抗炎免疫药物实验方法

1、第第22章章 抗炎免疫药物实验方法抗炎免疫药物实验方法药理实验方法学（第四版）人民卫生出版社 魏伟 教授 主编临床药理研究所2010.3.30主要内容和重点章节主要内容和重点章节第第1节节 实验动物的选择实验动物的选择第第2节节 抗炎实验方法抗炎实验方法 一、非特异性炎症模型 二、免疫性关节炎模型二、免疫性关节炎模型 三、骨关节炎模型 四、其它免疫性炎症模型第第3节节 抗炎药物作用机制的研究方法抗炎药物作用机制的研究方法第第4节节 抗痛风药物的实验法抗痛风药物的实验法第第1节节 实验动物的选择实验动物的选择 实验性炎症应该选用哺乳类哺乳类动物，不同的实验模型选用的动物不同。 足跖浮肿模型多采用

2、大鼠，形成过敏性炎症多选豚鼠。 家兔最易产生发热反应，且发热反应典型、恒定，因而常用。 曾致炎组织比初次炎症刺激时反应微弱，因此不宜在同一部位反复复制炎症。 性别差异对炎症模型可能存在明显影响，为了排除雌激素等性激素对炎症反应的影响，一般采用雄性动物。第第2节节 抗炎实验方法抗炎实验方法一、非特异性炎症模型（一）急性和亚急性炎症的实验方法（一）急性和亚急性炎症的实验方法（二）增殖相（肉芽肿形成）的实验方法（二）增殖相（肉芽肿形成）的实验方法二、免疫性关节炎模型三、骨关节炎模型四、其它免疫性炎症模型一、非特异性炎症模型一、非特异性炎症模型非特异性炎症反应具有三个明显的时相：非特异性炎症反应具有三

3、个明显的时相：急性时相，时间短暂，以局部血管扩张和毛细血管通透性增加为特征；亚急性时相，以白细胞和吞噬细胞的浸润为特征；慢性增殖相，以组织变性和纤维化为特征。 （一）急性和亚急性炎症的实验方法（一）急性和亚急性炎症的实验方法1.紫外线诱导的豚鼠红斑紫外线诱导的豚鼠红斑2.毛细血管通透性测定毛细血管通透性测定3.大鼠肠系膜小静脉白细胞粘连抑制实验大鼠肠系膜小静脉白细胞粘连抑制实验4.鼠耳肿胀法鼠耳肿胀法5. 大鼠足爪肿胀法大鼠足爪肿胀法6. 大鼠胸膜炎大鼠胸膜炎7. 大鼠气囊滑膜炎大鼠气囊滑膜炎8. 尿酸盐诱导的滑膜炎尿酸盐诱导的滑膜炎9. 急性结膜炎急性结膜炎10. 实验性中耳炎实验性中耳炎1

4、. 紫外线诱导的豚鼠红斑紫外线诱导的豚鼠红斑 【操作步骤】（1）选用体重350g左右的白化病豚鼠白化病豚鼠，性别不限。（2）实验前18h将动物两肋和背部的毛剃去，用脱毛剂脱毛脱毛，然后用温水将脱毛剂和毛冲除。（3）第二天在紫外线照射前紫外线照射前30min灌服实验药物实验药物10ml/kg，对照组灌服同体积的溶媒。（4）将豚鼠置于一皮套中，皮套中部留有一1.5cm2.5cm的洞口，使其脱毛区暴露于紫外线暴露于紫外线下。在暴露前紫外灯预热30min。将豚鼠置于紫外灯下一恒定距离（20cm），照射照射2min。实验者戴手套和紫外线眼镜防止紫外线的损害。 照射后2h、4h对红斑程度按下列标准进行评分

5、评分： 0=无红斑；1=弱的红斑；2=较强的红斑；3=很强的红斑。2. 毛细血管通透性测定毛细血管通透性测定 （1）放射性同位素染料定量测定法【基本原理】急性炎症时，随着血管组织屏障功能的改变，血浆蛋白透入血管外组织速率加快。本法在应用化学介质致炎的基础上，同时静注一定剂量和呈一定比例的染料和放射性同位素结合的白蛋白，随后测定局部炎性病灶内的染料和放射活性，可定量而精确地测得血管通透性的变化程度。（2）血浆外渗连续测定法【基本原理】本法系在皮肤炎症时静注同位素标记白蛋白，通过连续记录脉冲数的方法测定其外渗的时量变化，并能进一步了解血管通透性的全过程，适用于药物作用强度和作用时间的动态观察。（3

6、）荧光素测定法A. 大鼠囊袋致炎模型【基本原理】 本法系在角叉菜胶引起大鼠囊袋炎症模型基础上，应用荧光素异硫氰酸结合牛血清白蛋白（F-BSA）作为标示物静脉注射，并且在不同时间测定囊内渗出液的荧光素强度，以此作为炎症病灶中血管通透性指标。具有灵敏、精确、无毒、重现性好等优点。 B. 大鼠皮肤致炎模型3. 大鼠肠系膜小静脉白细胞大鼠肠系膜小静脉白细胞粘连抑制实验粘连抑制实验【基本原理】正常情况下，当白细胞与血管壁触击时，此种触击表现为弹性，细胞弹回管腔。炎症时，组织的化学改变引起细胞的非弹性触击和粘连性的增加，导致白细胞沿内皮表面的滚动。当粘连进一步增加时，白细胞的滚动减慢，随后逐渐停止并迁移至

7、血管外。 此种情况可依靠制备一麻醉鼠的肠系膜小静脉并用显微镜观看白细胞的流动和滚动情况来进行在体观察。实验过程中，白细胞粘连于血管壁是用甲酰基-L-蛋氨酰-L-亮氨酸-L-苯丙氨酸（fMLP）人工诱导的，fMLP通过其受体激活白细胞，引起细胞表面的L-选择素迅速表达，从而导致细胞沿内皮表面滚动。4. 鼠耳肿胀法鼠耳肿胀法 【操作步骤】（1）选用雄性小鼠小鼠或雄性SD大鼠大鼠，小鼠的体重为20g左右，大鼠的体重为170g左右，每组为10只动物。（2）致炎剂为二甲苯二甲苯或巴豆油混合液巴豆油混合液致炎。（3）实验或对照药物溶解于致炎剂药物溶解于致炎剂中，小鼠的药物浓度为0.03lmg/ml，大鼠的

8、药物浓度是小鼠的310倍。（4）动物用乙醚麻醉麻醉，在右耳的前后两面涂布致炎剂右耳的前后两面涂布致炎剂（对照）或含有药物的致炎剂（实验组）。致炎剂的体积为：二甲苯0.02 ml/只，巴豆油致炎剂小鼠为0.01ml/只，大鼠为0.02ml/只。左耳用相应溶媒处理。（5）4h后后，将动物麻醉处死处死，剪下双耳剪下双耳用8mm（小鼠）或9mm（大鼠）直径打孔器分别在同一部位打下圆耳片称重圆耳片称重。（6）肿胀度肿胀度计算：每鼠右耳片重量减去左耳片重量。【注意事项】（1）涂致炎剂的部位应与取下的耳片相吻合。（2）打孔器应锋利。（3）温度、湿度应恒定，并要及时称重。【评价】 本法不需要特殊设备，方法简便

9、，见效快，用药量少，且复制成功率高，适用于抗炎药常规筛选。5. 大鼠足爪肿胀法大鼠足爪肿胀法【操作步骤】（1）选用体重130150g健康大鼠大鼠，以不同溶媒配制致炎剂。（2）实验常采用的致炎剂致炎剂有：角叉菜胶，酵母琼脂，右旋糖酐，甲醛，鸡蛋清，白陶土等。（3）实验者将动物后肢拉直，用注射器先自足跖中部皮下皮下向上注入一部分，然后掉转针头向下注完。（4）分别于注入后5min、30min、1h、2h、4h、6h，根据不同情况选择测定肿胀时间肿胀时间，记录肿胀高峰时间和消退时间肿胀高峰时间和消退时间，比较给药组和对照组的差异。 其中鸡蛋清、5-羟色胺、组胺和缓激肽，在注入后约30min肿胀可达高峰

10、，右旋糖酐1h达到峰值，消退亦快，属短效致炎剂。甲醛则需24h才达高峰，维持约2周，属长效致炎剂。而角叉菜胶、白陶土、酵母、琼脂介于两者之间，属中效致炎剂。其中角叉菜胶角叉菜胶应用最广，其优点优点为肿胀模型可靠、差异性小，有高度重现性。 皮内注射法：皮内注射法：注入表皮与真皮之间的方法。皮下注射法：皮下注射法：注入皮下组织的方法。注射部位注射部位 皮内注射法和皮下注射法区别皮内注射法和皮下注射法区别n 皮内注射法：皮内注射法： 注入表皮与真皮之间的方法。使针头斜面向上，和皮肤呈15度刺入皮内，局部形成一圆形隆起的皮丘，皮肤变白，毛孔粗大。n 皮下注射法：皮下注射法： 注入皮下组织的方法。使针头

11、斜面向上，和皮肤呈30到40度角，抽吸无血液，即可注射。n 属于不同的免疫途径，根据实验需要进行皮内或皮下注射；皮内注射时不能注射到皮下，否则会引起严重深部脓肿，长期不愈。常用致炎剂的种类和浓度常用致炎剂的种类和浓度 足爪肿胀测量方法如下：足爪肿胀测量方法如下：（1）容积测量法容积测量法：是目前较为常用的足跖测量方法，多用容积检测仪检测。测量池测量池【基本原理基本原理】 使用了阿基米德定律中的“物体在液体中所受浮力等于所排开的液体的重力”这一定律。 原理原理是利用大鼠踝关节上的突起部位来定位，凹形的关节夹能准确地卡在踝关节上，这样关节夹上的电极相对大鼠足趾是一个固定位置，当足趾下行，电极触及水

12、面时，通过水的导电，将其浸入液体中的足趾部分的体积数据锁定，这样操作可减少足趾画线和观察上的误差。【注意事项】 1.足容仪是以水为测量介质，放在稳固的台面上使用； 2.测量前，应对鼠足进行卫生处理，避免将粪便、木屑等带入测量池； 3.每次应间隔35s再校零，保证实验的精确度； 4.使水始终保持在一定的高度； 5.一次实验最好由一个固定的人员完成，减少视觉和操作上的误差。（2）周长或厚度测定法周长或厚度测定法 本法不需特殊仪器，测定方法较容易。实验时分别用特制软皮尺测量踝关节周长，或用千分尺测量肿胀肢体厚度。 【注意事项】 测量周长的软皮尺不能有弹性，刻度以0.2mm左右为宜；测量部位尽量少变动

13、，每次测量的宽紧度必须一致；测量动作要熟练，要由专人负责，尽可能减少误差。 6. 大鼠胸膜炎大鼠胸膜炎【操作步骤】（1）致炎剂：2%角叉菜胶角叉菜胶0.1ml/只。（2）动物：选用雄性SD大鼠大鼠，体重220260g，每组10只。乙醚浅麻醉浅麻醉，仰卧位固定，剪去右侧肋上毛剪去右侧肋上毛，用酒精消毒皮肤。（3）胸腔穿刺胸腔穿刺：在右上肢下第七、八肋骨间皮肤剪一小切口，暴露肋间肌肉，在肌肉切口处注入角叉菜胶。注射需快速进行，以免损伤肺。（4）渗出液的收集与处理渗出液的收集与处理：致炎后6h放血处死动物，在横膈周边部打开胸腔，吸出渗出液，并用1ml 199溶液（含肝素50IU/ml）冲洗胸腔。渗出

14、液迅速移至试管内（冰浴）。4离心15min（2 500 g），贮存于-18，用于蛋白质、前列腺素E2、白细胞三烯B4等测定。7. 大鼠气囊滑膜炎大鼠气囊滑膜炎【操作步骤】（1）致炎剂：1%角叉菜胶角叉菜胶2 ml/只。（2）动物：选用Wistar或Lewis大鼠大鼠，体重200300g。乙醚麻醉，背部剃毛，酒精消毒皮肤。（3）气囊的制作：大鼠背部皮下注射空气皮下注射空气20ml（事先经0.2m过滤器滤过），第3天天和第6天天分别再次注入510ml以维持气囊的膨胀。（4）致炎致炎：第6天天向气囊内注入1%角叉莱胶2ml/只。（5）渗出液处理：检测指标同大鼠胸膜炎。 实验表明，角叉菜胶诱发的液体渗

15、出与白细胞游走在致炎24h后达高峰，渗出液中蛋白质、PGE2和LTB4浓度均在致炎6h后达高峰。8. 尿酸盐诱导的滑膜炎尿酸盐诱导的滑膜炎【操作步骤】（1）健康狗狗，体重1825kg。膝关节皮肤脱毛，酒精消毒。（2）将消毒针插入关节，轻吸少量清澈粘性的滑液提示已进入关节腔关节腔；接上注射器，注入0.10.5ml尿酸盐结晶液尿酸盐结晶液（约2l0mg尿酸盐）。（3）注入尿酸盐结晶前前1h，用实验药物药物或对照药物对动物进行处理。9. 急性结膜炎急性结膜炎 【基本原理】 把一定的刺激剂滴入动物两眼结膜囊致炎，通过比较用药组和对照组动物眼结膜的炎症强度，即可判断受试药物的疗效。10. 实验性中耳炎实

16、验性中耳炎 【基本原理】本实验先人工造成兔鼓膜穿孔，而后将刺激剂滴入中耳腔以引起急性中耳无菌性炎症。（二）增殖相（肉芽肿形成）的（二）增殖相（肉芽肿形成）的实验方法实验方法 本实验系应用巴豆油、棉球、海绵、玻璃棒、纸片等埋入（或注入）动物局部皮下，可产生与临床某些炎症后期病理变化相似的肉芽增生，可作为筛选抑制炎症增殖期药物的模型。本法对甾体类和NSAIDs都很敏感。1. 大鼠巴豆油气囊法大鼠巴豆油气囊法【操作步骤】（1）选用体重140g左右雄性大鼠大鼠，乙醚浅麻醉，局部消毒后，于背部肩胛间区皮下注射皮下注射20ml N2形成气囊，随即向气囊内注入消毒致炎剂1%巴豆油巴豆油（用注射用中性麻油配制

17、）1ml，立即将鼠背朝下，反复摇晃，使巴豆油均匀地与囊壁组织接触。（2）2448h后抽抽去囊内的N2。致炎的当天当天开始给予受试受试药物药物，每天一次，计7d。第8天处死动物，测量囊内渗出液，剥离囊壁肉芽肿囊壁肉芽肿，置生理盐水中漂洗干净，在80烤箱中烤干，称重称重，比较各组渗出液量渗出液量和囊壁囊壁重量，计算抑抑制率制率。2. 棉球植入法棉球植入法【操作步骤】（1）选用体重140g左右雄性大鼠大鼠，在乙醚浅麻醉下腹部去毛消毒。（2）腹部切口，将两个灭菌棉球灭菌棉球（每个棉球重501mg，高压灭菌，各加入氨苄青霉素每个1 mg/0.1ml，50烘箱烤干）分别植入大鼠两侧腋窝皮下两侧腋窝皮下（或

18、两侧腹股沟皮下两侧腹股沟皮下）。（3）术前或手术当天用药用药，连续7d，第8天颈椎脱臼处死，取出棉球，在60 烤箱烤箱放置12h后称重，减去原棉球重量即为肉芽肿净重肉芽肿净重。【注意事项】 （1）棉球重量一般在1050mg范围内，棉球的表面积对实验结果的影响较大，为了减少差异，植入每鼠的棉球的形状和植入部位应一致。（2）动物摄食量的降低或体重减轻亦可降低肉芽肿重量，故应按mg（肉芽肿）/100g体重表示。3. 海绵植入法海绵植入法【操作步骤】（1）海绵的制备。 （2）雄性大鼠大鼠，重150200g，乙醚麻醉，在背部切开皮肤（长20mm），分离肌肉，在肌肉层下用钝性钳作一空穴，将海绵植入海绵植入

19、，每只大鼠可植入8个海绵。缝合缝合切口，大鼠于24 的室温下饲养。 （3）给药给药：短期实验，在移植前给药一次；长期实验，移植后连续给予药物3周。（4）海绵移植9h后，测定海绵渗出液中蛋白含量、酶水平及一些生化指标如PGs、LT等。4. 玻璃棒肉芽肿玻璃棒肉芽肿【操作步骤】（1）直径6mm的玻璃棒玻璃棒，截成40mm长，两端在火焰下熔化为圆形。移植前煮沸消毒。（2）雄性SD大鼠大鼠，开始体重为130g左右，用乙醚麻醉，背部皮肤剃毛，酒精消毒。（3）在背尾部切开皮肤，用钝头钳向头部方向作一皮下隧道，将玻璃棒植入玻璃棒植入其中，缝合切口。（4）玻璃棒保留时间为2040d。药物治疗要持续整个病程或在

20、最后10d或20d。（5）动物麻醉处死，取出玻璃棒连同其周围的结缔组织。切开玻璃棒末端的结缔组织，抽出玻璃棒，称量肉芽肿组织的湿重肉芽肿组织的湿重。将标本放在湿的环境下，以待进一步分析，如测定标本的张力量。5. 纸片法纸片法【操作步骤】（1）采用体重150g左右的雄性大鼠大鼠。纸片为市售测定抗菌药物活性的滤纸片（直径8mm、厚1.5mm），干燥灭菌30min。（2）在乙醚麻醉下，将纸片植入植入动物左右肩部肩部或上腕部皮下各1片，缝合。在室温2024 、湿度55%5%环境下饲养。（3）植入纸片第6天天处死动物，将纸片与肉芽组织一并摘出。于60干燥24h后称重，减去原有纸片重量，即为肉芽净重肉芽净

21、重。（4）给药给药：抗炎药的预防应用可于纸片植入24h后开始给药，连续5d。治疗应用可于纸片植入后第6天起，连续给药3d。二、免疫性关节炎模型二、免疫性关节炎模型（一）佐剂性关节炎（一）佐剂性关节炎（二）（二）型胶原诱导的关节炎型胶原诱导的关节炎（三）抗原性关节炎（三）抗原性关节炎（AIA）（四）链球菌细胞壁（四）链球菌细胞壁（SCW）诱导的关节炎）诱导的关节炎（五）降植烷诱导的关节炎（五）降植烷诱导的关节炎（PIA）（六）胶原抗体诱导的关节炎（六）胶原抗体诱导的关节炎（CAIA）（七）（七）6-磷酸葡萄糖异构酶诱导的关节炎磷酸葡萄糖异构酶诱导的关节炎（八）蛋白多糖诱导的关节炎（八）蛋白多糖诱

22、导的关节炎（PGIA)（九）软骨寡聚基质蛋白诱导的关节炎（九）软骨寡聚基质蛋白诱导的关节炎（十）（十） IB2（3T3-hIL-1）重组体诱导的关节炎）重组体诱导的关节炎（十一）与关节炎细胞因子及其受体相关的其它小鼠模型十一）与关节炎细胞因子及其受体相关的其它小鼠模型（一）佐剂性关节炎（一）佐剂性关节炎 【基本原理【基本原理】 佐剂性关节炎（AA）是细胞免疫所介导的炎症反应模型。抗原进入机体使T细胞致敏，当再次接触抗原，致敏T细胞分化、增殖，释放各种淋巴因子以及直接杀伤靶细胞引起的炎症反应。 大鼠大鼠AA【操作步骤【操作步骤】（1）完全氟氏佐剂（完全氟氏佐剂（CFA）的制备）的制备：将液体石蜡

23、高压灭菌；然后，按每ml加入卡介苗或死结核杆菌10mg制成；或直接购买。（2）动物动物：选用雄性Lewis、Wistar或SD大鼠，体重200g左右。（3）致炎致炎：将每鼠右后足跖皮内皮内注射CFA 0.1ml致炎。原发病变主要表现为早期致炎局部的炎症反应，致炎后18h右后足的肿胀达峰值，持续3d后逐渐减轻，8d后再度肿胀；续发病变（由迟发型超敏反应所致）一般出现于致炎后10d左右，表现为对侧（左后肢）和前肢的肿胀，耳和尾部出现“关节炎”小结，变应性角膜翳以及体重下降等。（4）足容积测定足容积测定：一般采用足爪容器测量仪。（5）给药方案给药方案： 观察药物对原发病变的影响：于致炎前0.51h用

24、药； 观察药物对继发病变的预防作用：致炎7天后用药，连续57d； 对继发病变的治疗作用：致炎后第14天开始用药连续57d。 【评价【评价】（1）原发性病变：给药组的注射侧足爪肿胀度（致炎后的足爪容积致炎前的足爪容积）与溶媒对照组的注射侧足爪肿胀度进行比较。亦可以用抑制百分率来评价。（2）继发性病变：评价注射足爪对侧的病变，评价方法同原发性病变；时间为致炎后d1028。（3）关节炎指数：在致炎后第7天开始评分，每隔4d评一次，用来评价继发性整体病变的严重度。（4）多发性关节炎是本模型的特征，较为接近人类风湿关节炎（RA），但与人类关节病变的主要不同点是其病变的自限性。【注意事项【注意事项】（1）

25、本模型成败关键是CFA的制备（尤其是结核杆菌的研碎与乳化）和皮内注射。实践证明，由于羊毛脂（常用作油包水型乳化剂）增加粘稠性，难于抽吸和注射，现已少用。可通过研磨法、注射器混合法和超声等多种方法可以增加乳化程度。（2）大鼠的种系、年龄与机体的免疫状态可影响发病率，如年幼（9个月）大鼠不易诱发。（3）皮内注射时，注意无菌操作，避免细菌感染。AA大鼠多发性关节炎表现（一）大鼠多发性关节炎表现（一）AA大鼠多发性关节炎表现（二）大鼠多发性关节炎表现（二）（二）（二）型胶原诱导的关节炎型胶原诱导的关节炎 【基本原理【基本原理】 皮内注射同源或异源性型胶原（与低浓度卡介苗的液体石蜡油混匀、乳化）能引起大

26、鼠和小鼠等动物的多发性关节炎，由细胞免疫和体液免疫反应共同参与。型胶原诱导的关节炎（CIA）模型与人RA相似，故此模型对于评价实验药物的抗炎和免疫抑制作用十分有用。【操作步骤【操作步骤】 （1）小鼠）小鼠CIA的制备的制备：将鸡或牛型胶原（C）溶解于0.01mol/L的乙酸后与同等容积的含有低浓度卡介苗的液体石蜡油（ALCB）充分乳化，C和ALCB的剂量均为4mg/ml，乳化在冰浴中进行。在小鼠（18g左右）尾根部多点皮内注射乳化剂0.1ml（含C和ALCB 各200g），第21天在尾根部加强注射（方法同前）。加强注射后，由第三者检查关节炎的发生情况。 （2）大鼠）大鼠CIA制备制备： C溶解

27、于0.01mol/L的乙酸中（C的终浓度为4 mg/ml），充分研磨，4过夜。将C溶液滴加至冷的不完全氟氏佐剂（IFA）中，等体积混合，充分乳化。大鼠（体重150g左右）尾根部和背部分多点皮内注射0.1ml C乳剂（含C200g）。7d后，同样方法再加强注射一次。对照组注射0.01mol/L乙酸和IFA的乳化液。【注意事项【注意事项】 （1）C和ALCB或IFA要充分乳化，并在冰浴中进行。造模过程中，乳化剂应保持低温状态（冰块或冰浴中），需无菌操作。（2）小鼠一般选择DBA/1雄性小鼠。大鼠一般选择Lewis、Wistar或SD等品系雄性大鼠。DBA/1 小鼠CIA模型AA和和CIA的区别的区

28、别1、发病机制不同；2、诱导模型方式不同；3、发病特点不同：AA发病周期短，具有自限性；CIA周期长，关节和骨破坏严重；4、AA常用的大鼠是Lewis大鼠，CIA常用的小鼠是DBA/1小鼠；5、CIA更接近于RA，主要表现在：体液免疫和细胞免疫；发病特点；胶原抗体的变化和病理破坏特点。（三）抗原性关节炎（三）抗原性关节炎（AIA） 兔兔AIA【操作步骤】（1）乳化剂：3%卵蛋白溶液（溶媒生理盐水）与等体积CFA（含高热灭活结核杆菌20mg/m1）混合制成。（2）致敏：在家兔背部肩胛骨间选定5个注射位点，分别皮下注射乳化剂0.2ml。（3 ）再次刺激：致敏28d后，家兔右膝关节内注入3%卵白蛋白

29、溶液0.2ml。原发病变主要表现为关节红、肿、热。关节内注射37d时上述症状最为显著，以后肿胀逐渐减轻，红、热症状逐渐消失。续发病变一般出现在70d之后，关节肿胀再次出现，160d达高峰。关节肿胀等病理变化可长时间维持。（四）链球菌细胞壁（四）链球菌细胞壁（SCW）诱导的关节炎诱导的关节炎【基本原理】细菌感染是RA病因之一，如结核杆菌诱导的关节炎（AA）。A组SCW肽聚糖多糖复合物可诱导外周关节的急性炎症，主要是T细胞和单核细胞介导的免疫反应。早期急性期表现为中性粒细胞浸润滑膜，慢性期与T细胞的活化和巨噬细胞功能失调有关。模型的制备：1.动物：雌性Lewis大鼠（100125g）。2.致炎：腹

30、腔注射A组SCW肽聚糖多糖（30g鼠李糖/g体重）。3.表现：24h出现急性炎症表现，100%易感品系可出现外周关节的急性炎症表现，这主要是由于 SCW 片段沉积于滑膜中造成的。10d左右逐渐缓解，15d再次活化，关节肿胀和关节炎指数急剧增加，28d前后肢发展为慢性侵蚀性关节炎病程中包括血管翳形成、血管形成、软骨与骨的侵蚀和关节的破坏。（五）降植烷诱导的关节炎（五）降植烷诱导的关节炎（PIA）【基本原理】降植烷（pristane, 2,6,10,14-四甲基十五烷）是一种非抗原性佐剂。PIA是一种佐剂性关节炎模型，该模型特点为对称性炎症，慢性反复发作及进行性加重，T细胞浸润，软骨和骨破坏等。在

31、临床表现、遗传学特点，尤其是免疫学特点，如血清中促炎细胞因子和自身抗体（如类风湿因子）的表达方面，与人类RA非常类似，主要是MHC 类分子限制的T细胞依赖性疾病。【操作步骤】（1）大鼠PIA：动物：DA和Lewis大鼠，814周。大鼠尾根部位皮内注射150 l降植烷。对照组大鼠皮内注射等体积的生理盐水。注射降植烷23周后即可发生急性关节炎。通常突然发生于一个关节，随后数日内迅速进展，可累及四肢。绝大多数为对称性、多个外周关节受累，受累关节呈红肿改变且活动受限。急性炎症消退后，病程仍迁延数月，反复发作，慢性进展。（2）小鼠PIA：动物：BALB/C和DBA/1小鼠。小鼠尾根部皮内注射500l降植

32、烷，7 d后激发注射等量降植烷。小鼠的PIA模型以迟发的慢性病程为特点。首次注射后70180d观察到一个或多个关节肿胀变形，持续、缓慢进展，迁延100200d以上。关节炎症程度较轻，且局限于踝关节，很少蔓延至四肢，但也常常不只一个关节受累。（六）胶原抗体诱导的关节炎（六）胶原抗体诱导的关节炎（CAIA）【基本原理】CII是关节软骨基质蛋白的主要成分之一。RA患者体内CII抗体形成免疫复合物沉积在关节处，参与早期局部炎症的产生和疾病的进展。CII形成的免疫复合物与补体片段结合，激活局部单核细胞，关节处释放炎症因子，诱导中性粒细胞和巨噬细胞聚集。【操作步骤】：（1）动物：雄性BALB/c，C57B

33、L/6，DBA/1，B10.Q和B10.RIII系小鼠。 QB（B10.Q BALB/cF1）小鼠，810周龄用于实验。（2）致炎：将纯化后的2种以上单克隆抗体等浓度混合，最终的抗体量为9mg。腹腔注射或静脉注射2次，每只小鼠注射0.250.4ml 抗体混合液（含 9mg胶原抗体），间隔至少3h。第5天腹腔注射25g LPS（增加严重性和发病率），对照组注射等体积的PBS。4d左右足爪出现红肿，10d左右达高峰。【评价】CAIA模型不依赖MHC-II类分子限制的T细胞。CAIA模型具有快速、可重复性等特点，对于RA分子机制和药物的筛选以及探讨抗体介导的疾病机制研究具有重要意义。（七）（七）6-

34、磷酸葡萄糖异构酶诱导的关节炎磷酸葡萄糖异构酶诱导的关节炎 G6PI存在于细胞浆和细胞外液，尤其是关节腔内，由T细胞分泌，分子量60kD。G6PI主要功能是催化6-磷酸葡萄糖和6磷酸果糖转化。G6PI是一种全身细胞普遍存在的具有自身抗原性的蛋白质。近来发现在RA血清和关节液中可检测到高水平的抗G6PI抗体。在T 细胞受体的转基因小鼠模型（K/BN）中，小鼠所发生的炎症性关节炎与人类RA相似，而且会持续产生抗G6PI抗体。【操作步骤】（1）动物：DBA/1小鼠（雌雄兼用），1014周。（2）致炎：重组人G6PI（rh G6PI）与CFA等体积超声混合乳化，100 l乳化剂（含rh G6PI 250

35、450g）于小鼠尾根部皮下注射。（3）表现：发病率大于90%，9d出现足爪红肿，15d达高峰，然后逐渐恢复。炎症局限在关节处，中枢神经系统、心脏、肺、肝脏、胰腺、肾和骨骼肌没有病理学改变。CD4+ T细胞在G6PI诱导关节炎的发病机制中发挥重要作用。（八）蛋白多糖诱导的关节炎（八）蛋白多糖诱导的关节炎（PGIA) 【基本原理】蛋白多糖（PG）多聚体是由蛋白多糖聚合而成，其最主要的作用是组成细胞间的基质，是关节软骨的重要组成成分，它与胶原纤维共同组成软骨基质的固体、网络形态，有助于稳定软骨基质，对关节起机械性保护作用。在正常的组织修复以及软骨退变过程中，关节软骨中的蛋白多糖不断地被分解，并从软骨

36、中排出。异常情况下，会导致PG代谢异常增加，PG的分解多于合成，最终PG大量丢失，引起软骨及软骨下骨的破坏。【操作步骤】（1）动物： BALB/c小鼠，1214周。（2）致炎：腹腔注射（含100g PG的CFA溶液），分别于3周（含100g PG的IFA溶液）和6周（含100 g PG的CFA溶液）进行加强注射（3）表现：12周出现足爪红肿，26周表现为关节变形、关节强直畸形，34月龄累及关节周围组织。【评价】PGIA和CIA诱导的关节炎模型中，蛋白多糖和胶原都是作为抗原形成免疫交叉反应诱导关节炎症的发生发展。PGIA和CIA两者都涉及到T细胞和B细胞参与的细胞免疫和体液免疫，并且和MHC类分

37、子相关。（九）软骨寡聚基质蛋白诱导的关节炎（九）软骨寡聚基质蛋白诱导的关节炎 软骨寡聚基质蛋白（COMP）是一种大分子蛋白，分子量为524kDa，由5个相同的亚基组成，属于凝血酶敏感素家族。COMP主要存在于关节软骨，有软骨细胞合成，是一种细胞外基质蛋白。COMP免疫可以诱导较强的自身抗体反应。COMP通过激活淋巴细胞或与自身抗体结合，导致周围关节的炎症。【操作步骤】（1）动物：大鼠，815周。（2）致炎： COMP溶于4M氯化胍，与等体积的IFA混合乳化，大鼠尾根部皮内注射300l（含150g COMP）。（3）表现：后足爪急性红斑和肿胀，逐渐累及足趾和踝关节。22d达高峰，43d关节症状基

38、本消失，无炎症和关节畸形。 【评价】严重组织损伤时软骨可释放大量的COMP，其含量的变化可作为病情检测的指标。此模型对研究软骨如何与免疫系统相互作用提供了有力的平台。（十）（十） IB2（3T3-hIL-1）重组体）重组体诱导的关节炎诱导的关节炎 IL-1不仅是关节炎急性炎症期的主要炎性细胞因子，而且是介导软骨破坏最直接的细胞因子，在软骨和骨破坏中占据主导地位。IL-1分子有两种不同的基因编码：IL-1和IL-1。研究发现，在鼠胶原诱导性关节炎和抗原诱导性关节炎模型中，通过阻断IL-1（而不是IL-1）可以抑制炎症和软骨破坏。RA患者炎症滑膜组织特别是衬里层和亚衬里层高表达IL-1；IL-1局

39、限在滑膜血管翳，接近软骨和骨，且软骨高表达IL-1 mRNA。研究表明，RA患者滑液中高水平IL-1与其病理特征具有相关性。IL-1R拮抗剂（anakinra）能明显改善组织病理学变化和延缓影像学关节损伤程度。因此，IL-1在RA发生发展中发挥重要作用，研发人IL-1单克隆抗体治疗RA具有重要意义。【操作步骤】（1）逆转录病毒载体DFG-hIL-1-neo（包含人(h)IL-1 cDNA和neoR）转染小鼠成纤维样滑膜细胞系3T3NIH（来源于DBA系）。经转导、克隆，筛选得到IB2（3T3-hIL-1）重组体，体外能产生高水平hIL-1（220 ng hIL-1/24 h / 106 细胞）

40、。（2）动物： DBA/1小鼠，1014周。（3）致炎：于DBA/1小鼠右膝关节内注射IB2细胞（106个细胞），制备hIL-1诱导的关节炎。（4）表现：24h后膝关节出现明显炎症反应，710d关节破坏明显。【评价】本模型中人IL-1可以与小鼠的IL-1R发生交叉反应，这对于抗hIL-1单克隆抗体的临床前药效学研究具有重要意义。免疫性关节炎模型指标的评分标准：免疫性关节炎模型指标的评分标准：n 足爪肿胀度（见前面）；n 全身表现评分；n 关节肿胀数；n 关节炎指数；n X线评分和关节病理评分。 全身表现评分标准全身表现评分标准：每只动物最大8分关节肿胀数关节肿胀数：每只足爪计1个踝/肘关节和5

41、个指 （趾）关节，每只鼠最多24个关节肿胀。关节炎指数关节炎指数：每只足爪按下列标准评分：0=正常；1=踝关节出现红斑和轻微肿胀；2=踝关节到跖关节或掌关节红斑和轻微肿胀；3=踝关节到跖趾关节或掌关节出现红斑和中度肿胀；4踝关节到趾关节出现红斑和重度肿胀。最大评分为16分。 关节病理学评分关节病理学评分：滑膜细胞增殖评分：滑膜细胞增殖评分：0无增殖；1轻微增殖，24层滑膜细胞；2中度增殖，4层以上滑膜细胞；3滑膜细胞过度增殖，侵蚀软骨和骨，关节间隙消失。细胞侵蚀评分：细胞侵蚀评分：0无侵蚀；1较少的局部侵蚀；2广泛的局部侵蚀；3广泛侵蚀到关节囊，伴有凝聚体的形成。血管翳评分：血管翳评分：0无改

42、变；1两个部位出现血管翳；2四个部位出现血管翳，伴有软骨表明的侵蚀；3四个以上部位出现血管翳或二个部位出现大范围的血管翳。炎症评分：炎症评分：0正常；1轻度炎症，出现1个聚集物或较少的分散白细胞浸润；2中度炎症，2个或2个以上的白细胞聚集物；3重度炎症，白细胞融合、分散浸润明显。破骨细胞评分：破骨细胞评分：0正常；1较少破骨细胞（50%受累骨表面）。骨质侵蚀评分：骨质侵蚀评分：0正常；1小量侵蚀，12个小的浅部位；2少量侵蚀，14个中等大小和深度部位；3中等侵蚀，5个以上部位，局部侵蚀到骨皮质；4重度侵蚀，多重损伤，局部或完全侵蚀到骨皮质；5广泛损伤，皮质穿透骨长度的25%以上。例：例：AA大

43、鼠踝关节病理图片大鼠踝关节病理图片正常组正常组模型组模型组模型组模型组模型组模型组X线评分：线评分：软组织肿胀评分：软组织肿胀评分：0分正常；1分轻微的肿胀；2分中度肿胀；3分严重肿胀。骨侵蚀评分：骨侵蚀评分：0 分正常；1 分可疑或一个微小局部病灶；2分二个局部病灶或病灶总表面积50%；3分三个以上的病灶或病灶总表面积50%；4分关节面完全破坏，或出现骨缩小。关节间隙评分：关节间隙评分：0分正常；1分间隙内出现可疑或一个微小局部病灶；2分关节间隙出现狭窄；3分关节强直或关节间隙消失。AA大鼠踝关节大鼠踝关节X线摄片线摄片正常组正常组模型组模型组（十一）与关节炎细胞因子及其受体相（十一）与关节

44、炎细胞因子及其受体相关的其它小鼠模型关的其它小鼠模型 选择合适的关节炎模型是进行RA基础研究的首要环节，RA的动物模型种类较多。 近年来，随着转基因和基因敲除等生物技术的发展，自发性关节炎和基因转化动物关节炎已广泛应用于RA机制研究和药物筛选。 IL-1受体拮抗剂缺失小鼠 IL-6受体亚基gp130 Tyr-759点突变小鼠 人肿瘤坏死因子（TNF）转基因小鼠 人类T细胞白血病病毒1型（HTLV-I）转基因小鼠 T细胞受体的转基因小鼠 人(h) IL-1转基因小鼠三、骨关节炎模型三、骨关节炎模型 骨关节炎（骨关节炎（OA）和RA软骨破坏的病理机制存在着差异：RA的软骨破坏与炎症过程、滑膜组织增

45、生、软骨表面的亲和转移、软骨蛋白聚糖和胶原的同时降解密切相联；而OA的炎症仅是一个断断续续的事件，它对软骨的退化破坏不起作用，其中蛋白聚糖的降解是一个早期事件，而胶原的丧失到后期才发生。因此OA动物模型与RA动物模型不一样。（一）狗前十字韧带横切模型（一）狗前十字韧带横切模型 【基本原理】与人的前十字韧带破裂相似，狗的前十字韧带横切和随后的关节不稳定能引起进行性的软骨侵蚀、纤维性颤动及骨赘的形成。前十字韧带最初通过侧面切口进行横切，有些作者通过打开关节进行。两种方法均可导致形态学和生化学改变。（二）木瓜凝乳蛋白酶诱导的软骨降解模型（二）木瓜凝乳蛋白酶诱导的软骨降解模型【基本原理】 兔膝关节内注

46、射木瓜凝乳蛋白酶能导致软骨的降解及蛋白聚糖的迅速缺失。注射后不久出现的短暂炎症在12d后减退。软骨损害的严重度和可逆性可被不同的方法所改变。（三）（三）STR/1N小鼠自发性骨关节炎模型小鼠自发性骨关节炎模型【基本原理】STR/1N自发性OA模型的优点为OA逐渐发展，从软骨表面侵蚀及纤颤到骨赘形成，软骨下骨质改变，最后引起骨质致密化。在此过程中，仅有间歇性炎症发生，这同人OA相似，不受任何干扰。四、其它免疫性炎症模型四、其它免疫性炎症模型（一）实验性自身免疫性甲状腺炎模型（一）实验性自身免疫性甲状腺炎模型 （二）柯萨奇病毒（二）柯萨奇病毒B3诱导心肌炎模型诱导心肌炎模型 （三）实验性变态反应性

47、脑脊髓膜炎模型（三）实验性变态反应性脑脊髓膜炎模型 （四）自身免疫性眼色素层炎模型（四）自身免疫性眼色素层炎模型 （五）鼠免疫性胸膜炎（五）鼠免疫性胸膜炎（六）大鼠免疫性气囊滑膜炎（六）大鼠免疫性气囊滑膜炎 第第3节节 抗炎药物作用机制的研究方法抗炎药物作用机制的研究方法一、对炎症细胞功能的影响一、对炎症细胞功能的影响（一）多形核白细胞趋化性测定（一）多形核白细胞趋化性测定 【基本原理【基本原理】白细胞聚集是机体防御机制的一个重要方面。趋化因子能吸引白细胞至感染或炎症部位。测定白细胞趋化性的方法有琼脂糖法等。下面介绍一个测定多形核白细胞（PMNL）趋化性的简便方法培养板滤膜法。 Boyden小

48、室法，又称滤膜小室法小室法，又称滤膜小室法 该法采用特殊的培养板，培养孔中以一片212m孔径的微孔滤膜（聚碳酸酯膜）将培养孔分为上下两小室。一般来说，上室加受检的PMNL悬液；下室加细菌菌体或其产物、酵母菌活化的血清等趋化因子。置37 ，5%CO2的环境中培养数小时。上室中的PMNL因受下室内趋化因子的招引，使细胞由滤膜微孔穿过滤膜，附着在滤膜的下室面。所以该方法又称为Transwell法。一般来说，经过合适的培养时间，穿过膜的细胞数是一定的。Transwell法法三、花生四烯酸代谢测定三、花生四烯酸代谢测定【基本原理】花生四烯酸的不同代谢产物涉及炎症过程，细胞内磷脂在磷脂酶A2的作用下生成花

49、生四烯酸，花生四烯酸通过两种代谢途径代谢：环氧酶（COX）途径主要产生PGs和血栓素，5-脂氧酶（5-LOX）途径产生LT。经典的NSAIDs（如阿司匹林和吲哚美辛）主要抑制COX活性，5-LOX抑制剂作为潜在的高效抗炎药已引起了注意。对不同廿烷类的测定允许人们研究药物对AA特殊代谢途径的影响。 COX有两种异构体：COX-1为结构酶，存在很多组织中包括血小板中，结构酶途径产生的PGs发挥细胞保护作用，具有维持胃粘膜、肾脏血流量等重要作用，抑制COX-1活性则产生副作用。COX-2为诱导酶，仅在细胞激活特别是有丝分裂原和炎症刺激后才表达。因此，特异性抑制COX-2途径是新型抗炎药物的发展方向，

50、但由此引起的胃肠道和心血管副作用是不可忽视的。（一）人血小板（一）人血小板14C AA生成廿烷类实验生成廿烷类实验 【操作步骤】 （1）从健康志愿者臂静脉采血，收集于含0.38%（终浓度w/v）枸橼酸钠的塑料试管中，100 g离心15min，将富含2.5l011血小板的血浆置于20 保存，1h内进行试验。（2）富含血小板血浆与相等体积的枸橼酸盐/D-葡萄糖溶液（27.35g枸橼酸三钠2 H2O，1.47g枸橼酸和27.74g D (+)葡萄糖H2O加入1L水中）混合，1 000 g，4离心20 min。用相同体积的Dulbeccos液重新悬浮沉淀物。 （3）0.495ml的血小板悬液与实验药物

51、在37 孵育15min。加入5l L14C 的花生四烯酸溶液（50 Ci/mol，910-4Ci/L）。37反应5min加入0.5ml冰丙酮/0.1ml 1 mol/L HCl终止反应，冷却至0，用3ml乙酸乙酯提取2次，将两次有机提取物蒸干，残留物用0.2ml甲醇重溶。 （4）代谢产物用HPLC分离。流动速度1.5ml/min C-18柱（5m，1254.6 mm）之前连接有另一C-18柱（5 m，204.6 mm）。形成的14C廿烷类用液闪流动滑定仪进行分析，其放射色谱图与氚标的廿烷类进行比较分析。洗脱系统由下列溶剂混合液组成：l.72.5ml水/275ml乙腈/1ml乙酸（洗脱40min

52、）；700 ml甲醇/300mL水/1ml乙酸（洗脱40min）；纯甲醇（洗脱20min）。（二）胃粘膜花生四烯酸代谢产物的测定（二）胃粘膜花生四烯酸代谢产物的测定 【操作步骤】 从因良性或恶性胃病而进行胃切除术的胃样本上肉眼可见损害处切取至少5cm长的样品，样品包含粘膜和粘膜下层，用磷酸缓冲盐溶液冲洗干净，切成约4mm2的碎片，再用PBS冲洗，去多余液体。100mg碎片在4与药物或溶媒对照孵育30min，使药物与其作用部位达到平衡状态。弃孵育液（包括在药物完全发挥作用之前释放的PGs和脂氧酶产物），更换孵育液，再在37 孵育30min，取上清，用 RIA或ELISA测定PGs和LT等。（三）

53、人（三）人PMNL诱导性诱导性PGs途径刺激实验途径刺激实验 【操作步骤】（1）人PMNL用RPMI-l640配制成2.5109/L的悬液，与100mol/L乙酰水杨酸在37、5%CO2温育60 min。用培养液洗4次去乙酰水杨酸。（2）0.25ml人PMNL悬液（含白细胞2.5109/L）与0.1mg/ml LPS及实验药物至96孔培养板中温育18h。再加入7105 mol/L的钙离子载体A23187以诱导廿烷类的产生。在37 温育30min后培养板400g离心15min。 （3）用RIA法或ELISA法测定上清液中的PGE2含量。（四）（四）COX-1和和COX-2抑制实验抑制实验【操作步

54、骤】（1） COX-1可从公羊精囊中提取，COX-2可从绵羊胎盘中提取。 （2） 1单位COX-1或COX-2悬浮于1ml Tris-HCl缓冲液（100mmol/L，pH8）中。缓冲液中含正铁血红素和石炭酸作为辅因子。加入溶媒对照或实验药物在37 温育5min。加入10mol/L AA在37 继续温育2min。（3） 将试管置于冰浴上终止反应。用己烷（3ml）抽提过量的花生四烯酸 2次。RIA法或ELISA法测定上清中PGE含量。（五）（五）COX-1、COX-2和和COX-3的的mRNA 测定：测定：RT-PCR法法 （六）（六）COX-1、COX-2 和和COX-3的蛋白表达的蛋白表达

55、测定：测定：Western blot法法 （七）抑制炎症部位（七）抑制炎症部位PGs合成的体内实验合成的体内实验【操作步骤】（1）选用200g左右的雄性大鼠，致炎前或致炎后立即给药，在乙醚浅麻醉下，将浸有2%角叉菜胶的灭菌聚乙烯海绵（4cm1.5cm1.5cm），植入大鼠背部（肩胛间区）皮下。（2）24h后杀死动物，取出海绵，将其所含的渗出液轻轻挤入10ml生理盐水中，测定容量。（3）按Higgs法提取PGs样物质，水浴蒸干除有机溶剂后，加入Kerbs溶液5ml，供生物检定用。（4）PGs的生物检定，仿Sir John Vane法，采用大鼠胃条标本，按离体器官装置进行描记，用合成的PGE2作为

56、标准药。（八）抑制大鼠胃粘膜（八）抑制大鼠胃粘膜PGs合成的合成的体内实验体内实验【操作步骤】（1）选用200g左右的雄性大鼠，实验前禁食一夜，灌胃给药，24h内给药3次。（2）用乙醚麻醉致死，取出胃，冲洗除去胃内容物，分别切下贲门窦与胃体作标本（每3只鼠合为一份样品），每组分别测定贲门窦与胃体样品各四份。（3）称重，剪碎。分别按400mg/ml和900mg/ml的比例，将各份贲门窦和胃体样品置入充O2的Krebs溶液中，于37 孵箱温育15min，育毕，移置冰水浴中冷却，离心，分离上清液供生物鉴定用。（九）抑制（九）抑制LTB4合成的实验法合成的实验法【基本原理】取炎症模型渗出液中性白细胞，

57、加入钙离子载体A23187后，用高效液相的定量分析检测白细胞的LTB4生成量。亦可取RA患者（服药前、后）的外周血液，制备PMNL悬液，加入A23187，测定LTB4生成量。第第4节节 抗痛风药物的实验法抗痛风药物的实验法 痛风（痛风（Gout）是长期嘌呤代谢紊乱或尿酸排泄减少所致血中尿酸增高引起尿酸盐在组织沉积的一组疾病。临床特征是高尿酸血症、反复发作的急性关节炎，以及痛风石形成并沉积于关节、结缔组织和肾脏，导致关节活动障碍或畸形，肾尿酸结石或痛风性肾病。 一、一、 高尿酸血症动物模型高尿酸血症动物模型（一）高尿酸血症基因敲除模型（一）高尿酸血症基因敲除模型（二）高尿酸血症动物模型（二）高尿酸血症动物模型1. 大鼠高尿酸血症模型大鼠高尿酸血症模型2. 鸡高尿酸血症模型鸡高尿酸血症模型3. 鹌鹑高尿酸血症模型鹌鹑高尿