双向电泳试验试剂及溶液

1、双向电泳试验试剂及溶液所有含尿素溶液加热不能超过30去离子水或 MilliqQ水配制所有溶液。分析纯试剂，保质期内使用。推荐使用进口试剂。A. 双向电泳的样品裂解溶液( 含有尿素 )（ 8 M尿素， 4% CHAPS， 2%两性载体 Pharmalyte 或IPG缓冲液 ( 载体两性电解质 ) ， 40 mM DTT, 10 ml ）最终浓度用量尿素 (FW 60.06)8 M4.8 gCHAPS4%(w/v)0.4g两性载体 Pharmalyte或 IPG缓冲液2%(v/v)200 l（现用现加）DTT (FW 154.2) （现用现加）40 mM61.6 mg去离子水至10 ml (需要水

2、约 6.4ml)1.0ml/ 支 分装，储存于-20 条件下。 IPG buffer 和 DTT现用现加。B. 尿素水化储备溶液（ 8 M尿素， 2% CHAPS， 0.5/2% 两性载体 Pharmalyte 或 IPG缓冲液， 0.002%溴酚蓝 , 10 ml ）最终浓度用量尿素 (FW 60.06)8M4.8gCHAPS2%(w/v)0.2g1%溴酚蓝储备溶液0.002%20l去离子水至 10ml( 需要水约 6.4ml)分装为 1.0ml 溶液储存于 -20条件下。使用前加入 DTT，每 1.0ml 水化储备溶液中加入2.8mgDTT(FW 154.2 ， 1.8mM)。使用前加入与

3、 IPG胶条的范围相同 IPG buffer，终浓度 0.5%(v/v) 。C. SDS平衡缓冲液(6 M 尿素， 75 mM Tris-HCl pH8.8,29.3%甘油 , 2%SDS,0.002% 溴酚蓝 ,100ml)最终浓度用量尿素 (FW 60.06)6 M36.1 gTris-HCl, pH 8.8 (参见溶液 F部分 )75 mM5.0 ml甘油 (87% w/w)29.3% (v/v)34.5 ml (84.2 g)SDS (FW 288.38)2% (w/v)2.0 g1%溴酚蓝储备溶液0.002% (w/v)200 l去离子水至 100 ml这是储备溶液。在使用之前，按照

4、一定量加入1%DTT（ 100mg/10ml ）或 2.5%碘乙酰胺（250mg/10ml ），分别用于第一次和第二次平衡。Max用量 10ml/ 胶条。分装 20mL/支，储存于 -20 条件下。D. 10 ×Laemmli SDS 电泳缓冲液(250 mM Tris碱， 1.92M甘氨酸， 1% SDS， 1.0L)最终浓度用量Tris 碱 (FW 121.1)250 mM30.3 g甘氨酸 (FW 75.07)1.92 M144.1 gSDS (FW 288.38)1% (w/v)10.0 g去离子水至 1.0L* 不要调节该溶液的 pH值。室温储存。E. 30% T, 2.6

5、% C单体储液(30%丙烯酰胺， 0.8% N, N - 甲叉双丙烯酰胺，500ml)最终浓度用量丙烯酰胺 (FW 71.08)30%150 gN,N - 甲叉双丙烯酰胺 (FW 154.17)0.8%4 g去离子水至 500mL用0.45 m滤膜过滤溶液，4避光储存。F. 4 ×分离胶缓冲液(1.5M Tris碱， pH8.8 ， 200mL)最终浓度用量Tris 碱 (FW 121.1)1.5 M36.3g去离子水150 mlHClaq调至 pH8.8去离子水至 200mL用0.45 m滤膜过滤溶液， 4存储。G溴酚蓝储备溶液最终浓度用量溴酚蓝1%100 mgTris- 碱50

6、mM60 mg去离子水至10 mLH. 10% SDS溶液(10% SDS, 20 ml)最终浓度用量SDS (FW 288.38)10% (w/v)2.0 g去离子水至 20 ml用0.45 m滤膜过滤溶液，室温存储。I. 10% 过硫酸铵溶液(10%过硫酸铵 , 5 ml)最终浓度1 ml 用量1.5ml EP 管5支，每支加入过硫酸铵 (FW 228.20)10% (w/v)0.1 g去离子水（现用现加）至 1 ml新鲜的过硫酸铵在加入水时发出“劈啪”声，若没有声音，请更换过硫酸铵。J.琼脂糖密封液(25mM Tris 碱 , 192mM甘氨酸 , 0.1% SDS, 0.5%琼脂糖 ,

7、 0.002%溴酚蓝 , 10ml)最终浓度用量10xLaemmli 电泳缓冲液1 ml（见溶液 D）琼脂糖 (NA 或M)0.5%0.05 g1%溴酚蓝储备溶液0.002% (w/v)20 l去离子水至 10 ml将所有成分加入到 50ml 的烧瓶中。轻轻地摇晃，使成分混匀。加热直至琼脂糖完全溶解。不要让溶液爆沸。以 1.5ml 为单位分装至带有螺旋帽的管内，室温保存。K. 水饱和正丁醇用量正丁醇5 ml水1ml摇匀后静置分层，使用上层。根据凝胶大小和灌制数量酌情增减最终体积。以下银染与考染两种染色方法任选其一快速银染操作流程一、银染试剂每块凝胶需要固定液、敏化液、银染液、显色液、终止液各2

8、50ml，漂洗液500ml，去离子水 2.5L 。1. 固定液：乙醇：冰醋酸：水 =5：1：42. 漂洗液： 30%乙醇3. 敏化液： 2.5mmol/L 硫代硫酸钠（ 0.62g/L Na 2S2O3· 5H2O）4. 银染液： 0.5g AgNO3 溶于 200l 甲醛中，用去离子水定容至250ml，避光保存。（先配好不含甲醛的储备液，临用前按比例加入甲醛，200l/250ml银染液）5. 显色液： 2mL敏化液 + 125 l 甲醛 + 7.0g Na2CO3 + 去离子水，定容至250ml，每次使用时新鲜配置（先配好不含甲醛的储备液，临用前按比例加入甲醛，125 l/250m

9、l银染液）6. 终止液： 5%醋酸水溶液二、 银染操作步骤：1. 固定：凝胶取下后，用去离子水清洗胶面，然后加入固定液振荡至少30min；如果需要，胶可在固定液中保存过夜 ( 不振荡 ) 。2. 漂洗；弃去固定液后，凝胶用漂洗液清洗一次。弃去漂洗液，加入新鲜漂洗液，振荡 15min；3. 水化：凝胶用去离子水清洗一次，弃去去离子水，再次加入去离子水水化15 - 30min ；4. 敏化：用敏化液浸泡凝胶 2.5min ；去除背景。5. 水洗：凝胶用去离子水洗 3 遍，每次 20sec。6. 银染：用银染液覆盖凝胶，轻微振荡 30min。7. 水洗：重复第 5 步。8. 显色：加入新鲜配置的显色液，显色 210min，注意观察染色状况，显色时间视蛋白量而定。9. 洗胶：迅速用去离子水漂洗凝胶 20sec。10. 终止：迅速加入终止液，终止显色反应。11. 水洗一次，扫胶考马斯亮蓝染色操作流程（R350 热考染）一、 0.2%储液配制1. 1 片 R350 用 80ml 双蒸水搅拌溶解 5-10mim；2. 加入 120m