DNA文库的构建

1、第八章第八章 DNA文库的构建文库的构建掌握：基因组文库构建的基本原理和步骤、掌握：基因组文库构建的基本原理和步骤、 cDNA文库构建的基本原理和操作技术；文库构建的基本原理和操作技术；熟悉：熟悉：cDNA 第一链的合成、第一链的合成、cDNA 第二链的合第二链的合 成；成； 教学目的教学目的一、基因文库一、基因文库某一生物部分基因的集合叫某一生物部分基因的集合叫该生物的亚基因组文库。该生物的亚基因组文库。某一生物全部基因的集合某一生物全部基因的集合叫该生物的基因文库。叫该生物的基因文库。基因文库（基因文库（gene library)： 某个生物的基因组某个生物的基因组DNA或或cDNA片段与

2、适当的载片段与适当的载体在体在体外重组体外重组后，后，转化宿主细胞转化宿主细胞，并通过一定的选择，并通过一定的选择机制筛选后得到大量的机制筛选后得到大量的阳性菌落阳性菌落（或噬菌体），所有（或噬菌体），所有菌落或噬菌体的菌落或噬菌体的集合集合即为该生物的基因文库。即为该生物的基因文库。外源外源DNA片断、载体、宿主片断、载体、宿主n构建基因文库的基本程序：构建基因文库的基本程序：（1）提取研究对象基因组）提取研究对象基因组DNA,制备合适大小的制备合适大小的DNA片断，或提取组织或器官的片断，或提取组织或器官的mRNA并反转录成并反转录成cDNA，（2）DNA片段或片段或cDNA与经特殊处理的

3、载体连接形成与经特殊处理的载体连接形成重组重组DNA，（3）重组）重组DNA转化宿主细胞或体外包装后浸染受体转化宿主细胞或体外包装后浸染受体菌，菌，（4）阳性重组菌落或噬菌斑的选择。）阳性重组菌落或噬菌斑的选择。基因文库基因组基因组DNA文库文库cDNA文库文库基因组文库与基因组文库与cDNA文库最大的区别在于文库最大的区别在于cDNA文库具文库具有有时空特异性时空特异性。基因文库的应用：基因文库的应用：构建基因文库的目的：筛选出感兴趣的目的基因构建基因文库的目的：筛选出感兴趣的目的基因二、基因组二、基因组DNA文库的构建文库的构建（一）基因组（一）基因组DNA文库的类型文库的类型质粒文库，质

4、粒文库， （10kb)噬菌体文库，（噬菌体文库，（0-23kb )粘粒文库，粘粒文库， (45kb)人工染色体文库，人工染色体文库，(又称大片段基因组又称大片段基因组DNA文库，文库， 100kb1Mb）（二）文库的代表性和随机性（二）文库的代表性和随机性文库的代表性文库的代表性：指文库中所有克隆所携带的：指文库中所有克隆所携带的DNA片段可片段可以覆盖整个基因组，也就是说，可以从该文库中分离任以覆盖整个基因组，也就是说，可以从该文库中分离任何一段基因组何一段基因组DNA。一个完整基因组文库应包含克隆的数目，一个完整基因组文库应包含克隆的数目，Clark和和Carbon公式：公式： N=ln（

5、1-p）/ln（1-f） N：代表一个完全基因组文库所应该包含的重组克隆个数：代表一个完全基因组文库所应该包含的重组克隆个数 p：表示所期望的目的基因在文库中出现的几率：表示所期望的目的基因在文库中出现的几率 f：表示重组克隆平均插入片段的大小和基因组：表示重组克隆平均插入片段的大小和基因组 DNA 大小大小 的比值的比值 例：哺乳动物基因组：3109 Kb p：=99% 平均插入片段大小20kb f= 20Kb/3109 KbN=ln（1-p）/ln（1-f）=690773.2（三）、基因组（三）、基因组DNA文库的构建流程文库的构建流程n 载体的制备；载体的制备；n 高纯度大分子量基因组高

6、纯度大分子量基因组 DNA （High molecular weight DNA, HMW DNA）的提取；的提取；n HMW DNA 的部分酶切与脉冲电泳分级分离的部分酶切与脉冲电泳分级分离（PFGE size selection）；）；n 载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；载体与外源片段的连接与转化或侵染宿主细胞；n 重组克隆的挑取和保存。重组克隆的挑取和保存。 基因组基因组 DNA 文库的构建程序包含文库的构建程序包含 5 个部分：个部分：n1基因组基因组 DNA 文库的载体制备文库的载体制备 载体的制备要求两点，一是纯度高；二是去磷酸化好。载体的制备要求两点，一是纯度高；二是去

7、磷酸化好。n2高质量大分子量基因组高质量大分子量基因组 DNA 的提取和部分酶切的提取和部分酶切 构建不同大小插入片段的基因组文库对构建不同大小插入片段的基因组文库对 DNA 质量质量要求不同，一般所提取的要求不同，一般所提取的 DNA 分子量至少应该是文库分子量至少应该是文库最终平均插入片段长度的最终平均插入片段长度的 35 倍。实践表明，提取的倍。实践表明，提取的基因组基因组 DNA 分子量越大，所得到的重组克隆的插入片分子量越大，所得到的重组克隆的插入片段越大。段越大。 n寻找最适的载体与基因组之间的寻找最适的载体与基因组之间的比例比例。n首先最好选择转化效率高的进口感受态细胞或效价首先

8、最好选择转化效率高的进口感受态细胞或效价高且质量稳定的包装蛋白，高且质量稳定的包装蛋白，n对于电转化而言，选择合适的转化电压对不同插入对于电转化而言，选择合适的转化电压对不同插入片段的片段的 DNA 的转化效率也有所不同。的转化效率也有所不同。3文库的连接转化或包装侵染文库的连接转化或包装侵染n4文库的质量检测文库的质量检测克隆数越多，平均插入片段越长，插入效率和基因组覆盖度克隆数越多，平均插入片段越长，插入效率和基因组覆盖度越高，文库质量就越好。越高，文库质量就越好。一般覆盖倍数达到一般覆盖倍数达到4-6倍覆盖率。倍覆盖率。 指文库的对象不是全基因组范围，而是基因组的指文库的对象不是全基因组

9、范围，而是基因组的某一区段，如基因组某一特定大小酶切片段的组合，某一区段，如基因组某一特定大小酶切片段的组合，一条染色体或更小的区段（如一个一条染色体或更小的区段（如一个YAC或或BAC克隆克隆等）。等）。（四）、亚基因组文库（四）、亚基因组文库例如：将基因组DNA用多种限制性内切酶切割，Southern杂交显示目标基因在8.3kb的Spel片段上则可将Spel酶切的基因组DNA中的8.3kb片断回收，用于构建DNA文库。三、三、cDNA文库的构建文库的构建1、cDNA文库的特征文库的特征1）基因表达的时空性决定）基因表达的时空性决定cDNA文库的取材，文库的取材， 构建构建cDNA文库时最好

10、选取目的基因表达量最高的文库时最好选取目的基因表达量最高的 发育时期或这一时期的特殊组织。发育时期或这一时期的特殊组织。 根根 叶叶 花花 花药花药 茎茎 穗下节穗下节 幼胚幼胚GAmyb2）表达量的差异决定构建）表达量的差异决定构建cDNA文库要具有合适的容量。文库要具有合适的容量。3)mRNA的丰度的丰度高丰度高丰度mRNA：5000多个拷贝，占总多个拷贝，占总mRNA的的22% 中等丰度中等丰度mRNA：200-300个拷贝，占总个拷贝，占总mRNA的的49%低丰度低丰度mRNA：1-15个拷贝，占总个拷贝，占总mRNA的的29%2、均一化、均一化cDNA文库文库 通过一定的策略和方法，

11、将构建好的独立通过一定的策略和方法，将构建好的独立cDNA文库进行一定处理，降低高丰度和中等丰度文库进行一定处理，降低高丰度和中等丰度基因在基因在cDNA文库中的比例，从而使高丰度、中等文库中的比例，从而使高丰度、中等丰度和低丰度基因在文库中出现的频率相对一致，丰度和低丰度基因在文库中出现的频率相对一致，这种这种cDNA文库称均一化文库称均一化cDNA文库。文库。n3、cDNA文库的构建文库的构建 第一，细胞总第一，细胞总 RNA 的提取和的提取和 mRNA 分离；分离； 第二，第一链第二，第一链 cDNA 合成；合成； 第三，第二链第三，第二链 cDNA 合成；合成； 第四，双链第四，双链

12、cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体克隆进质粒或噬菌体载体 并导入宿主中繁殖。并导入宿主中繁殖。 插插1）mRNA的完整性及的完整性及mRNA的富集的富集 通常是根据通常是根据28sRNA和和18sRNA条带的亮度判断条带的亮度判断RNA的的完整性，间接判断完整性，间接判断mRNA的完整性。的完整性。 如果电泳观察到的如果电泳观察到的28SrRNA条带的亮度约为条带的亮度约为18SrRNA条条带亮度的两倍，说明带亮度的两倍，说明RNA样品完整，降解不多，如果两条带样品完整，降解不多，如果两条带的亮度反过来，说明部分的亮度反过来，说明部分28SrRNA已降解；如无清晰条带，已降解；如无清晰条带，表明

13、样品己严重降解。表明样品己严重降解。 mRNA的富集对低丰度的富集对低丰度mRNA显得特别重要。显得特别重要。2）第一链）第一链 cDNA 合成合成由由mRNA到到cDNA的过程称反转录，由反转录酶催化。的过程称反转录，由反转录酶催化。反转录酶：依赖反转录酶：依赖RNA的的 DNA聚合酶，需要引物聚合酶，需要引物反转录引物：反转录引物：oligo(dT)引物和随机引物（不能产生引物和随机引物（不能产生完整的完整的cDNA)3)第二链第二链cDNA的合成的合成 氢氧化钠消化杂合双链中的氢氧化钠消化杂合双链中的 mRNA 链链 第一链第一链 cDNA 的的 3-末端就会形成一个发夹环末端就会形成一

14、个发夹环 合成第二链合成第二链cDNA S1 核酸酶消化连接处核酸酶消化连接处 自身引导法合成自身引导法合成cDNA第二链第二链常用方法常用方法1）它是以）它是以cDNA的第一条链为模板，设计并合成一组的第一条链为模板，设计并合成一组引物，通过引物，通过PCR扩增获得多拷贝双链扩增获得多拷贝双链cDNA,由于其由于其放大的高度灵敏性，放大的高度灵敏性，PCR合成法能利用非常有限的合成法能利用非常有限的生物材料构建生物材料构建cDNA文库，特别适合低拷贝文库，特别适合低拷贝mRNA的克隆。的克隆。2）同时，可用总）同时，可用总mRNA作为合成作为合成cDNA第一链的模板，第一链的模板，不用纯化不

15、用纯化mRNA，所以避免了纯化过程中某些信息，所以避免了纯化过程中某些信息分子的丢失。分子的丢失。3）PCR合成合成cDNA第二链是通过在第一链第二链是通过在第一链3端同聚物端同聚物加尾的方法实现的，不会丢失其末端的最后几个核加尾的方法实现的，不会丢失其末端的最后几个核苷酸，所以容易得到完整的苷酸，所以容易得到完整的cDNA。PCR合成法是构建合成法是构建cDNA文库的一种新策略，文库的一种新策略，已得到广泛应用。优点：已得到广泛应用。优点：n4、双链、双链cDNA的分级分离的分级分离 连接前回收大于连接前回收大于500bp的的cDNA用于连接。去掉用于连接。去掉引物、街头及反转录产生的各种不

16、完整的引物、街头及反转录产生的各种不完整的cDNA链，链，提高文库质量。提高文库质量。5、双链、双链cDNA与载体连接与载体连接1）同聚物加尾：）同聚物加尾：2）加接头引入酶切位点，）加接头引入酶切位点，添加带有限制性酶切位点的添加带有限制性酶切位点的接头是最常用的方法接头是最常用的方法3）cDNA的定向插入：的定向插入：cDNA两端添加不同的两端添加不同的限制性酶限制性酶切位点，双酶切后与对应的双酶切载体连接切位点，双酶切后与对应的双酶切载体连接末端转移酶末端转移酶+dCTP末端转移酶末端转移酶+dGTP载体和载体和cDNA退火退火同聚物加尾法：同聚物加尾法：CH3CH3CH3CH3CH3C

17、H3接头加接头加接头ds-DNA合成 与SalI匹配接头相连NotI酶切1)SalI/NotI 2)T4 DNA ligase NotI primer/adaptorcDNA重组子载体SalI adaptorcDNA的定向插入的定向插入 6、cDNA文库的载体选择文库的载体选择 一般一般cDNA的长度范围多在的长度范围多在0.5-8kb之间，之间，因此不用考虑外源片段的长度。因此不用考虑外源片段的长度。质粒载体或噬菌体载体质粒载体或噬菌体载体7、cDNA文库的均一化处理文库的均一化处理均一化均一化cDNA文库：文库：是指某一特定组织或细胞的是指某一特定组织或细胞的所有所有表达基因表达基因均包含

18、其中，且在均包含其中，且在 cDNA 文库中表文库中表达基因对应的达基因对应的 cDNA 的的拷贝数相等或接近拷贝数相等或接近。 均一化均一化 cDNA 文库是文库是克服克服由于基因转录水平由于基因转录水平上巨大差异给文库筛选和分析带来障碍的有效措上巨大差异给文库筛选和分析带来障碍的有效措施，有利于研究基因的表达和序列分析。施，有利于研究基因的表达和序列分析。 构建均一化构建均一化cDNA文库主要有两种途径：文库主要有两种途径：基因组基因组DNA饱和杂交法饱和杂交法基于复性动力学原理的均一化学法基于复性动力学原理的均一化学法基因组基因组DNA饱和杂交法饱和杂交法n理论基础：不同表达水平的基因对

19、应的基因组拷理论基础：不同表达水平的基因对应的基因组拷贝数相对一致。贝数相对一致。n步骤：步骤：1）基因组）基因组DNA的酶切、固定的酶切、固定2）基因组）基因组DNA变性成单链变性成单链3）分离纯化）分离纯化cDNA文库的混合质粒文库的混合质粒4）文库）文库DNA与固定的基因组与固定的基因组DNA充分饱和杂交，固充分饱和杂交，固定相应的定相应的cDNA,5) 洗脱洗脱cDNA并重新转化受体菌。并重新转化受体菌。限制：由于基因组的复杂性，很难获得覆盖基因组的限制：由于基因组的复杂性，很难获得覆盖基因组的 单链单链DNA 片段，导致文库内基因的丢失。片段，导致文库内基因的丢失。 理论基础：复性动

20、力学原理理论基础：复性动力学原理 cDNA文库中高丰度文库中高丰度cDNA复性所需时间较短，低丰度复性所需时间较短，低丰度cDNA复性所需时间较长，通过控制复性时间可使高丰复性所需时间较长，通过控制复性时间可使高丰度的度的cDNA复性成双链状态，而低丰度复性成双链状态，而低丰度cDNA仍保持单仍保持单链状态，分离单链链状态，分离单链cDNA，转化宿主细胞，即可得到均，转化宿主细胞，即可得到均一化一化cDNA文库。文库。基于复性动力学原理的均一化方法基于复性动力学原理的均一化方法四、基因克隆的筛选策略四、基因克隆的筛选策略1、表型筛选：、表型筛选： 在宿主菌中表达目的基因，使宿主产生新的在宿主菌

21、中表达目的基因，使宿主产生新的表型或使宿主恢复其突变基因的表型来筛选目的表型或使宿主恢复其突变基因的表型来筛选目的基因。基因。(1)抗药性筛选抗药性筛选:这是利用载体这是利用载体DNA分子上的抗药性选择标记进行的筛选方法。分子上的抗药性选择标记进行的筛选方法。(2)插入失活筛选法插入失活筛选法(3)显色反应选择法显色反应选择法(-互补法互补法) 将含有将含有-半乳糖苷酶基因（半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和）的调控序列和氨基端（氨基端（N端）端）146个氨基酸编码序列的质粒转化个氨基酸编码序列的质粒转化至可编码至可编码-半乳糖苷酶羧基端（半乳糖苷酶羧基端（C端）部分序列的端）部分序列的宿

22、主细胞中，可使各自无活性的片段实现互补，融宿主细胞中，可使各自无活性的片段实现互补，融为一体，产生具有酶学活性的蛋白，从而使转化的为一体，产生具有酶学活性的蛋白，从而使转化的宿主菌在含有宿主菌在含有IPTG/X-gal(异丙基异丙基-D-硫代半乳糖硫代半乳糖苷苷/5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-硫代半乳糖苷硫代半乳糖苷)的培养基的培养基上产生蓝色菌落，这种现象就称为上产生蓝色菌落，这种现象就称为-互补。互补。2、PCR筛选法筛选法主混合池主混合池行混合池行混合池列混合池列混合池分别分别PCR扩增扩增引物：引物：1）同源引物）同源引物 邻近种属的相应基因邻近种属的相应基因2）根据氨基酸序列

23、设计简并）根据氨基酸序列设计简并 引物引物3、菌落原位杂交法、菌落原位杂交法探针：探针：1）同源）同源DNA探针探针 邻近种属的相应基因邻近种属的相应基因2）根据氨基酸序列设计简并）根据氨基酸序列设计简并 探针探针4、免疫筛选、免疫筛选需制备目的基因产物的抗体进行筛选。需制备目的基因产物的抗体进行筛选。5、酵母双杂交系统、酵母双杂交系统典型的真核生物转录因子（如典型的真核生物转录因子（如GAL4）含有两个不同结构域）含有两个不同结构域: DNA结合结构域结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域和转录激活结构域(transcription-activating doma

24、in)。前者可识别前者可识别DNA上的特异序列，上的特异序列， 并使转录激活结构域定位于并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，所调节的基因的上游， 转录激活结构域可同转录复合体的其他转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。成分作用，启动它所调节的基因的转录。 二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。能。而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋

25、白蛋白的相互作用。白蛋白的相互作用。主要有二类载体主要有二类载体: a 含含DNA -binding domain的载体的载体; b 含含DNA-activating domain的载体。的载体。 n限制性核酸内切酶分析限制性核酸内切酶分析nSouthern杂交杂交n体外表达蛋白体外表达蛋白nDNA序列分析序列分析，最准确和可靠的鉴定方法，最准确和可靠的鉴定方法五、克隆基因的验证和分析五、克隆基因的验证和分析n根据载体选择保存文库的方法根据载体选择保存文库的方法n文库阵列法（文库阵列法（无菌培养板无菌培养板）保存大片段）保存大片段DNA文库文库n长期保存需在长期保存需在-80下进行下进行n避免

26、文库的反复冻溶避免文库的反复冻溶六、六、DNA文库的保存文库的保存基因组基因组DNADNA文库与文库与cDNAcDNA文库的比较文库的比较n1）cDNA文库所包含的遗传信息要远远少于基因组文库所包含的遗传信息要远远少于基因组DNA文库，并且受细胞来源或发育时期的影响。文库，并且受细胞来源或发育时期的影响。n2）cDNA文库虽能反映文库虽能反映mRNA的分子结构和功能信的分子结构和功能信息，但不能直接获得基因内含子序列和基因编码区外息，但不能直接获得基因内含子序列和基因编码区外大量调控序列的结构与功能方面信息。大量调控序列的结构与功能方面信息。n3）在）在cDNA文库中，相应于高丰度文库中，相应

27、于高丰度mRNA的的cDNA克克隆所占的比例比较高，分离起来比较容易，而相应于隆所占的比例比较高，分离起来比较容易，而相应于低丰度低丰度mRNA的的cDNA克隆所占的比例则比较低，因克隆所占的比例则比较低，因此分离也就比较困难。此分离也就比较困难。 七、目的基因的克隆七、目的基因的克隆 基因工程或基因工程或DNA重组技术的前提条件是从生物体基因组重组技术的前提条件是从生物体基因组中分离克隆目的基因。目的基因获得之后，或确定其表达调中分离克隆目的基因。目的基因获得之后，或确定其表达调控机制和生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济控机制和生物学功能，或建立高效表达系统，构建具有经济价值的基因工程菌（细胞），或将目的基因在体外进行必要价值的基因工程菌（细胞），或将目的基因在体外进行必要的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的遗传性状，的结构功能修饰，然后输回细胞内改良生物体的遗传性状，包括人体基因治疗。包括人体基因治疗。目的基因的克隆战略：目的基因的克隆战略：1、构建感兴趣生物个体的基因组文库（、构建感兴趣生物个体的基因组文库（鸟枪法鸟枪法克隆目的