06质量07研究生2017届

1、题目：芋螺毒素作用靶位鉴定及抗毒素作者签名: 指导教师签名: 评 阅 人1 ：，评阅人 2：，答辩委员会：，委员 1：，委员 2：，委员 3：，委员 4：，答辩日期： 二一七年五月十七日大学性本人，所呈交的是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了中特别加以标注和致谢的地方外，中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得大学或其他的学位或而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在明确的说明。本人完全本的法律结果由本人承担。作者签名：年月日大学使用书是本人在大学攻读 硕 （博/本学位期间在导师指导下完成的。本的研究成果归大学所有，本的研究内容不得

2、以其它的名义发表。本人同意大学有关保留、使用的规定，即：学校保留，被查阅和借阅；学校可以公布的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它保留；学校可根据国家或湖南省有关部门规定送交。同意学校将加入优秀博全文数据库，并按优秀博全文数据库章程规定享受相关权益。同意科学研究所将本收录到中国全文数据库，并通过网络向公众提供服务。对于涉密的学位，后适用该。作者签名：年月日导师签名：年月日指导小组成员副教授教授副教授林国平副教授谭锬博士本研究受到下列科研项目资助本研究得到湖南省自然科学基金面上项目（项目批准号：2016JJ2113）、湖南省自然科学基金青年项目（项目批准号：14JJ3104）湖南省教育厅资助

3、项目（项目批准号：16A186）、重点研发计划资助项目(2016YFC1202902) 共同资助，在此特别予以致谢！芋螺毒素作用靶位鉴定及抗毒素摘要目的：本课题组前期从中获得一系列含新半胱氨酸框架A-超及超芋螺毒素，本开展了新芋螺毒素的及了毒性极强a-芋其对型乙酰胆碱受体作用活性的测定；此外螺毒素 GI 的抗毒素并测定其抗毒活性。上述工作为发现新的镇痛分子、特异神经药理学的研究工具及芋螺毒素的治疗等奠定基础。：采用Fmoc-固相肽法芋螺毒素线性肽，裂解后通过空气氧化折叠法获得含二硫键的芋螺毒素，再利电极电压钳方型乙酰胆碱受体靶点；将a-芋螺毒素 GI法测定各肽是否作用于与戊二醛反应，然后将其偶

4、联至 BSA 上，将上述偶联产物免疫，抗血清，并测定抗血清对 GI 毒素的中和活性。结果：（1）了 10 个含 4 个单 C 的 A 超芋螺毒素以及独特的二硫键框架结构的芋螺毒素 Mr6 和 Eb5。（2）着重筛选了 5 个芋螺毒素对 nAChRs 910 抑制活性，结果表明，Bt22.1 可选择性抑制nAChRs 910，其IC50 为 124.6 nM，而 Bt14.12、Bt14.5、Eb5 及Mr6 对 nAChRs 910 活性较低（IC50>10 mM）；进一步研究表明Bt22.1 对 24、34、44、7 的抑制活性很低（IC50>10 mM），显示其具有很高的选择性

5、。（3）Eb5 则能选择性抑制人肌肉型 nAChRs，其IC50 为 142.8nM，而与之相差一个氨基酸的 Mr6 对肌肉型乙酰胆碱受体在 10 mM 抑制率也可达 95%以上。（4）GI-BSA 偶联的 SDS-PAGEI偶联。 GI-BSA（99 mg/只）第四次免蛋白电泳显示 GI 与 BSA疫后第 10 天抗血清中和滴度效价大于 1:64000。混合 100 ml 及 200 ml抗血清与 1 个 LD50 或高于 LD50 剂量 GI，腹腔注射，100l 血清可保护 1×LD50 毒素（12.5 g/kg）组75%存活，200 l 血清可保护 25.8g/kg 毒素组75

6、%存活。（5）此外，本探索了 GI 与八分肽偶联及带有保护基团 GI 与五乙烯六胺反应新型抗原试验，结果表明偶合物组分较杂，需进一步反应条件。结论：新型芋螺多肽 Bt22.1 选择性抑制 nAChRs 910 亚型，Eb5、Mr6 选择性抑制肌肉型 nAChRs，该类芋螺毒素二硫键框架新颖，此类芋螺多肽的作用靶点发现将为其功能研究、进一步改造及应用提供重要的依据。从GI-BSA 半抗原免疫的中提取的抗血清对 GI 毒素具有明显的解毒作用。：型乙酰胆碱受体；抗毒素；抗毒活性芋螺毒素；IIFunctionalCharacterizationofnovelConotoxinsandPreparati

7、on of -Conotoxin GIserumYiFei Tang (Biology)Directed by Associate Prof.Hu and Prof. Qiuyun DaiObjective: A series of the novel A-, M-superfamily conotoxins with newframework,whichwereclonedfromtheSouthSea,weresynthesized and functionally characterized using nicotinicacetylcholinereceptors (nAChRs) e

8、xpressed on Xenopus oocytes. Inaddition, thetoxin of a-conotoxin GI with the high toxicity was prepared and itsneutralization activity was tested. All the efforts will make the foundationfor finding new analgesic molecules or neuropharmacological researchtools as well as the development of therapeut

9、ical treatments of conotoxinpoisonings.Methods: the linear peptide toxins were synthesized using Fmoc- solidphase synthsis method. After the cleavage of peptide-resins and thefollowing air oxidation of linear peptides, the aim conotoxins with two orthree disulfide bridges were prepared. The effects

10、of conotoxins onneuronal and muscular nAChRs were determined using two electrodevoltage clamp method. The a-GI-BSA hapten was prepared with the BSAcoupled by the reaction product of a-GI and glutaraldehyde, the other GIhaptens were prepared by the Fmoc-protected GI coupled with multipleIIIgen peptid

11、e resins or pentaethylenehexmine. After the immunization ofthe GI-BSA hapteninmice, theserumwascollected anditsneutralization activity was determined.Results: （1）Ten A-superfamily conotoxins with four single cysteines andtwo M-superfamily conotoxins Mr6 and Eb5 with a new framework wereprepared.（2）T

12、he effects of Bt14.12, Bt14.5, Bt22.1, Eb5 and Mr6 on the910 nAChRs were determined. The results showed that Bt 22.1 potentlyinhibited the 910 nAChRs with the IC50 of 124.6 nM, while Bt14.12、Bt14.5、Eb5、Mr6 did not exhibit apparent inhibitory activity (IC50 > 10M). Further investigation showed tha

13、t Bt 22.1 had not significantinhibitory activity to the 24, 32 and 44 (IC50>10 M). (3) Eb5selectively inhibited the human muscular nAChRs with the IC50 of 124.6nM, 10 M of Mr6 also inhibited the human muscular nAChRs by 95%. (5)The SDS-PAGE protein electrophoresis showed that the coupling reactio

14、nof GI with BSA was successful. Each mouse was immunized four timeswith 99 mg every two weeks. After the fourth immunization, the serumneutralization titer was more than 1:64000. After the intraperitonealinjection of the mixture of 100 l and 200 l of theserum and1×LD 50or higher dose of GI LD50

15、 with, 75% of mice survived in the group of 100l of theserum and 1× LD50 GI (12.5 g/kg), 75% of mice alsosurvived in the group of 200 l of serum and 25.8 g/kg of GI. (5)Thesynthesis of the a-GI-branched peptide and the coupling reaction of a-GIIVwith pentaethylenehexmine were also investigated.

16、 The results showedthat the coureaction products were complex, and the reactionconditions need to be improved.: Bt22.1 specifically inhibited the neuronal 910 nAChRs,Eb5 and Mr6 specifically inhibited muscular nAChRs.The two conotoxinscontain novel Cys framework, our discovery on their targets will

17、lay thefoundation for the further studies of the function, modification andapplication. In addition, theserum produced by immunizing mice withGI-BSA hapten exhibits significant detoxication activity to conotoxin GI.Keywords: conotoxins;nAChRs;toxins;neutralization activitiesV目录摘要I中英文缩略词简表VIII第 1 章绪论

18、1第 2 章 芋螺毒素及作用靶点测定32.1 引言32. 2 实验材料及仪器42.2.1 实验材料42.2.2 实验仪器52.3 实验. 62.3.1 芋螺多肽62.3.2 (GI)8-八分肽.72.3.3 线性 GI 手工大量.82.3.4 双电极电压钳测定多肽活性82.4 实验结果152.4.1 各多肽、裂解及纯化 HPLC 结果152.4.2 nAChR 各质粒线性化及体外转录202.4.3 芋螺多肽对型 nAChR 的初筛结果20第 3 章芋螺毒素 GI 抗血清及中和活性研究233.1 引言233.2 实验材料与仪器233.2.1 实验材料233.2.2 实验仪器243.3 实验. 2

19、43.3.1GI 毒素.243.3.2戊二醛备半抗原 GI-BSA243.3.3免疫及抗血清.263.3.4 抗体中和活性测定27VI3.3.5 统计分析273.4 实验结果273.4.1 GI 与 BSA 蛋白偶联结果27免疫结果283.4.23.4.3GI 半数致死量和抗体中和活性测定29第 4 章 讨 论314.1 Bt22.1 的作用靶标314.2 Eb5 的作用靶标324.3 GI 抗毒素活性324.4 GI 八分肽及五乙烯六胺偶合物的. 33第五章 结 论34第六章文献综述35-及 M-芋螺毒素研究进展356.1芋螺毒素概述356.2型乙酰胆碱受体概述356.3 芋螺毒素的作用靶位

20、366.4M-超芋螺毒素396.5 -GI 的毒性及抗毒素406.6本对芋螺毒素研究进展40参考文献42附录 I 本涉及其余多肽及抗-HPLC 分析图50期间取得的研究成果52致 谢53VII中英文缩略词简表缩写英文名称中文名称APmAChR nAchR 5-HT GABA HPLCAmp kd nA rpm SDSTAEAmmmonium persulfale Muscarinic acetylcholine recpter nicotinic acetylcholine receptor 5-hydroxy trptamine-Aminobutyric acidHigh Performan

21、ce Liquid Chromatography Ampicillinkilo Dalton nanoampere round per minuteSodium dodecyl sulfateTris(hydroxymethyl)methyl aminomethane过硫酸胺毒蕈碱型乙酰胆碱受体型乙酰胆碱受体5-羟色胺g-氨基丁酸 高效液相色谱氨苄青霉素千纳安转每分钟十二烷基硫酸钠三羟甲基氨基甲烷/乙酸/乙二胺四乙酸缓冲液THAM/acetate/Ethylene Tetraacetic Acid buffer acetamidomethy Dicyclohexylcarbodiimide d

22、ichloromethaneDL-Dithiothreitol9-Fluorenylmethyloxycarbonyl amino acidDiamineAcm DCC DCM DTTFmoc AA HEPES NMP TFAdd H2O cRNA HOBTHBTU乙酰胺基甲基二环己基碳二亚胺二氯甲烷1,4-二巯基苏糖醇9-芴甲氧羰基氨基酸4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonicaci N-methyl-2-pyrrolidonetrifluoroacetic acidReverse cholesterol transport capped R

23、NA1-HydroxybenzotriazoleO-Benzotriazole-N,N,N,N4-羟乙基哌嗪乙磺酸N-甲基吡咯酮三氟乙酸去离子蒸馏水加帽 mRNA1-羟基苯并三唑O-苯并三氮唑-四甲基脲VIII-tetramethyl-uronium-hexafluorophosphateN,N-Diisopropylethylamine六氟磷酸盐DIEA SPPSAla Cys Ser Asn Pro His Arg Glu Gly Ile Leu Phe Tyr ValPBSN,N-二异丙基乙胺solid-phase peptide synthesis alaninecysteine se

24、rine asparagine proline histidine arginine glutamine glycine isoleucine leucine phenylalanine tyrosine valinePhosphate Buffer多肽固相丙氨酸半胱氨酸丝氨酸天冬酰胺脯氨酸组氨酸精氨酸谷氨酸甘氨酸异亮氨酸亮氨酸苯丙氨酸酪氨酸缬氨酸磷酸盐缓冲液IX大学第 1 章绪论前期本利用A-超保守内含子从桶形芋螺中克隆了一些含四个单 Cys 的 A-超毒素，其序列见表 2-1。这类芋螺毒素的四个半胱氨酸间距不同（CX2CX4CX6C）且两个不同的二硫键连通性在 A-超芋螺毒素中很罕见，根据

25、其特征信号肽序列和独特的排列半胱氨酸残基，我们认为其可能对 910 受体有一定作用。此外，从大理石芋螺（Conus marmoreus）和黑星芋螺(Lithoconus eburneus)分离的两个新 M多肽 Mr6、Eb5，这两个多肽含有一个新半胱氨酸的骨架(C-CC-C-C-C)。前期镇痛活性研究表明，0.4 nmol/kg 级 Mr6 对大鼠坐骨神经结扎模型（PNL）具有很好镇痛活性，但作用靶点未知。GI 是一类毒性极强，能快速导致对象肌肉麻痹及呼吸抑制，已被列为生物战剂的毒素小肽。目前临并无有效可用于 GI 毒素治疗。本研究开展芋螺毒素 GI抗血清，验证其抗血清的中和活性，通过优化 G

26、I 毒素与牛血清蛋白偶联条件及免疫，的抗血清具有明显的抗毒活性。目前文献的多肽抗原大部分是多肽与蛋白偶联，由于偶合比例、位点不易，需要设计均一、模的半抗原。Lys 八分肽利用多聚赖氨酸两个氨基可与两个多肽发生缩合反应，从而偶联 8 个多肽形成八分肽(如图 1.1 和图 1.2)，增加多肽分子量，目前文献中的是逐步氨基酸偶合，分子量不均一、副产物过多的问题，上述基于 GI 与 BSA 偶联的半抗原免疫效果均不够理想，这可能与 GI 毒素很短（13 个氨基酸两对二硫键）免疫原性不足有关。本课题主要开展 A-、M-超要研究内容如下：芋螺毒素作用靶点的发现及 GI 抗毒素的研究，主（1）了等10条芋螺

27、多肽，并通过氧化折叠、富集、纯化得到纯品肽。（2）利电极电压钳测定其中Bt14.5、Bt14.12、Bt22.1、Mr6、Eb5五条多肽的作用靶点，为其可能的药理学应用奠定基础。（3）利用BSA大蛋白偶联GI得到半抗原，免疫得到抗毒素血清并测定GI抗毒素活性，为GI治疗提供。（4）利用带保护基的GI与多聚赖氨酸或者五乙烯六胺反应，再温和裂解得到线性1大学多分支肽，经氧化折叠得到目标八分肽。上述工作对新型 A-、M-超芋螺多肽的作用靶点发现以及毒性极强芋螺毒素GI 的抗毒素研究具有重要意义。图 1.1 八分肽步骤图 1.2 Lys 八分肽框架结构2大学第 2 章 芋螺毒素及作用靶点测定2.1 引

28、言本章内容为新型芋螺毒素（表 2-1）的及其作用靶点鉴定。毒素线性肽-树脂采用经典的 Fmoc 固相法。然后用三氟乙酸脱除保护，获得的线性肽经氧化折叠形成折叠产物，并用反相色谱进行富集及纯化，冻干后获得目标肽，采用 HPLC 及质谱确定其纯度及分子量。各毒素对 nAChRs 亚型的作用活性采电极电压钳：对已有型乙酰胆碱质粒进行扩增，利用单酶切将质粒线性化，通过体外转录获得所需 cRNA，然后将 nAChR的 cRNA,显微注射到爪蟾细胞中，使 cRNA在爪蟾细胞内表达并在膜表面形成同或异五聚体通道，利电极电压钳记录激发的受体电流，从而测定各芋螺多肽与 nAChR 各亚型的结合作用。表 2-1

29、芋螺毒素序列毒素名称氨基酸序 列Bt14.12GDCKPCMHPDCRFNPGRCR-NH2 DDCVPCMRPACGIHFGEC-NH2VTCKPCVNACGINRGKC-NH2Bt14.2Bt14.4KDCTYCMHSSCSMMYEKCR-NH2 NNCIPCSHSSCGINYGKCL-NH2 DDCRLCMHPDCRFNRGRCR-NH2 DDCRLCMHPDCRFNRGSCR-NH2 DGCVPCMRPACGIHFGEC-NH2 NECDNCMRSFCSMIYEKCR-NH2 DDCRPCMHPACGFNYGKC-NH2SGCGYLGEPCCISPKRAYCHGDLEBt14.6Bt1

30、4.13Bt14.5Bt14.8Bt14.9Bt14.18Bt22.1Eb5VAMCVN-NH2Mr6SGCGYLGEPCCVAPKRAYCHGDLEVAMCVN-NH2ECCNPACGRHYSC*GI*:C 端酰胺化；g:羧基化谷氨酸；#：C 端游离羧基；半胱氨酸字体加粗3大学2. 2 实验材料及仪器2.2.1 实验材料实验动物Nasco 公司，部分购自实验动物采用成熟的非洲雌性爪蟾，部分购自所。爪蟾饲养于透明洁净的缸中，其中的饲养水放置在敞口的箱顶容器中曝气一到两天，饲养水保持 10-18cm 深，为保持水质洁净，需至少每两日进行一次换水，同时仔细擦拭缸保持清洁。取新鲜的猪肝切成黄豆大小的

31、碎块，每周喂食爪蟾两次，每只爪蟾约喂食约 2-4 小碎块。化学试剂HOBt 和 HBTU、DIC 均购自上海吉尔生化公司；哌啶，西陇化工；DIEA，上海吉尔生化公司；DTT，Promega 公司；三异丙基硅烷，上海诺泰化工；乙腈，安庆时联特种溶剂公司；Rink 树脂（取代率为 0.6mmol/g）购自 Advanced ChemTech。分子生物学试剂： SP6、T7 体外转录试剂盒、矿物油，Sigma 公司；DH5 感受态细胞、无内毒素质粒中提试剂盒（世纪）；DNA Marker（天根生物科技公司）；LB 液体培养基（扩增感受态细胞）、LB 固体培养基（培养阳性克隆细菌）、ND96细胞培养液

32、（自配）、ND96 细胞（Sigma 公司）。液（自配）、OR2 消化液（自配）、蛋白酶 K其余试剂：带有 Fmoc 侧链保护基团的氨基酸：Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH 、 Fmoc-Gln(Trt)-OH 、 Fmoc-Glu(OtBu)-OH 、 Fmoc-Gly-OH 、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OHFmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc

33、-Tyr(tBu)-OH，均为上海吉尔生化公司；三氟乙酸（TFA）纯度大于 99%，购自偶合科技，为国内分装的进口试剂；二氯甲烷、甲醇、Tris 平衡酚、4大学无水乙醇，无水乙醚，乙酸铵，冰醋酸等常用化学试剂均为分析纯级，购自化学试剂；BSA（Serva 公司）、电极（WPI 公司）；胶原酶，SDS，氯化镁，氯化钠，氯化钾，氯化钙，HEPES 等试剂购自 Sigma 公司；链霉素，青霉素购自 Hyclone，Themo 公司。2.2.2 实验仪器多肽及纯化所需仪器：Zinsser Analytic Peptide Synthesier 型多肽高效液相色谱仪（Agilent 1200 HPLC）

34、，半型高效液相色谱仪（Waters 625），仪，德国 Zinsser Sofars； Agilent 公司；Waters 公司；型高效液相色谱仪（Waters Delta Prep 4000， HPLC 分析仪 (EasySep-10100)，上海通微；C18 分析柱( Kromasil，5µm ，4.6mm×250mm) ，Waters 公司；分析仪器厂；C18半柱( Kromasil，5µm ，10 mm×250 mm)，分析仪器厂。细胞培养及电压钳检测所需仪器：涡旋振荡器( Genie-1)，Scientific Industries 公司；真空

35、旋转蒸发仪，BUCHI 公司；冻干机（RLPHR 1-2LD），德国，CHRIST 公司；培养皿生化培养箱，上海一恒科学仪器；微电极拉制仪（P-97），sutter 公司；数字转换器（1440A），Axoclamp 公司；放大器（900A），Axoclamp 公司；体视显微镜（SMZ800），Nikon 公司；微操纵仪，WPI 公司；微注射器（Nanoliter 2000）WPI 公司；超净工作台，半导体一厂；电泳仪（EPS601），Amersham Biociences；5大学电泳凝胶成像仪（Gel DocXR），BIO-RAD 公司；MPS-2 灌流，WPI 公司；恒流蠕动泵，保定兰格公司

36、；2.3 实验2.3.1 芋螺多肽2.3.1.1线性肽采用带有 Fmoc-保护基团的氨基酸和 Wang 树脂或者 Rink 树脂，以 HOBt 和 HBTU作为偶联剂，哌啶脱保护，在 Zinsser Analytic Peptide Synthesier 型多肽各线性肽（表 2-1）。树脂量为 0.05 mmol，氨基酸量为树脂的 5 倍。2.3.1.2 多肽的裂解后的肽-树脂于裂解液（8.8ml TFA/0.5g DTT/0.5ml H2O/0.2ml三异丙基硅烷）中室温搅拌约 3h，脱除树脂和氨基酸侧链保护基。过滤分离树脂和线性肽，滤液在旋转蒸发蒸去大部分 TFA，加入预冷乙醚，室温沉淀

37、1h 后，抽滤收集沉淀并用乙醚洗涤 3-4 次，最后将多肽沉淀重新溶解，冻干，-20保存。2.3.1.3 毒素的折叠及富集Mr6 与 Eb5 为 M毒素，含三对二硫键，Bt 系列芋螺多肽为 4 个单 C 的 A 超芋螺多肽，根据其不同框架选用合适的反应体系使其形成天然活性构象。Bt 系列的折叠条件为：0.10.2 mg/ml 浓度线性肽置于 0.1 mol/L 的醋酸铵缓冲液（pH 8.38.5）中折叠，折叠过程用 HPLC 监测，2448h 即可完成折叠。Mr6 与 Eb5 的折叠条件为：将 0.050.1 mg/ml 浓度的线性肽一步氧化折叠于 0.10.15 mol/L 的醋酸铵缓冲液（

38、pH 8.58.7）中，观察溶解情况，若溶解较差，需置于 4 度进行折叠。折叠过程用HPLC 监测，膜过滤，再用2448h 即可完成折叠折叠完成后用冰醋酸调 pH3-5 后，0.45µm 滤C18 HPLC 富集。富集过程如下：先用 90%乙腈（含 0.1%TFA，4ml/min）冲洗 C18 柱，冲洗 100ml 体积后用 H2O（含 0.1%TFA）平衡吸附柱约 120ml，然后以2-3 ml/min 的速度缓慢上样，再用 H2O（含 0.1%TFA，2.5 ml/min）洗脱无机盐及小分6大学子物质，最后用 95%乙腈（含 0.1%TFA，5 ml/min）洗脱目标肽，收集目标

39、峰冻干待用。2.3.1.4 多肽的纯化冻干收集多肽固体利用 HPLC进行纯化（C18 分析柱，5 mm；流速 3 ml/min；每次量 2 mg 以下），含 0.1%TFA-水（A）和 0.1%TFA-乙腈（B）为相，检测波长范围 214 nm250nm，根据富集后冻干多肽 HPLC 分析情况设置纯化梯度及检测波长，收集主峰，旋转蒸发仪除去大部分乙腈后冻干，-20保存待用。2.3.2 (GI)8-八分肽2.3.2.1 含保护基的 GI-COOH 的浸泡树脂：1g 2-Cl-CTC-Resin 在 NMP 中浸泡至少胀；，使树脂得到充分溶偶合反应：称取 1.4688g Fmoc-Cys（Trt）

40、，即多肽的第一个带侧链保护基团的氨基酸，与 1g 2-Cl-CTC-Resin（7ml NMP/0.5ml DIEA) 偶合 2h；洗涤：依次使用 NMP、DMF、DCM、DMF、DMF、DMF 依次洗涤；封闭：加入 4ml 无水甲醇/0.5mlDIEA 封闭，再按顺序洗涤，得到 Fmoc-Cys（Trt）-CTC 树脂，空气干燥后称量，计算出树脂的取代率（0.62 mmol/g）。然后根据多肽序列，利用 Fmoc-Cys(Trt)-CTC 树脂带保护剂的 GI-树脂，用含 1%的 TFA 的二氯甲烷进行裂解肽树脂，获得带保护基的 Fmoc-GI-COOH(0.353 g)。2.3.2.2 (

41、GI)8-八分肽Fmoc-Lys（Fmoc）4-Lys（0.25 mmol）用 20%哌啶/NMP 溶液（14ml）分别脱保护 5 分钟和 30 分钟，然后依次用 DMF、DCM、MeOH、DCM（3 次）、NMP（3 次）洗涤。抽干后，加入 HOBt（0.1mmol,）/DIC（0.1 mmol），NMP 溶液(16.7 ml)，震荡4.5 小时，茚三酮检测呈，抽干树脂。再用 DMF、MeOH、DCM、DMF、DMF 洗涤（20 ml）。然后哌啶脱保护，干燥后脱保护（8.8 ml TFA/0.5g DTT/0.5ml H2O/0.2ml 三异丙基硅烷），获(GI)8-八分肽 180.5 mg

42、。7大学2.3.3 线性 GI 手工大量3.3 g Rink 树脂（2 mmol）在30ml 20%的哌啶/NMP 溶液中脱保护10 min和20 min，摇床震荡速度180-200 r/min，茚三酮检测，抽干树脂，依次用40 ml DMF、MeOH、DCM、DMF、DMF洗涤，每次5 min。同时将4.7 g Fmoc-Cys-OH（6 mmol）溶于1015ml NMP，震荡混匀，加入 HOBT（1.13g，8.62 mmol)、DIC（2.61 ml，16.8 mmol），如不溶解适量添加DMF，活化约1小时。将活化 Fmoc-氨基酸溶液加入洗涤树脂中，偶合3-4 h，茚三酮检测反应是

43、否完全。反应完全后抽干树脂，依次用40ml DMF、MeOH、DCM、DMF、DMF 洗涤，每次 5 min。重复上述步骤，依次连接其余氨基酸，GI-树脂（7.13g）。肽-树脂置于裂解液（30 ml TFA/2 g DTT/2 ml H2O/0.8 ml 三异丙基硅烷）中，室温搅拌约34 h，过滤，滤液在旋转蒸发蒸去大部分TFA，加入预冷乙醚，室温沉淀 1 h 后，抽滤，乙醚洗涤 34 次，得GI线性粗肽3.3 g。另取少量样品用2%乙酸溶解，HPLC分析。2.3.4 双电极电压钳测定多肽活性2.3.4.1 重组质粒的（参考世纪公司的质粒提取说明书）将质粒转化入 D H5 细胞中，挑取单克隆

44、菌落，加入 5 ml LB 液体培养基（内含 Amp），220 rpm，37培养 812 小时，13000 rpm 离心 1 min，收集菌体沉淀。向沉淀中加入 500 l buffer P1，重悬沉淀。加入 500 l buffer P2min。悬液中，温和的上下颠倒混匀 34 次，室温静置 36向混合液中加入 500 l buffer E3，立即上下颠倒混匀 34 次，室温静置 5 min后 13000 rpm 离心 10 min.上清转移至去内毒素过滤柱中，注意不要吸取到下方沉淀，13000 rpm 离心 12 min。向滤液中加入 450 l 异丙醇，上下颠倒混匀 34 次后转移至平衡

45、后的吸附柱中13000 rpm 离心 1 min，倒掉废液。向吸附柱中加入 600 ml buffer PW，13000 rpm 离心 1 min，倒掉废液，然后再次离心 2 min，室温静置干燥 510 min。8大学吸附柱置于离心管中，加入 50100 l ddH2O（可先 50预热，提高产率），室温放置 25 min，13000 rpm 离心 1 min。重复该步骤。2.3.4.2 目的基因的体外转录（1）重组质粒酶切线性化反应体系：pNKS2-2/ 3/ 4/2/ 4 XbaI 酶10´M buffer100 l10 l15 l补 ddH2O 至37，4 h150 lpGEM

46、HE-9/ pSGEM-10NheI 酶10´M buffer100 l10 l15 l补 ddH2O 至37，4 h150 lEX-1/ BssHII 酶10´M buffer100 l10 l15 l补 ddH2O 至37，4 h150 lEX-1/ StuI 酶10´M buffer100 l10 l15 l补 ddH2O 至37，4 h200 l9大学（2）线性质粒的去 RNA 酶及纯化加 RNA 酶抑制剂反应体系：线性化后重组质粒10´蛋白酶 K buffer 5% SDS20 mg/ml 蛋白酶 K100 l20 l20 l1 l补 ddH2

47、O 至23，1-1.5 h200 l按上述体系加入等体积的 Tris 平衡酚（酚:氯仿:异戊醇=25:24:1），振荡 1 min， 4，13000 rpm 离心 24 min。吸取上层水相，注意不要吸到下方沉淀，加入等体积氯仿，4，13000 rpm离心 24 min。同样吸取上层清液，加入 0.1 倍体积 3 M 醋酸钠和 2.5 倍体积无水乙醇，上下颠倒混匀，-20静置 23 小时后 4，13000 rpm 离心 30 min。移除上清，留下沉淀，加入 1 ml 70%乙醇，4，13000 rpm 离心 3 min，重复此步。室温开盖静置晾干 5 15 min，加入适当无核酶水溶解沉淀，

48、DNA 放于-20保存。（3）线性质粒的体外转录9、10、1、1、 质粒为 T7 启动子，其他质粒为 SP6 启动子。解冻试剂， 按顺序依次加入到反应体系中（参考体外转录试剂盒 mMessage mMachine Transcription kits（Ambion Corporation, Austin, TX）说明书）：2´NTP/CAPEnzyme Mix 10´Reaction Buffer模板 DNA10 l2 l2 l1 g20 l补无核酶水至37，2 h10大学反应体系中加入 1 l TURBO DNase，充分混匀，37 温浴 15 min（时间不能过长）。加

49、入 30 l LiCl，充分混匀，-20沉淀 30 min 后 13000 rpm 离心 15 min。移走上清，加 1 ml 70%乙醇混匀，13000 rpm 离心 24 min。移走 70%乙醇，室温静置干燥 510 min，加 1020 l 无核酶水溶解沉淀。留取 1l 样品用于测定其浓度及跑琼脂糖电泳鉴定2.3.4.3 细胞培养液的配制主要试剂的配制(1) ND96 缓冲液（5 ×）NaCl KCl CaCl2MgCl26H2OHEPES28.0512g0.7455g0.999g1.0165g5.9575g加 ddH2O 溶解后，调节 PH 至 7.4 左右，使用容量瓶定1

50、000 ml，稀释 4倍，稀释液体仍需使用容量瓶定容，然后分装入 500 ml 盐水瓶中121 ，30 min 灭菌，冷却后，密封，常温保存备用(2) OR-2 缓冲液（5 ×）NaCl KClMgCl26H2OHEPES23.9604g0.931875g1.0165g5.9575g加 ddH2O 溶解后，调 PH 至中性，再定1000 ml，稀释 4 倍，分入 500 ml盐水瓶中，121，30 min 灭菌，待其冷却后，密封，常温保存备用，定期检查 OR-2 缓冲液 PH 变化(3) 75%无水乙醇500.00 ml11大学ddH2O167.00 ml混合后密封室温保存(4) 细

51、胞培养液配置ND96（1×）酸钠500 ml1.375625g105U/L青霉素链霉素500mg/L分装入 100 ml 无菌细胞瓶，密封常温储备液保存2.3.4.4 注射针和注射针及电极的拉制电极的拉制均使用进口 1B150F-4 型号的毛细管，两者的微电极拉制仪的拉制条件：1) 注射针程序：HEAT=810，PULL=20，VeL=80，Time=200；2) 电极针程序：HEAT=810，PULL=0，HEAT=785，PULL=0， HEAT=740，PULL=0， HEAT=805，PULL=0，VeL=25，Time=200； VeL=25，Time=200； VeL=23，Time=200；VeL=25，Time=200；注射针为尽可能减小对细胞的，又不至于由于针尖太小而浪费 RNA，议在高倍镜下 56 小格。建2.3.4