中药复方药效研究新思路

1、中药复方药效研究新思路中药复方药效研究新思路 从银翘散展开来说从银翘散展开来说银翘散源于清代医家吴鞠通所著5温病条辨6卷 一, 是治疗风温、温热以及某些杂病属于邪在卫分、 上焦, 治当辛凉清解者的代表方剂。现代用于治疗 流行性感冒、急性扁桃体炎、咽峡疱疹、麻疹、流行性 腮腺炎等病毒感染性疾病, 为中医临床广泛应用、疗效确切的中药复方之一。 小组成员: 宋宇翔 靳贵林 席亚丽 牛亭惠 马小兵 方剂方剂 【方名方名】 银翘散银翘散 【别名别名】银翘解毒散银翘解毒散 【出处出处】 温病条辨温病条辨卷一。卷一。 【分类分类】 解表剂解表剂- -辛凉解表辛凉解表 【组成组成】 连翘一两（连翘一两（303

2、0克）克） 银花一两（银花一两（3030克）克） 苦苦桔梗六钱（桔梗六钱（1818克）克） 薄荷六钱（薄荷六钱（1818克）克） 竹叶四钱（竹叶四钱（1212克）克） 生甘草五钱（生甘草五钱（1515克）克） 荆芥穗四钱（荆芥穗四钱（1212克）克） 淡豆豉五钱淡豆豉五钱（1515克）克） 牛蒡子六钱（牛蒡子六钱（1818克）克） 【用法用法】上杵为散，每服六钱（上杵为散，每服六钱（1818克），鲜苇根汤煎，克），鲜苇根汤煎，香气大出，即取服，勿过煮。肺药取轻清，过煮则味厚而香气大出，即取服，勿过煮。肺药取轻清，过煮则味厚而人中焦矣。病重者，约二时一服，日三服，夜一服；轻者人中焦矣。病重者，约

3、二时一服，日三服，夜一服；轻者三时一服，日二服，夜一服三时一服，日二服，夜一服- -病不解者，作再服。（现代病不解者，作再服。（现代用法：加入芦根适量，水煎服，用量按原方比例酌情增用法：加入芦根适量，水煎服，用量按原方比例酌情增减。）减。） 【方歌方歌】 银翘散治上焦疴，竹叶荆蒡豉薄荷；甘桔银翘散治上焦疴，竹叶荆蒡豉薄荷；甘桔芦根凉解法，辛凉平剂用时多。芦根凉解法，辛凉平剂用时多。 【功用功用】 辛凉透表，清热解毒。辛凉透表，清热解毒。 银翘散的现代研究银翘散的现代研究 材料与方法材料与方法 仪器：美国仪器：美国WatersWaters高效液相色谱仪高效液相色谱仪(515(515泵泵, , 2

4、4872487检测器）检测器）,Millennium32,Millennium32色谱工作站色谱工作站 ););美国美国PEPE液相色谱液相色谱/ /质谱联用仪质谱联用仪(PE Serials (PE Serials 200200型液相色谱仪型液相色谱仪,PE SciexAPI3000,PE SciexAPI3000型串连型串连三级四极杆质谱仪三级四极杆质谱仪 );TU-1800);TU-1800型紫外分光型紫外分光光度计光度计( (北京普析通用仪器有限责任公北京普析通用仪器有限责任公司司 ) ) 。 银翘散抗流感病毒有效部位银翘散抗流感病毒有效部位(EFY)(EFY)自制自制; ;乙乙腈为色

5、谱纯腈为色谱纯, ,水为重蒸水水为重蒸水, ,其他试剂均为分其他试剂均为分析纯。内标物香草醛为分析纯析纯。内标物香草醛为分析纯( (含量含量99.19% ); 99.19% ); 对照品绿原酸、甘草苷、甘草对照品绿原酸、甘草苷、甘草素素-4c-O-4c-O-芹糖芹糖(12)(12)葡糖苷、异甘草素葡糖苷、异甘草素-4-4-O-O-芹糖芹糖(12)(12)葡糖苷、异甘草素葡糖苷、异甘草素-2c-O-2c-O-芹芹糖糖(12)(12)葡糖苷、连翘酯苷、芦丁、葡糖苷、连翘酯苷、芦丁、4, 5-4, 5-二咖啡酰基奎宁酸、二咖啡酰基奎宁酸、3 3、5-5-二咖啡酰基奎宁二咖啡酰基奎宁酸、酸、3, 4-

6、3, 4-二咖啡酰基奎宁酸、牛蒡子苷、二咖啡酰基奎宁酸、牛蒡子苷、醉鱼草苷、染料木素及异甘草素由银翘散醉鱼草苷、染料木素及异甘草素由银翘散抗流感病毒有效部位中分得。抗流感病毒有效部位中分得。 色谱条件色谱条件 色谱柱色谱柱:YWG-C18(250mm-416 :YWG-C18(250mm-416 mmID,10mL);mmID,10mL);流动相流动相: :乙腈乙腈-3%-3%醋酸水溶液醋酸水溶液梯度梯度 洗脱洗脱(0-5min,(0-5min,乙腈比例乙腈比例:5%10%;5-:5%10%;5-25min,25min,乙腈比例乙腈比例:10%;25-55min,:10%;25-55min,乙

7、腈比乙腈比例例:10%30%;55-95min,:10%30%;55-95min,乙腈比例乙腈比例: : 30%80%;95-100min,30%80%;95-100min,乙腈比例乙腈比例:80% );:80% );流速流速:110mL/min;:110mL/min;柱温柱温:25e;:25e;检测波检测波长长:280nm;:280nm;进样量进样量:10LL:10LL，理论塔板数以，理论塔板数以内标峰内标峰(S)(S)计算计算, ,不低于不低于50005000。 质谱条件质谱条件 离子源离子源: ESI;: ESI;所有实验均在负所有实验均在负离子扫描方式下进行。在离子扫描方式下进行。在L

8、C-MSLC-MS条件下条件下, ,第一级四极杆处于全扫描模式第一级四极杆处于全扫描模式, ,扫描范围扫描范围m/z10010-80010,m/z10010-80010,而第三级四极杆处于而第三级四极杆处于RF-ONLYRF-ONLY模式。在进行模式。在进行LC-MS/MSLC-MS/MS实验时实验时, , 质谱仪可在子离子扫描、多重反应监测质谱仪可在子离子扫描、多重反应监测和母离子扫描方式下工作。供试品溶液和母离子扫描方式下工作。供试品溶液的制备精密称取内标物的制备精密称取内标物( (香草醛香草醛)1115mg, )1115mg, 以以50%50%乙腈水溶液溶解乙腈水溶液溶解, ,置于置于5

9、0mL50mL量瓶量瓶, ,再再以以50%50%乙腈水溶液稀释至刻度乙腈水溶液稀释至刻度, ,经经0.145Lm0.145Lm滤膜滤过滤膜滤过, ,备用。备用。 精密称取精密称取EFY6416mgEFY6416mg并以适量并以适量50%50%乙腈水乙腈水溶液超声使之溶解溶液超声使之溶解, ,完全转移至完全转移至10mL10mL量瓶量瓶, , 以以50%50%乙腈水溶液稀释至刻度乙腈水溶液稀释至刻度, ,经经0.145mL0.145mL滤膜滤过滤膜滤过, ,备用。精密吸取备用。精密吸取EFYEFY溶液溶液8mL, 8mL, 内标物溶液内标物溶液2mL,2mL,混合均匀混合均匀, ,即得供试品溶即

10、得供试品溶液。金银花、连翘、牛蒡子、桔梗、薄液。金银花、连翘、牛蒡子、桔梗、薄荷、淡竹叶、甘草、荆芥及淡豆豉均按荷、淡竹叶、甘草、荆芥及淡豆豉均按银翘散有效部位制备工艺方法银翘散有效部位制备工艺方法, , 制备相制备相应的药材供试溶液。阴性溶液的制备依应的药材供试溶液。阴性溶液的制备依据各单味药在银翘散组方中的配比据各单味药在银翘散组方中的配比, , 除除去某单味药而制成相应的阴性溶液。去某单味药而制成相应的阴性溶液。 特征指纹图谱建立特征指纹图谱建立 考察考察150minEFY150minEFY的色的色谱分离情况谱分离情况, ,记录记录100min100min色谱图色谱图, ,以色谱以色谱图

11、中峰图中峰S(S(香草醛香草醛) )为内标为内标, ,令其保留时间令其保留时间为为1,1,以峰以峰19(19(牛蒡子苷牛蒡子苷) )为参照为参照, ,令其峰面令其峰面积为积为1,1,其他各峰的保留时间和峰面积分其他各峰的保留时间和峰面积分别与内标峰的保留时间和参照峰的峰面别与内标峰的保留时间和参照峰的峰面积相比较积相比较, ,作为各峰的相对保留时间和相作为各峰的相对保留时间和相对峰面积。组分归属分析及主要色谱峰对峰面积。组分归属分析及主要色谱峰的指认依据各单味药在特征指纹图谱中的指认依据各单味药在特征指纹图谱中色谱保留时间信息及其阴性样品的考察色谱保留时间信息及其阴性样品的考察, ,从而实现在

12、相同的实验条件下所得的色从而实现在相同的实验条件下所得的色谱指纹图谱中单味药与复方目标物质的谱指纹图谱中单味药与复方目标物质的相对归属分析。相对归属分析。 通过通过LC-MS/MSLC-MS/MS对主要色谱峰碎片离对主要色谱峰碎片离子的解析及添加对照品子的解析及添加对照品 绿原酸、甘绿原酸、甘草苷、甘草素草苷、甘草素-4c-O-4c-O-芹糖芹糖(12)(12)葡葡糖苷、异甘草素糖苷、异甘草素-4-O-4-O-芹糖芹糖(12)(12)葡葡糖苷、异甘草素糖苷、异甘草素-2c-O-2c-O-芹糖芹糖(12)(12)葡糖苷、连翘酯苷、芦丁、葡糖苷、连翘酯苷、芦丁、4,5-4,5-二二咖啡酰基奎宁酸、

13、咖啡酰基奎宁酸、3,5-3,5-二咖啡酰基二咖啡酰基奎宁酸、奎宁酸、3,4-3,4-二咖啡酰基奎宁酸、二咖啡酰基奎宁酸、牛蒡子苷、醉鱼草苷、染料木素、牛蒡子苷、醉鱼草苷、染料木素、异甘草素的考察异甘草素的考察, , 实现对主要色谱实现对主要色谱峰的指认峰的指认。 讨论讨论 银翘散抗流感病毒有效部位所含化学成分银翘散抗流感病毒有效部位所含化学成分相当复杂相当复杂, , 本实验根据黄酮、木脂素、有本实验根据黄酮、木脂素、有机酸三大类主要成分的性质机酸三大类主要成分的性质, ,反复优化选取反复优化选取最佳色谱条件最佳色谱条件, , 结果表明结果表明, ,确定乙腈确定乙腈-3%-3%醋醋酸水溶液作为流

14、动相。由于酸水溶液作为流动相。由于EFYEFY中化学成分中化学成分极为复杂极为复杂, ,等度洗脱难以实现主要成分的分等度洗脱难以实现主要成分的分离离, ,采用梯度洗脱可以兼顾强极性和弱极性采用梯度洗脱可以兼顾强极性和弱极性成分的分析成分的分析, ,得到的信息量较为丰富得到的信息量较为丰富, ,成分成分峰形尖锐且分离度较好。峰形尖锐且分离度较好。 供试品溶液于供试品溶液于200-400nm200-400nm扫描扫描, ,发现发现EFYEFY在在230,280230,280和和320nm320nm处均有较强吸收处均有较强吸收, ,比较比较EFYEFY在上述在上述3 3个波长下的个波长下的HPLCH

15、PLC图谱图谱, , 确定确定280nm280nm为测定检测波长。本文的色谱方法可在为测定检测波长。本文的色谱方法可在100min100min内展开上述成分内展开上述成分, ,并使大部分色谱峰并使大部分色谱峰达到基线分离达到基线分离, ,由于流动相梯度变化较大由于流动相梯度变化较大, , 使得基线有些漂移。在此色谱条件下使得基线有些漂移。在此色谱条件下, ,测定测定银翘散抗流感病毒有效部位的银翘散抗流感病毒有效部位的HPLCHPLC图谱图谱, ,并并与各单味药样品色谱图比较与各单味药样品色谱图比较, ,发现它们有很发现它们有很强的相关性。强的相关性。LC-MS/MSLC-MS/MS联用技术的引

16、入联用技术的引入, ,为为中药复方复杂体系的物质基础研究提供了中药复方复杂体系的物质基础研究提供了有效的手段。有效的手段。 实验研究发现实验研究发现, ,在所建立的特征在所建立的特征HPLCHPLC图谱中图谱中4 4号峰号峰未得到归属未得到归属, ,推测可能为煎煮条件下新产生的化合推测可能为煎煮条件下新产生的化合物物, ,由于其在负离子扫描条件下由于其在负离子扫描条件下, ,色谱峰离子丰度色谱峰离子丰度太小太小, ,未给出分子离子峰及碎片未给出分子离子峰及碎片m/zm/z值值, ,目前尚难以目前尚难以确定来源确定来源, , 有待进一步研究。在丰度较大的色谱有待进一步研究。在丰度较大的色谱峰离子中发现峰离子中发现4 4个来源于甘草的分子离子峰及碎片个来源于甘草的分子离子峰及碎片峰完全一致的成分峰完全一致的成分, ,应为异构体应为异构体, ,对于未确认的对于未确认的1111号峰号峰,m/z549,m/z549为基峰为基峰,m/z255,m/z255为次强峰为次强峰,m/z