第六节免疫标记技术

1、第十一章 血清学试验 第六节 免疫标记技术 免疫标记 技术是利用抗原抗体反响的特异性和标记分子极易检测的高度敏 感性相结合形成的试 验技术。 免疫标记技术主要有荧光抗体标记技术、 酶标抗体 技术和同位素标记抗体 技术。它们的敏感性和特异性大大超过常规血清学方法， 现已广泛用于传染病的诊断、 病原微生物的鉴定、 分子生物学中基因表达产物分 析等领域。 其中酶标抗体技术最 为简便， 应用较广。 这里主要介绍荧光抗体标记 技术和酶标抗体技术。一、荧光抗体标记技术荧光抗体标记技术 fluorescent-labelled antibody technicque 是用荧 光色素 标记在抗体或抗原上， 与

2、相应的抗原或抗体特异性结合， 然后用荧光显微 镜观察所 标记的荧光，以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。一原理 荧光素在 10-6 的超低浓度时，仍可被专门的短波光源激发，在荧光显微镜下可观察到荧光。荧光抗体标记技术就是将抗原抗体反响的特异性、 荧光检测 的高敏性、以及显微镜技术的精确性三者结合的一种免疫检测技术。二荧光色素 荧光色素是能产生明显荧光， 又能作为染料使用的有机化 合物。 主要是以苯环为根底的芳香族化合物和一些杂环化合物。 它们受到激发光 如紫外 光 照射后，可发射荧光。可用于标记的荧光色素有异硫氰酸荧光黄 FITC 、四乙基罗丹明 RB 200 和四甲基异硫氰酸罗丹明 TMRIT

3、C 。其中 FITCM 用最广，为黄色结晶，最大吸 收 光波长为490? 495nm,最大发射光波长520? 530nm可呈现明亮的黄绿色荧光。FITC 分子中含有异硫氰基，在碱性 pH9.0? 9.5条件下能与 IgG 分子的自由氨基 结合， 形成 FITC-IgG 结合物，从而制成荧光抗体。抗体经荧光色素标记后， 不影响与抗原的结合能力和特异性。 当荧光抗体与 相 应的抗原结合时， 就形成了带有荧光性的抗原抗体复合物， 从而可在荧光显微 镜下 检出抗原的存在。三荧光抗体染色及荧光显微镜检查 1标本片的制备 标本制作的要求首先 是保持抗原的完整性，并尽可能减 少形态变化， 抗原位置保持不变。

4、 同时还必须使 抗原标记抗体复合物易于接受激 发光源，以便很好地观察和记录。 这就要求标本要 相当薄， 并要有适宜的固定处 理方法。根据被检样品的不同，采用不同的制备方法。细菌培养物、血液、脓汁、粪 便、 尿沉渣及感染的动物组织等， 可制成涂片或压印片。 感染组织最好制成冰冻 切片或 低温石蜡切片。也可用生长在盖玻片上的单层细胞培养作标本。标本的固定有两个目的， 一是防止被检材料从玻片上脱落， 二是消除抑制抗 原 抗体反响的因素。最常用的固定剂是丙酮和 95%勺乙醇。固定后用 PBS 反复冲洗, 干 后即可用于染色。2染色方法 荧光抗体染色法有多种类型， 常用的有直接法和间接法两种。1直接法

5、取待检抗原的标本片，滴加荧光抗体染色液于其上，置湿盒 中，于 37C作用30min ,用pH7.2的PBS?漂洗15min ,冲去游离的染色液，枯燥后 滴加缓冲 甘油分析纯甘油 9 份加 PBS1 份封片，在荧光显微镜下观察。标本片 中假设有相应抗原存在， 即可与荧光抗体结合， 在镜下见有荧光抗体围绕在受检的 抗原周围，发 出黄绿色荧光 图 11-8 。直接法应设以下对照，标本自发荧光对照，阳性标本和阴性标本对照。该方法优点是简便、特异性高，非特异性荧光染 色少。缺点是敏感性 偏低，而且每检一种抗原就需要制备一种荧光抗体。2间接法 取待检抗原的标本，首先滴加特异性抗体，置湿盒中，于37C 作用

6、30min ,用pH7.2的PBS?漂洗后，再滴加荧光色素标记的第 2抗体抗抗体染 色，再置湿盒中，于37E作用30min,用PBS?漂洗，枯燥后封片镜检。阳性者 形成 抗原 -抗体-荧光抗抗体复合物 ,发黄绿色荧光 图 11-9 。间接法对照除自 发荧光、 阳性和阴性对照外， 首次试验时应设无中间层对照 标本加标记抗抗体 和阴性血 清对照中间层用阴性血清代替特异性抗血清。间接法的优点是， 比直接法敏感， 对一种动物而言， 只需制备一种荧光抗抗 体， 即可用于多种抗原或抗体的检测，镜检所见荧光也比直接法明亮。3抗补体法 将抗血清与补体等量混合，滴加于待检抗原的标本片上， 使 其形成抗原 -抗体

7、-补体复合物，漂洗后再滴加荧光标记的抗补体抗体染色 ?， 感作一 定时间，漂洗、枯燥后镜检。此法特异性和敏感性均高，但易产生非特异 性荧光。3荧光显微镜检查 标本滴加缓冲甘油后用盖玻片封载，即可在荧光显微 镜下观 察。 荧光显微镜不同于光学显微镜之处， 在于它的光源是高压汞灯或溴钨 灯，并有 一套位于集光器与光源之间的激发滤光片， 它只让一定波长的紫外光及 少量可见光 蓝紫光通过。此外，还有一套位于目镜内的屏障滤光片，只让激 发的荧光通过， 而不让紫外光通过， 以保护眼睛并能增加反差。 为了直接观察微 量滴定板中的抗原 抗体反响， 如感染细胞培养物上的荧光， 可使用现已有商品的 倒置荧光显微镜

8、观察。四荧光抗体标记技术的应用 荧光抗体标记技术具有快速、 操作简单的 特 点，同时又有较高的敏感性、特异性和直观性，已广泛用于细菌、病毒、原虫 的鉴定 和传染病的快速诊断。 此外还可用于淋巴细胞外表抗原的测定和自身免疫 病的诊断 等方面。1细菌病诊断 能利用荧光抗体标记技术直接检出或鉴定的细菌约有 30 余 种， 均具有较高的敏感性和特异性， 其中较常应用的是链球菌、 致病性大肠杆菌、 沙门 氏菌、马鼻疽杆菌、猪丹毒杆菌等。动物的粪便、黏膜拭子涂片、病变部渗 出物、体 液或血液涂片、病变组织的触片或切片以及尿沉渣均可作为检测样本， 经直接法检出 目的菌，这对于细菌病的诊断具有很高的价值。2病

9、毒病诊断 用荧光抗体标记技术直接检出患畜病变组织中的病毒，已 成为病 毒感染快速诊断的重要手段， 如猪瘟、 鸡新城疫等可取感染组织做成冰冻 切片或触 片，用直接或间接免疫荧光染色可检出病毒抗原，一般可在 2h 内作出诊断报告；猪流行性腹泻在临床上与猪传染性肠胃炎十分相似，将患病小猪小肠冰 冻切片，用猪流行性腹泻病毒的特异性荧光抗体做直接免疫荧光检查， 即可对猪 流行 性腹泻进行确诊。二、酶标抗体技术酶标抗体技术 enzyme-labelled antibody technicque 是继免疫荧光技 术之 后开展起来的一大新型的血清学技术， 目前该技术已成为免疫诊断、 检测和 分子生 物学研究中

10、应用最广泛的免疫学方法之一。一原理 酶标抗体技术是根据抗原抗体反响的特异性和酶催化反响的高 度敏 感性而建立起来的免疫检测技术。 酶是一种有机催化剂， 催化反响过程中不 被消耗， 能反复作用， 微量的酶即可导致大量的催化过程， 如果产物为有色可见 产物，那么极 为敏感。酶标抗体技术的根本程序是： 将酶分子与抗原或抗体分子共价结合， 这种 结 合既不改变抗体的免疫反响活性， 也不影响酶的催化活性。 将此种酶标记的 抗体 抗抗体与存在于组织细胞或吸附在固相载体上的抗原抗体发生特异 性结合， 并洗下未结合的物质。滴加底物溶液后，底物在酶作用下水解呈色；或者底物不呈色， 但在底物水解过程中由另外的供氢

11、体提供氢离子， 使供氢体由 无色的复原型 变为有色的氧化型， 呈现颜色反响。 因而可通过底物的颜色反响来 判定有无相应的 免疫反响发生。 颜色反响的深浅与标本中相应抗原 抗体的量 呈正比。此种有色 产物可用肉眼或在光学显微镜或电子显微镜下看到， 或用分光 光度计加以测定。 这 样，就将酶化学反响的敏感性和抗原抗体反响的特异性结合 起来，用以在细胞或亚细 胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位， 或在微克、 纳克 水平上测定它们的量。 所 以，本法既特异又敏感， 是目前应用最为广泛的一种免 疫检测方法之一。二用于标记的酶 用于标记的酶有辣根过氧化物酶 HRP 、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等，其中以 HR

12、 应用最广泛，其次是碱性磷酸酶。 HR 广泛分布于植 物 界，辣根中含量最高。 HR 是由无色的酶蛋白和深棕色的铁卟啉构成的一种糖 蛋白， 分子量为 40 000 。 HRP 勺作用底物是过氧化氢，常用的供氢体有邻苯二胺0PD和 33-二氨基联苯胺 DAB ，二者作为显色剂。因为它们能在 HR 催化 HQ 生成 HO 过程中提供氢，而自己生成有色产物。QP 氧化后形成可溶性产物， 呈橙色，最大吸收波长为 492nm 可用肉眼判定。 QP 不稳定，须现用现配，常作为酶联免疫吸附试验中的显色剂。QP 有致癌性，操作时应予注意。 DA 反响后形成不溶性的棕色物质，可用光学显微镜和肉眼观 察， 适用于

13、各种免疫酶组织化学染色法。HR 可用戊二醛交联法或过碘酸盐氧化法将其标记于抗体分子上制成酶标抗体。生产中常用的酶标抗体技术有免疫酶组织化学染色法和酶联免疫吸附试验两 种。三免疫酶组织化学染色技术 又称免疫酶染色法。 是将酶标记的抗体应 用 于组织化学染色， 以检测组织和细胞中或固相载体上抗原或抗体的存在及其分 布位置的技术。 图 11-10 。1 标本制备和处理 用于免疫酶染色的标本有组织切片冷冻切片或低温 石蜡切 片、组织压印片、涂片以及细胞培养的单层细胞盖片等。这些标本的制 备和固定与 荧光抗体技术相同，但尚要进行一些特殊处理。用酶结合物作细胞内抗原定位时，由于组织和细胞内含有内源性过氧化

14、酶， 可与 标记在抗体上的过氧化物酶在显色反响上发生混淆。 因此，在滴加酶结合物 之前通 常将制片浸于0.3% HO2中室温处理15?30min,以消除内原酶。应用1%- 3%HO甲醇 溶液处理单纯细胞培养标本或组织涂片， 低温条件下作用 10? 15min , 可同时起到固定和消除内原酶的作用 , 效果比拟好。组织成分对球蛋白的非特异性吸附所致的非特异性背景染色，可用10% 卵蛋 白作用30min进行处理，用0.05%吐温-20和含1%牛血清白蛋白BSA的PBS寸细 胞 培养标本进行处理，同时可起到消除背景染色的效果。2 染色方法 可采用直接法、间接法、抗抗体搭桥法、杂交抗体法、酶抗 酶复合

15、 物法、 增效抗体法等各种染色方法， 其中直接法和间接法最常用。 反响中 每加一 种反响试剂，均需于37C作用30min,然后以PBS反复洗涤三次，以除去 未结合物。 1 直接法 以酶标抗体处理标本，然后浸入含有相应底物和显色剂的反 应 液中，通过显色反响检测抗原抗体复合物的存在。 2间接法 标本首先用相应的特异性抗体处理后， 再加酶标记的抗抗体， 然 后经显色揭示抗原 - 抗体- 抗抗体复合物的存在。3 显色反响 免疫酶组化染色中的最后一环是用相应的底物使反响显色。不同的酶所用底物和供氢体不同。同一种酶和底物如用不同的供氢体，那么其反 应物的 颜色也不同。如辣根过氧化物酶，在组化染色中最常用

16、DAB 用前应以0.05%mol/L,pH7.4 ? 7.6 的 Tris-HCI 缓冲液配成 50? 75mg/100m 溶液，并加少量约0.01%? 0.03% HO2混匀后加于反响物中置室温10? 30min ,反响产物呈深 棕 色；如用甲萘酚，那么反响产物呈红色，用4-氯-1- 萘酚, 那么呈浅蓝色或蓝色。4 .标本观察 显色后的标本可在普通显微镜下观察，抗原所在部位DAB!色 呈棕黄色。 亦可用常规染料作反衬染色， 使细胞结构更为清晰， 有利于抗原的定 位。 本法优于免疫荧光抗体技术之处， 在于毋须应用荧光显微镜， 且标本可以长 期保存。四酶联免疫吸附试验 Enzyme linked

17、 immunosorbent assay， ELISA ELISA 是应用最广、开展最快的一项新技术。其根本过程是将抗原或抗体吸附于固相载体， 在载体上进行免疫酶反响， 底物显色后用肉眼或分光光度计判定结 果。1 固相载体 有聚苯乙烯微量滴定板、聚苯乙烯球珠等。聚苯乙烯微量滴 定板 40 孔或 96 孔板是目前最常用的载体，小孔呈凹形，操作简便，有利于 大批样 品的检测。新板在应用前一般无需特殊处理，直接使用或用蒸馏水冲洗 干净，自然干 燥后备用。一般均一次性使用，如用已用过的微量滴定板，需进 行特殊处理用于ELISA的另一种载体是聚苯乙烯珠，由此建立的ELISA又称微球ELISA。珠 的直径

18、 0.5? 0.6cm, 外表经过处理以增强其吸附性能，并可做成不同颜色。此 小珠可 事先吸附或交联上抗原或抗体， 制成商品。检测时将小球放人特制的凹 孔板或小管中， 参加待检标本将小珠浸没进行反响，最后在底物显色后比色测 定。本法现已有半自动 化装置，用以检验抗原或抗体，效果良好。2包被 将抗原或抗体吸附于固相外表的过程，称载体的致敏或包被。用 于包被 的抗原或抗体，必须能牢固地吸附在固相载体的外表，并保持其免疫活 性。大多数蛋 白质可以吸附于载体外表，但吸附能力不同。可溶性物质或蛋白 质抗原，例如病毒蛋 白、细菌脂多糖、脂蛋白、变性的DN 等均较易包被上去。较大的病毒、细菌或寄生虫等难以吸

19、附，需要将它们用超声波打碎或用化学方 法提取 抗原成分，才能供试验用。用于包被的抗原或抗体需纯化，纯化抗原和抗体是提高 ELISA 敏感性与特异 性的关键。抗体最好用亲和层析和 DEA 纤维素离子交换层析方法提纯。有些抗 原含 有多种杂蛋白，须用密度梯度离心等方法除去，否那么易出现非特异性反响。蛋白质抗原或抗体很易吸附于未使用过的载体外表，适宜的条件更有利 于该 包被过程。包被的蛋白质数量通常为 1? 10 卩 g/ml 。高 pH 值和低离子强度缓 冲液一 般有利于蛋白质包被，通常用 0.1mol/L pH9.6 碳酸盐缓冲液作包被液。 一般包被均 在4C过夜，也有经37C 2? 3h到达最

20、大反响强度。包被后的滴定板 可置于4C冰箱， 可贮存 3 周。如真空塑料封口，于 -20 C 冰箱可贮存更长时间。 用时充分洗涤。3?洗涤 在 ELISA 的整个过程中，需进行屡次洗涤，目的是防止重叠反响，防止引起非特异吸附现象。 因此，洗涤必须充分。通常采用含助溶剂吐温 -20 最 终质 量分数为 0.05% 的 PBS 乍洗涤液。洗涤时，先将前次参加的溶液倒空，吸 干，然 后参加洗涤液洗涤 3 次，每次 3min, 倒空，并用滤纸吸干。4?试验方法 ELISA 的核心是利用抗原抗体的特异性吸附，在固相载体上一层层地叠加， 可以是两层、 三层甚至多层。 整个反响都必须在抗原抗体结合的最 适

21、条件下进行。每层试剂均稀释于最适和抗原抗体反响的稀释液0.01 ?0.05mol/L pH7.4 PBSA加吐温-20至0.05%, 10賑牛血清或1%BSA中，参加后置4C 过夜或37E 1? 2h。每加一层反响后均需充分洗涤。阳性、阴性应有明显区别。阳性血清颜色深，阴性血清颜色浅， 二者吸收值的比值最大时的浓度为最适浓度， 试验 方法主要有以下几种 图 11-11 。1 间接法 用于测定抗体。用抗原包被固相载体，然后参加待检血清样品，经 孵育一定时间后，假设待检血清中含有特异性的抗体，即与固相载体外表 的抗原结合形 成抗原 - 抗体复合物。洗涤除去其他成分， 再加上酶标记的抗抗体， 反响后

22、洗涤， 参加底物，在酶的催化作用下底物发生反响，产生有色物质。样 品中含抗体越多，出 现颜色越快越深。2夹心法 又称双抗体法，用于测定大分子抗原。将纯化的特异性抗体 包 被于固相载体，参加待检抗原样品，孵育后，洗涤，再参加酶标记的特异性 抗体，洗 涤除去未结合的酶标抗体结合物，最后参加酶的底物，显色，颜色的 深浅与样品中的 抗原含量成正比。3 双夹心法 用于测定大分子抗原。此法是采用酶标抗抗体检测多种大分子抗原，它不仅不必标记每种抗体，还可提高试验的敏感性。将抗体 如豚鼠免疫血清 Ab1 吸附在固相载体上，洗涤除去未吸附的抗体，参加待测抗原Ag样品，使之与固相载体上的抗体结合，洗涤除去未结合的

23、抗原，参加不同种动物制备的特异性相同的抗体如兔免疫血清 Ab2, 使之与固相载体上的抗原结 合，洗涤后 参加酶标记的抗 Ab2抗体如羊抗兔球蛋白Ab3，使之结合在Ab2上。结果形成 Ab1-Ag-Ab2-Ab3-HRF 复合物。洗涤后加底物显色，呈色反响的深 浅与样品中的抗原 量呈正比。5 酶标抗原竞争法 用于测定小分子抗原及半抗原。 用特异性抗体包被固 相 载体，参加含待测抗原的溶液和一定量的酶标记抗原共同孵育，对照仅加酶 标抗原， 洗涤后参加酶底物。被结合的酶标记抗原的量由酶催化底物反响产生 有色产物的量来 确定。 如待检溶液中抗原越多， 被结合的酶标记抗原的量越少， 显色就越浅。可用 不

24、同浓度的标准抗原进行反响绘制出标准曲线， 根据样品的 ODS 求出检测样品中抗原 的含量。6PPA-ELISA 以 HR 标记 SPAt 替间接法中的酶标抗抗体进行的 ELISA 见 实训十五。因SPA 葡萄球菌蛋白A能与多种动物的IgGFc片段结合，可用HR 标记制成酶标记 SPA 而代替多种动物的酶标抗抗体，该制剂有商品供给。此外，还有酶 -抗酶抗体法、酶标抗体直接竞争法、 酶标抗体间接竞争法等。5 底物显色 与免疫酶组织化学染色法不同， 本法必须选用反响后的产物 为水溶性色素的供氢体，最常用的为邻苯二胺OPD，产物呈棕色，可溶，敏感 性高，但对光敏感 , 因此要避光进行显色反响。 底物溶液应现用现配。底物显色 以室温 10 ?20min为宜。反响结束，每孔加浓硫酸50卩终止反响。也常用四甲基 联苯胺TMB 为供氢体，其产物为蓝色，用氰氟酸终止 如用 HS0 终止，贝 U 为