PspOMIPsrI, PsrI, PstI, RsrII, SacI,

39、 SanDI, SapI, SbfI, ScaI, SexAI, SfiI, SgrAI, SmaISnaBI, SpeI, SphI, SrfI, SspI, StuI, StyI, SwaI, TaqII, TaqII, Tth111I, XbaI, XcmIXhoI, XmaI, XmnI, ZraI碱基同源性分析DQ286392序列的BLASTX分析结果（见图1）：图1DQ286392序列的BLASTX分析结果 Score ESequences producing significant alignments: (Bits) Valuegi|82659769|gb|ABB88954.1| mannanase Armillariella tabescens 768 0.0 gi|7208638|emb|CAB76904.1| CEL4a mannanase Agaricus bisporus 532 2e-149gi|1679597|emb|CAA90423.1| CEL4b mannanase Agaricus bisporus 528 3e-148gi|11062