双向电泳常见问题解答——水平条纹心得点评

1、双向电泳常见问题解答（一）水平条纹心得点评 作为经典蛋白质组学分离技术， 双向电泳越来越被科研人员所熟知。但要想得到漂亮的双向电泳谱图， 却并不那么容易。 我们将针对双向电泳过程中常出现的问题进行总结，希望能给您的实验带来帮助。 本期我们重点关注双向电泳图谱中常出现的水平条纹。双向电泳水平条纹的产生主要来自于样品本身和一向等电聚焦电泳，下面就从这两方面的原因及其解决办法进行详述。随着人类基因组草图完成，蛋白质组研究全面展开。作为经典蛋白质组学分离技术，双向电泳越来越被科研人员所熟知。但要想得到漂亮的双向电泳谱图，却并不那么容易。 我们将针对双向电泳过程中常出现的问题进行总结，希望能给您的实验带

2、来帮助。本期我们重点关注双向电泳图谱中常出现的水平条纹。双向电泳水平条纹的产生主要来自于样品本身和一向等电聚焦电泳，下面就从这两方面的原因及其解决办法进行详述。一、样品制备问题1样品中存在影响等电聚焦的杂质蛋白样品中任何离子净电荷的污染都将影响等电聚焦，并引起水平条纹。 严重的污染物干扰，我们在等电聚焦过程中可以观察到：低电压运行时，软件和仪器监测到的电流很快就达到50 A 的限定，预设的高电压不能达到；严重时可能导致电弧产生或IPG 胶条燃烧。常见的污染包括样品制备过程中引入的盐和其他带电小分子、去污剂；以及样品本身内源性的杂质，包括各种内源性的带电小分子，核酸、多糖、脂类、酚类等非蛋白杂质

3、。了解样品中主要污染物的组成，并且在样品制备过程中采取有针对性的办法去除污染物即可改善水平条纹。盐和带电小分子：水化上样将盐离子浓度降低到10 mM 以下，而杯上样则限制样品盐浓度不超过 50 mM 。脱盐常用脱盐柱、旋转透析或透析袋；而用TCA 和丙酮沉淀再重悬，是一个更有效的脱盐方法，但往往TCA 清除不尽，蛋白复溶效率不高。2-DClean-UpKit（货号 80-6484-51 ）则采用专利的共沉淀剂和洗涤附加物，可以定量沉淀各种来源的蛋白质，蛋白复溶率通常大于 90%。使用 2-D Clean-Up Kit不会造成斑点增加或减少，或斑点位置的变化，操作简单，整个过程可以在一个小时内完

4、成。另外，使用劣质水、尿素或其他试剂也会造成导电性升高； 尿素还易分解为带电的产物。选用优质试剂， 重要的试剂包括尿素、硫脲、DTT 、去污剂、 载体两性电解质、 水等，防止一向等电聚焦所需的这些试剂因本身纯度不够，而引入带电杂质。即使选择了优质尿素、硫脲，保存得当也非常关键。尿素、硫脲吸水后会发生离子化， 影响等电聚焦。 样品中盐离子浓度还可以通过改变IEF 的程序来降低。 先设一步或几步低压程序，如100V 3h ， 100v-1000vgradient 3h ，然后再升高电压完成IEF，这个低压程序可以使样品中的离子首先迁移到IPG 胶条的末端，降低电内渗，减少水平条纹的形成。带电荷的去

5、污剂：最常用的离子型去污剂如SDS，能够包被蛋白，并彻底改变它们的净电荷，最终影响它们的等电点，导致条纹出现以及IPG 胶条中样品的损失。如果在样品中存在 SDS，那么其用溶胀液稀释后的最终浓度不能超过0.25%。或者， 添加其他非离子型去污剂或兼性离子去污剂稀释SDS 的浓度。核酸：样品的核酸污染也会导致水平条纹的出现。高分子量的核酸还会堵塞胶孔，阻碍聚焦。许多蛋白与核酸结合，产生了蛋白-核酸的混合物，每个都有着不同的等电点。在等电聚焦之前用核酸酶（货号 80-6501-42）处理样品，可去除样品中的核酸。或者在样品制备时超声剪切核酸，也可在精胺存在时通过超速离心也可去除核酸。多糖： 唾液酸

6、、 带负电荷的多糖也能产生与核酸类似的水平条纹。不带电荷的多糖通过阻塞凝胶孔，阻碍样品进入IPG 胶条，导致条纹出现。去除多糖用TCA/acetone (Damerval et al.1986)，或者醋酸铵(甲醇饱和硫酸铵)沉淀然后用苯酚抽提(Hurkman and Tanaka 1986) 。2 蛋白被修饰氨基甲酰化为了防止蛋白质的修饰， 不要在加入尿素后加热样本。 如果样本中存在尿素， 溶液温度不能超过 37 ° C 。温度上升会使尿素水解为异氰酸酯，异氰酸酯能通过氨基甲酰化作用（ carbamylation ）对蛋白质进行修饰，使个别蛋白产生电荷异质性，造成人为的“斑点串（ch

7、arge trains）”。蛋白样品应当使用高纯度尿素制备，切勿加热至30° C 以上。3二硫键形成二硫键形成也是样品制备方面导致水平条纹的一个重要原因。在双向电泳之前， 若蛋白样品中存在二硫键， 则它们是随机存在于分子内部或分子之间的。二硫键形成产生了多种蛋白构象，包括较小的 pI 变体（在双向凝胶上显示为单个蛋白点的变宽）以及同一蛋白的多聚物（以点、幻影点、缺失点的条纹尾和拖尾出现）。防止二硫键的形成能避免这些问题。二硫键问题在两种情况下特别严重：1）碱性蛋白的分析， 2）较长 IPG 胶条的使用。样品制备过程中加还原剂，如 DTT ，可打开二硫键，需要注意的是DTT 在 IEF

8、 过程中会迁移而使蛋白发生再氧化。对于碱性蛋白，采用DeStreak 去拖尾试剂（货号 17-6003-18 ）和 DeStreak去拖尾水化液（） ，可将蛋白质巯基团转变为稳定的二硫化物基团，防止发生非特异性氧化反应。结合在酸性端杯上样可有效减少碱性蛋白聚焦过程中产生的水平条纹。4蛋白溶解度差未能彻底溶解样品中的所有蛋白将引起水平条纹。双向电泳最常用的样品缓冲液中主要组分是尿素、非离子去污剂（如NP-40）或兼性离子去污剂（如CHAPS ）及还原剂（如 DTT ）。此混合物中包含的其他组分，如硫脲或新型去污剂，如氨基硫代甜菜碱家族（如ASB-14 ）能改善膜蛋白的溶解性。 这些试剂的综合作用

9、是通过更好地溶解蛋白的疏水区域以减少因蛋白中的氢键或与 IPG 凝胶基质的相互作用而产生的聚集。另外，在等电聚焦前通过离心去除不溶蛋白也是一种好的做法，能防止它们干扰其他蛋白进入凝胶基质。二、等电聚焦问题1上样量太高或存在高丰度蛋白IPG 胶条的载样量通常取决于胶条的长度、pH 范围以及所使用的染色方法。下表列举了各种不同胶条推荐的上样量。高丰度蛋白存在的样品需要更多考虑。人血清中的白蛋白占蛋白质总量的7090% ，IgG 占 1025% 。利用白蛋白和IgG 去除试剂盒（货号28-9480-20 和28-9466-03 ）可选择性地与人白蛋白和IgG 结合并去除，从而改善低丰度蛋白质的分辨率

10、，增加样本的斑点数量。另外，使用杯上样的方法上样时，上样量过大， 可能会导致高丰度蛋白过载，从而使蛋白聚集。这会导致某一蛋白在等电点（pI 沉降）沉淀，并引起水平条纹。因此，杯上样时需要限制蛋白浓度不超过10mg/ml 。表. IPG 胶条推荐载样量胶条长度 (pH) 推荐上样量（ g）银染考染2聚焦不足不完全聚焦也会引起水平条纹。确保总的伏特小时数适用于所使用IPG 胶条的长度和 pH 范围，并根据上样量进行调节。因此，不同长度和pH 范围的胶条不能同时电泳。另外，等电聚焦程序设置了总电流的限制-50uA/ 胶条，多根胶条同时聚焦时，如果某个样品离子较多，它将承载大部分电流，减慢了其他蛋白样

11、品的聚焦。这导致不完全聚焦和水平条纹的出现。因此，电导率相差很大的样品应当单独运行IEF 。3聚焦过度延长聚焦时间不一定能提高分辨率。实际上，它可能引起水平条纹。 一些蛋白样品更易聚焦，因此必须对每个样品类型及每种缓冲液独立开展伏特小时数的优化，以确定稳态的IEF 模式。总之， 样品制备和等电聚焦是双向电泳谱图出现水平条纹的最主要的原因。除此之外， 如果平衡缓冲液或覆盖胶条的琼脂糖中存在杂质，也可能使整个胶上出现横条。这就需要配制新鲜干净的琼脂糖和平衡缓冲液。并且，IPG 干胶条的水化也非常关键，通常水化时间要在10h 以上。保证整个胶条均匀、充分溶胀也是去除水平条纹必需的。蛋白双向电泳图中什

12、么是斑点串？看你是横向斑点还是纵向斑点了，如果是横向的话，基本上就是等电聚焦效果不好，有可能是样品含盐量太高，或者聚焦的时间不够，就会导致很多蛋白没有聚焦到等电点的位置，所以就会产生横向蛋白点相连形成斑点相连的拖带， 就是你说的斑点串了， 不过这个名词我好想没听过啊，不知道是不是专属名词。如果是纵向的哪有可能上槽液污染了。导致 2-D 图谱变差主要是由于：· 蛋白上样量提高；· 胶条的长度延长；· pH 梯度变窄；· 较长的聚焦时间。引起这个显著问题的原因之一是胶条碱性端还原剂的减少，如pKa 约为 9.2 的 DTT 。因而巯基基团慢慢氧化，导致了蛋白

13、等电点的变化，并同时引起了等电聚焦过程中蛋白聚焦位置延 IPG 胶条不断迁移的现象。有多种方法可用于补救这个问题：· 选择性的烷基化（碘乙酰胺，丙烯酰胺） ；· 使用不带电的还原剂（三丁膦，三羟基丙基膦） ； · 除去阴极的 DTT 。然而，应用以上的方法无一可成功地形成一个普遍适用的优化的方法。半胱氨酰基团氧化成特定的“混合二硫化物”Protein-S- + R-S-S-R ? Protein-S-S-R + R-S-· 反应是高特性异的，无意义的副反应的几率较低；· 该反应是一个平衡反应，要完全转化所有的半胱氨酰基团需高浓度的RSSR；&#

14、183; 在 pH>7 的条件下，半胱氨酰基团转化成固定“混合二硫化物”的反应是自发的。当用 DTT 作还原剂时， 因为 DTT 逐渐迁移出胶条的碱性端，蛋白的聚焦位置会随着时间变化（在第一向过程中） 。根据其半胱氨酰的氧化程度的不同，蛋白将出现在多个不同的位置上。使用 DeStreak 时，蛋白以其完全的氧化态形式存在（也称为“混合二硫化物”），因而在聚焦过程中能获得同样的图谱而与第一向的聚焦时间无关因而用 DTT 作还原剂时很难得到重现性很好的结果。但在DeStreak 的帮助下，不同pH 范围的胶条却很容易获得高重复性的点图谱。结论· 借助于 DeStreak 得到了改善

15、的无拖尾的2-D 图谱；· 提高了重复性尤其是碱性端的重复性；· 不同 pH 范围的胶条能产生可重现的点图谱，便于不同胶之间的比较；· 观察到的大多数点更偏向阴极的位置；· 用 DeStreak 产生的蛋白聚焦的位置是由硫醇完全转化成“混合二硫化物”后而得到的，点图谱在第一向过程中完全稳定；· “混合二硫化物”在第一向与第二向间的平衡步骤中被还原，不影响第二向电泳，使得常规的蛋白鉴定和定性技术可得以运用。首先，来看看漂亮的2D 电泳图问题 1. 氨基甲酰化（ Carbamylation trains）导致太多蛋白斑点串，不属于常规的磷酸化等修饰

16、可能原因：尿素（ urea ）不纯建议：用更纯的尿素，避免样品加热，或者用Amberlite IRN-150L去异氰酸盐（ isocyanate ）问题 2. 蛋白样品制备步骤错误导致蛋白丢失可能原因：样品制备TCA/ 丙酮沉淀后用预冷的丙酮洗涤沉淀，导致TCA 残留建议：用 90% 丙酮 /10%H2O洗涤 ,可以彻底洗去TCA问题 3. 不同的样品制备步骤导致完全不同的蛋白斑点图谱对于样品制备而言， 没有一个固定的方法， 更多的时候要根据样品的特性，以及一些文献的参考进行优化，下面是一个植物样品的例子：若采用常规的标准裂解液，样品溶解不充分用甲醇沉淀后复溶，效果也不明显TCA/ 丙酮沉淀较

17、适合这一样品4. 正常情况正常情况，右边的垂直条带包含了所有pIs 值>pH7 的蛋白。问题 5. 样品含高丰度蛋白导致出现水平条带可能原因：高丰度蛋白聚集后，若采用胶面朝下的胶条槽，易造成水平条带。建议：采用杯上样胶条槽或manifold等胶面朝上的胶条槽。问题 6. 出现水平条带（窄pH 范围胶条）可能原因：聚焦不够，或者盐离子过多造成水平条带的其它原因：Detergent去污剂浓度过低尿素浓度过低DTT 浓度过低，或者用量过少上样位置不合适（比如cup loading）蛋白酶活性胶条溶胀时间过短样品中含有不溶的蛋白(centrifuge 1 hr / 40,000 g)空气中的 C

18、O2问题 7. 试剂不新鲜可能原因： TEMED 不新鲜。建议：尽管 TEMED 用量很少，还是建议每年更换一瓶TEMED 。问题 8. 试剂质量影响蛋白斑点成像可能原因： Tris 质量不好问题 9. 步骤错误导致蛋白丢失可能原因：蛋白转移电压过高 （ 400V ，18cm 胶）在开始的 45 分钟内不要超过 2W/gel （ Ettansize ）问题 10.植物样品制备可能原因：多糖未去除干净，被考马氏亮蓝染色建议：样品用clean-up处理问题 11.蛋白斑点出现垂直条带可能原因：平衡过程中DTT 不足，导致一些蛋白出现垂直条带。问题 12 样品中含盐等离子过高可能原因：样品中含盐等离

19、子杂质过高，导致等电聚焦失败。建议：避免过多盐，需除盐，如在洗细胞时要把PBS 在离心后彻底移除，或在最后一步清洗时采用 250mM蔗糖 /10mM Tris洗细胞。问题 13 pH6 11 的胶条Rehydration Loading Cup loading建议：对于碱性pH 范围胶条，用杯上样效果更好问题 14 保存第二向凝胶时温度太低可能原因：保存第二向凝胶时温度太低，SDS 有沉淀建议：长时间保存（2days - 2weeks）在 4 8oC ， 在二向进行前应提前把凝胶取出，室温放置。以上胶片由 GE Healthcare提供样品缓冲液的组成：3.1 尿素：一种中性变性剂，破坏氨基酸

20、残基之间的非共价键和离子键而不影响等电聚焦，浓度范围 5-9.8mol/L ，溶液不稳定，降解生成的氰酸根离子与蛋白质的氨基结合改变蛋白质的等电点。加精胺能降低影响。3.2 硫尿：与尿素一起，能增加疏水膜蛋白的溶解性，缺点是在平衡液里与蛋白的半胱氨酸竞争结合碘代乙酰胺， 会使蛋白的烷基化不完全，硫尿还有抑制SDS 与蛋白质结合的作用，也可能增加脂类的溶解性，影响二向的效果。一般是2mol/L 的硫尿与 5-7mol/L 尿素结合使用。3.3 去污剂：蛋白质在去折叠后，会暴露出大量的疏水性残基，去污剂用于破坏蛋白质分子间的疏水相互作用。阴离子去污剂SDS，不利于稳定等电聚焦中蛋白质的等电点，浓度不超过 0.25%，NP-40： SDS>=8 ： 1，常用的有非离子型去污剂Triton X-100 和 NP-40，两性离子去污剂CHAPS ， SB3-10 等。非离子型去污剂和两性离子去污剂能在不破坏蛋白质结构，保持生物活性的情况下改善蛋白质的溶解度，但是必须选择合适的浓度，浓度太低不能