载体的功能和应具备的特点

1、 载体的功能 1.运送外源基因高效转入受体细胞 2.为外源基因提供复制能力或整合能力 3.为外源基因的扩增或表达提供条件 载体应具备的条件 1.具有对受体细胞的可转移性2.具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点3.长度尽可能小，以提高其载装能力4.具有多种单一的酶切位点5.具有合适的选择性标记 H1 design of plasmid vectors H2 bacteriophage vectors H3 cosmids and YACs and BACs H4 eukaryotic vectors Characteristics of plasmid vectors Alteratio

2、n of plasmid vectors Type of plasmid vectors Development of plasmid vector research Familiar plasmid vector Independent from nuclear genome Autonomously replicating nucleic acids sequence Genetic stability Eukaryotic bacterial and epiphyte Most of plasmids consist of DNA. Most of plasmids are cccDNA

3、 (covalent, closed, circle) Mw range ：1 - 300 kb 质粒的不相容性 质粒的可转移性 携带特殊的遗传标记 质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统进行自主复制 质粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系 根据在每个细胞中的分子数（拷贝数）多寡，质粒可分为两大复制类型： 严紧型复制控制的质粒 stringent plasmid 1 - 3 拷贝 松弛型复制控制的质粒 stringent plasmid 10 - 60 拷贝 任何两种含有相似复制子结构的不同质粒，不能同时存在于一个细胞中，这种现象称为质粒的不相容性，不相容性的质粒组成不相容性群 以大肠

4、杆菌的质粒为例： ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，不相容 pSC101、F、RP4 拥有相似的复制子结构，不相容 p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，不相容 质粒不相容性的分子机制 两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质各受自己的拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期粒的最终拷贝数恒定，因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内。和细胞分裂周期后仍能共处于同一细胞内。 两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时两种含有相似复制子结构的不同

5、质粒，在复制时受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质受到同一种拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以粒的最终拷贝数不同，其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。后的细胞分裂周期中更具优势。 革兰氏阴性菌的质粒可分成两大类： 接合型质粒 能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞（接合作用），如F、Col、R质粒等 非接合型质粒 不能在天然条件下独立地发生接合作用，如Col、R的其它成员 值得注意的是，某些非接合型质粒（ColE1）在接合型质粒的存在和协助下，也能发生DNA转移，这个过程由 bom 和mob 基因决定 野生型的质粒DNA上往往

6、携带一个或多个遗传标记基因，这使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括： 物质抗性：抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物 物质合成：抗生素、细菌毒素、有机碱 这些标记基因对DNA重组分子的筛选具有重要意义 天然存在的野生型质粒由于分子量大、拷贝数低、单一酶切位点少、遗传标记不理想等缺陷，不能满足克隆载体的要求，因此往往需要以多种野生型质粒为基础进行人工构建。 目前实验室使用的大肠杆菌质粒大多是由少数几个野生型质粒构建的： pSC101：8.8 kb，拷贝数5，四环素抗性标记基因 Tcr ColE1：6.5 kb，拷贝数20 30，大肠杆菌内毒素标记基因 E1 RSF2124：ColE1

7、衍生质粒，氨苄青霉素抗性标记基因 Apr 人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类：人工构建的质粒根据其功能和用途可分成如下几类： 高拷贝质粒高拷贝质粒:突变拷贝数控制基因，拷贝数突变拷贝数控制基因，拷贝数1000-3000，扩，扩增基因增基因 低拷贝质粒低拷贝质粒:来自来自pSC101,拷贝数小于拷贝数小于10,表达某些毒性基因表达某些毒性基因 温敏质粒温敏质粒:在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质在不同温度下表现出拷贝数、整合等不同性质 测序质粒测序质粒:含有测序通用引物互补序列和多酶接头含有测序通用引物互补序列和多酶接头polylinker 整合质粒整合质粒:装有整合促进基因及位

8、点装有整合促进基因及位点,便于外源基因的整合便于外源基因的整合 穿梭质粒穿梭质粒:装有针对两种不同受体的复制子装有针对两种不同受体的复制子,便于基因克隆便于基因克隆 表达质粒表达质粒:装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化的元件件 探针质粒探针质粒:装有报告基因装有报告基因,便于启动子等元件的克隆筛选便于启动子等元件的克隆筛选 第一阶段（1977年前）：天然质粒和重组质粒的利用，如pSC101, colE1, pCR, pBR313和pBR322。 第二阶段：增大载体容量（降低载体长度），建立多克隆位点区和新的遗传标记基因。如pUC系列载体。 第三阶段

9、：完善载体功能以满足基因工程克隆中的不同要求，如M13mp系列载体，含T3，T7，sp6启动子载体，表达型载体及各种探针型载体。 pBR322 Blue-white screening pUC pUC18 / 19 pKO pGEM-3Z pBR322 has a circle dsDNA of 4.36kb, and the compositive base sequences have been found out. pBR322 has more than 100 restriction site , and scores of single restriction site for e

10、ach restriction enzyme. It and its derivatives contain two antibiotic resistance genes, ampr and tetA. If a target DNA fragment is ligated into the coding region of one of the resistance genes, say tetA, the gene will become insertionally inactivated, and the presence or otherwise of a recombinant p

11、roduct can be determined by the antibiotic resistance exhibited by the transformants.pBR3224363 bpOrigin of ReplicationROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IApr重组DNAAmprTcs提取DNA 电泳AmprAmprAmprAmprTcrTcrTcAmprTcsTcs转化 无菌落阳性菌落筛选重组子2)DNA重组无DNA插入有DNA插入外源DNA1)限制酶切 Inclusion of

12、 tetracycline in the original selection plate will kill off the recombinant colonies in which we are interested. The colonies grown on a normal ampicillin plate are transferred, using an abosorbent pad, to a second plate containing tetracycline. Colonies which grown on this plate probably contain ve

13、ctor plasmids whereas those which do not are likely to be recombinants. The latter may be picked from the ampicillin plate for further analysis. A more sophisticated procedure for screening for the presence of recombinant plasmids. Only on a single transformation plate This method also involves the

14、insertional inactivation of a gene and uses the production of a blue compound as an indicator. The gene in this case is lacZ, which encodes the enzyme galactosidase, and is under the control of the lac promoter. If the host E.coli strain is expressing the lac repressor, then expression of a lacZ gen

15、e on the vector may be induced using IPTG, and the expressed enzyme can utilize the synthetic substrate X-gal to yield a blue product. Insetional inactivation of lacZ in the production of a recombinant plasmid would prevent the development of the blue color. The transformed cells are spread on to a

16、plate containing ampicillin, IPTG and X-gal, to yield a mixture of blue and white colonies. The white colonies have no expressed -galactosidase and are hence likely to contain the inserted target fragment. The blue colonies probably contain religated vector.pUC质粒 pUC质粒系列也是在pBR322基础上改建成的。 pUC的结构： 它含有

17、pBR322的大部分，包括完整的ampr基因和复制起始点。去除了pBR322的tetr区段，换用了M13噬菌体的476bp片段，含LacZ 基因及其启动子的操纵基因、M13的多聚接头polylinker. 三大优点EcoSacKpnSma BamXbaSalPstSphHinRI I I I HI I I I I dIIIpUC18pUC19HinSphPst SalXba BamSma KpnSacEcodIII I I I I HI I I I RIApOriLacZ(2.68kb)r476bp片段含有E.coli的lacZ基因的 5-序列，表达半乳糖苷酶的片段。 LacZ的上游包括乳糖操

18、纵子上的启动子Plac和操纵基因O。 lacZ之内是M13的多功能连接器。 分子量更小，仅为2.7KB，容纳外源DNA量增大；具有更高的拷贝数（每个细胞含500-700个拷贝）。 含易于检测是否有外源DNA插入的标记基因LacZ，可利用-互补原理进行蓝白筛选。 多克隆位点区（the multiple cloning site, MCS）由人工合成的多个单一酶切位点构成。 其MCS区与M13mp噬菌体载体的相同，可使pUC上克隆的目的基因直接转移到M13mp载体，进行DNA测序和体外突变等研究。 重要的大肠杆菌质粒载体重要的大肠杆菌质粒载体 拷贝数拷贝数 2000 - 3000 / cell 装

19、有多克隆位点（装有多克隆位点（MCS） 正选择颜色标记正选择颜色标记 lacZ 用于基因克隆和测序用于基因克隆和测序 BamHIpUC182686 bpAprlacZoriGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT396452EcoRISstIKpnISmaIXbaISalIPstISphIHindIII正选择标记正选择标记 lacZ 的显色原理的显色原理 组成：以半乳糖激酶（Galk）基因取代pBR322的EcoRI-PvuII位点包括terr。 表达产物催化 Gal + ATP Gal-1-P+ADP 以14C标记的半

20、乳糖作底物,检测生成的*Gal-1-P的放射性。 在Galk基因上游插入目的基因，根据基因表达产物半乳糖激酶活性，即14C-Gal-l-P的放射性，可定量估算启动子功能的强弱。 如在Galk基因前插入目的基因，与无插入的空载pKO比较，并无放射活性的增强，则说明插入片段不存在有启动子。 重要的大肠杆菌质粒载体 多拷贝 装有多克隆位点（MCS） 正选择颜色标记 lacZ 装有两个噬菌体的强启动子用于外源基因的高效表达 注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如E.coli BL21（DE3）等 aCl2转化效率低 克隆片

21、段小于10kb 大量筛选时需要细胞裂解 Characteristics of bacteriophage Bacteriophage M13 Virus 噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。 噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工程的有用载体，因为： 高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞 自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增 Bacteriophage , which infects E.coli cells, can be used as

22、 a cloning vector. The process of infection by phage Structure of phage -DNA载体的构建载体的构建 -DNA载体的主要类型载体的主要类型 -DNA重组分子的体外包装重组分子的体外包装 -DNA及其重组分子的分离纯化及其重组分子的分离纯化 -DNA作为载体的优点作为载体的优点 大肠杆菌的温和型噬菌体 由外壳包装蛋白和-DNA组成 线性dsDNA病毒，具有末端互补的12nt（cos），感染细菌后粘端互补成双链环状 全长48502个核苷酸 -DNA上至少有50多个基因 结构区：A J共19个基因，长约20kb，其中的基因编码构

23、成头部、尾部、尾丝对组装完整噬菌体所需要的蛋白质 重组区 ：att、int及xis，长约20kb，是DNA整合和切出，溶原生长所需的序列 调控区:长约10kb，包括启动子、终止子和N、CI基因。控制溶菌和溶原生长最重要的调控基因和序列、以及DNA复制均在该区域内 O-R 为裂解区 缩短长度缩短长度 删除并和增加酶切位点删除并和增加酶切位点 加装选择标记加装选择标记 构建琥珀密码子的突变体构建琥珀密码子的突变体 野生型-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能被包装成有感染力的噬菌体颗粒。因此缩短野生型-DNA的长度，可以提高装载量。

24、 野生型-DNA上约有40-50%的片段是复制和裂解所非必需的。根据切除片段长度的不同，可将-DNA分成两大类载体： 插入型载体 取代型载体 允许外源 DNA 片段替换非必须 DNA 片段的载体，称为置换型载体（replacement vectors）。 一般情况下，置换型载体克隆外源片段的大小范围是 9-23kb ，故而该载体主要用来构建基因组文库。 删除重复的酶切位点删除重复的酶切位点 野生型的-DNA链上有5个 EcoRI 位点和7个HindIII位点，不利于重组操作，必须删除至1 - 2个。 增加新的单一酶切位点增加新的单一酶切位点 为了便于各种来源的DNA片段的克隆，还需要增加一些单

25、一的酶切位点。除了简单的切割外，还需要采用定点突变技术去除或增添酶位点。 与质粒不同，野生型-DNA上缺少合适的选择标记，因此加装选择标记是-DNA克隆载体构建的重要内容 加装于-DNA克隆载体上的选择标记主要有下列两类： 免疫功能类标记 Imm434 颜色反应类标记 lacZ imm434基因编码一种阻止-噬菌体进入溶菌循环的阻遏物。 含有完整标记基因的-载体进入受体细胞后，建立溶原状态，细菌生长缓慢，形成浑浊斑； 当外源DNA插入到标记基因中，基因灭活， -重组分子便进入溶菌循环，形成透明斑。 lacZ基因编码-半乳糖苷酶，能催化无色的X-gal生成蓝色化合物。 当外源基因插入到lacZ基

26、因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物； 而空载体-DNA则产生蓝色透明斑 琥珀型突变（sup)是指由CAG（Gln）向UAG （stop）的突变。大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编码产物校正tRNA能专一性地纠正这一突变。 将野生型-DNA上D和E两个头部包装蛋白的基因中的CAG密码子突变成UAG。当这种-DNA进入一般的大肠杆菌菌株后，不能合成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细菌，这样就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散，而基因工程实验中使用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株。 插入灭活型载体 ：Charon2、Charon6、gt11 取代型载体：EMBL4、gtlc、

27、NM762、Charon40 正选择型载体：EMBL1、L47、1059 野生型的-噬菌体不能在P2噬菌体溶源性的细菌中繁殖（Spi+），这种生长抑制表型受-DNA上的red 和 gam 两个基因控制。若将外源DNA取代 red 和 gam ，重组噬菌体便拥有Spi-表型，能在P2噬菌体溶源性的大肠杆菌受体菌中繁殖，并形成透明斑。 -DNA重组分子需在体外人工包装成有感染力的噬菌体重组颗粒，方可高效导入受体细胞。 用于体外包装的蛋白质必须具备以下成分：A蛋白（有终止复制功能），E蛋白（包装蛋白），D蛋白（插入蛋白）。 可直接从感染了-噬菌体的大肠杆菌中提取这些蛋白，现已实现商品化。这些包装蛋白

28、通常分为相互互补的两部分：一部分缺少E组份，另一部分则缺少D组份。当且仅当这两部分包装蛋白与重组-DNA分子混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装液被重组-DNA污染后，均不能被包装成有感染力的噬菌体颗粒，这也是基于安全而设计的。 将大肠杆菌在含有麦芽糖的培养基中培养至对数生长期 加入噬菌体或重组l噬菌体的悬浮液，37培养1小时 用新鲜培养基稀释，继续培养4 -12小时。这时噬菌体颗粒密度已达1013 -1014 / L，大肠杆菌细胞已完全裂解 超速离心，沉淀噬菌体 苯酚抽提，释放-DNA 乙醇或异丙醇沉淀-DNA 在体外包装成噬菌体颗粒，能高效转染大肠杆菌 装载能力为25 kb，远远大于

29、质粒的装载量 重组-DNA分子的筛选较为方便 重组-DNA分子的提取较为简便 -DNA载体适合克隆和扩增外源DNA片段，但不适合表达外源基因。因而-DNA可通过人工加入序列的方法构建pET载体。 表达载体 pET-5a 是典型的 pET 载体，其组成是在载体的基本结构的基础上加入了 T7 噬菌体启动子序列及其下游的几个酶切位点。当外源基因插入到这些酶切位点后，就可在特定的宿主细胞中诱导表达。 M13噬菌体的生物学结构 M13 噬菌体的基因组 M13 噬菌体结构模型 M13 噬菌体的感染周期 M13 噬菌体的复制过程 M13 噬菌体的构建 M13 DNA载体的特点 M13噬菌体的外型呈丝状 M1

30、3 噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成 M13 噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长 M13 DNA全长6407个核苷酸 M13 DNA上至少有10个基因2700个蛋白外壳分子 ssDNA ，6407 个核苷酸组成 （GenBank 注册号为 V00604） 。基因组 90% 以上的序列可编码蛋白质，共有 11 个编码基因，基因之间的间隔区多为几个核苷酸。较大的间隔位于基因 和基因 以及基因 和基因 之间，其间有调节基因表达和 DNA 合成的元件。 其基因组可编码 3 类蛋白质，包括复制蛋白（基因 ， 和 ），形态发生蛋白（基因， 和 ），结构蛋白（基因 、 和 ）。基因组 DNA 为正链，按

31、基因 至基因 方向合成，与噬菌体的 mRNA 序列同义。 M13 噬菌体颗粒为丝状长管状结构，长 880nm ，直径 6-7nm 。噬菌体颗粒的核心由 2700 个基因 编码的结构蛋白呈管状排列而成，成熟的基因 的产物为由 50 个氨基酸残基组成的 螺旋蛋白。顶端由 5 个基因 和 5 个基因 产物组成，作用于间隔区中的包装信号。 5 个基因 蛋白和 5 个基因 蛋白位于丝杆的末端，参与对性纤毛的吸咐。 在宿主细胞内，感染性的单链噬菌体 DNA （正链）在宿主酶的作用下转变成环状双链 DNA ，用于 DNA 的复制，因此这种双链 DNA 称为复制型 DNA （replicative form

32、DNA） ，即 RFDNA 。通过 复制方式， RFDNA 进行扩增，基因的转录也随即开始。 基因组中的任意一个启动子都可以启动基因的转录，单方向地终止于下游的终止子。启动子和终止子的位置关系使得靠近终止子的基因转录更频繁。 +DNA+DNARFDNARFDNARFDNAII 单链 DNA 的酶切和连接是比较困难的，因此 M13 噬菌体在用作载体时是利用其双链状态的 RF DNA。RF DNA 很容易从感染细胞中纯化出来，可以象质粒一样进行操作，并可通过转化方法再次导入细胞。 使克隆的DNA片段以特定单链的形式输出受体细胞外，这在DNA定向突变中非常有用。 M13重组分子筛选简便。 被M13噬

33、菌体感染的受体细胞生长缓慢，形成混浊斑，易于辨认挑选。而且重组分子越大，混浊斑的混浊度亦越大。 M13-DNA载体的最大缺陷是装载量小，只有1.5kb。 与动植物受体细胞相适应的载体一般选择相应动植物的病毒基因组DNA。 动植物病毒种类繁多，每一种动植物都有多种特异性病毒。按照基因组的结构，可将动植物病毒分成四大类： ssDNA, dsDNA, ssRNA, dsRNA RNA病毒在自我复制时大多存在相应的DNA中间反应物，这些中间体可作为载体进行常规的DNA重组。 The way to form cosmids Cosmid Phagemid Artificial Chromosomes -

34、噬菌体载体和M13-噬菌体载体的装载量最大分别为25 kb和1.5kb，装载量无法满足现代基因工程的需要。 在包装上限固定的条件下，大幅度缩短噬菌体DNA的长度，就能同步增加载体的装载能力。将噬菌体DNA与包装有关的序列与质粒组装在一起，既能最大限度地缩短载体的长度，又能保证重组DNA分子在体外仍被包装成有感染力的颗粒。 由于cos质粒和噬菌粒不再携带包装蛋白基因，因此重组DNA分子在细胞内不能形成噬菌体颗粒。 一类人工构建的含有-DNA cos序列和质粒复制子的特殊类型的载体。 1978年Collins和Hohn发明构建 1.8 kb的-DNA片段 + pBR322片段 粘粒的组成包括质粒复

35、制起点（colE1），抗性标记（ampr）， cos 位点，因而能象质粒一样转化和增殖。它的大小一般 5-7kb 左右，用来克隆大片段 DNA ，装载范围为31 - 45 kb。有的粘粒载体含有两个 cos 位点，在某种程度上可提高使用效率。 同-噬菌体，可进行体外包装，高效转染受体细胞 像质粒那样在受体细胞中自主复制 重组操作简便，筛选容易 装载量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范围 不能体内包装，不裂解受体细胞 噬菌粒是一类人工构建的含有单链噬菌体包装序列、复制子以及质粒复制子、克隆位点、标记基因的特殊类型的载体。 噬菌粒的特点 能像M13一样体外包装，并高效转染受体细胞 能像质粒

36、那样在受体细胞中自主复制 装载量比常规的M13mp系列要大很多（10 kb） 通过克隆双链DNA能获得同等长度的单一单链DNA 重组操作简便，筛选容易 pUC118 / 119， pBluescript体外转录载体 pBluescript = pUC + f1-ori + PT3 + PT7 具有多克隆位点、 -互补、噬菌体启动子和单链噬菌体的复制与包装信号 噬菌体启动子PT3和PT7 强化外源基因的转录 提取出来的单链DNA重 组分子在噬菌体RNA聚 合酶的存在下，又可实 现外源基因的体外转录 pBluescriptKS（） 一般由 4 个质粒组成一套系统，其差别在于多克隆位点方向相反（根据

37、多克隆位点两端 Kpn 和 Sac 的顺序，用 KS 或 SK 表示），或单链噬菌体的复制启始方向相反（或者说，引导 DNA 双链中不同链合成单链 DNA ，用 + 或 - 表示）。 pBluescriptKS（） 的多克隆位点与 pUC18/19 的不同，且使用 f1 噬菌体的复制与包装信号序列 。 人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百甚至上千 kb 的DNA片段 将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体，它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。 细

38、菌人造染色体（BAC） 酵母人造染色体（YAC） 细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上构建的，装载范围50 - 300 kb之间。 各种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝。 BAC 载体的低拷贝性可以避免嵌合体的产生，减小外源基因的表达产物对宿主细胞的毒副作用。 pBAC的基因结构 pBACs主要适用于： 克隆大型基因簇（gene cluster）结构 构建动植物基因文库 大肠杆菌的 F 因子是一个约 100kb 的质粒。它编码60多种参与复制、分配和接合过程的蛋白质。 虽然F因子通常以双链闭环DNA（1-2个拷贝/细胞）的形式存在，但它可以在大肠杆菌染色体中至少3

39、0个位点处进行随机整合。 携带F因子的细胞，或以游离状态或以整合状态表达三根发样状的F菌毛。F菌毛为供体与受体细胞之间产生性接触所必需。 每个环状 DNA 分子中携带： 一个抗生素抗性标记 一个来源于大肠杆菌 F 因子（致育因子）的严谨型控制的复制子 oriS 。 一个易于 DNA 复制的由 ATP 驱动的解旋酶RepE 以及三个确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座 （ parA , parB , 和 parC ）。 Transfection of eukaryotic cells Shuttle vectors Yeast episomal plasmids Agrobacterium

40、tumefaciens Ti plasmid Virus Yeast Artificial Chromosomes DNA transfection into eukaryotic cells can be more problematic than bacterial transformation, and the efficiency to of the process is much lower. Yeast and plant cells: protoplasts Animal cells: calcium phosphate Electroporation Microinjectio

41、n Gene gun 利用脉冲电场改变细胞膜的状态和通透性，达到将DNA导入细胞以及促使细胞发生融合的目的。 该技术目前一方面应用于细菌、真菌、植物、昆虫和哺乳动物细胞的基因转移，另一方面应用于细胞融合制备杂交细胞和动物克隆等。 将核酸直接发送至细胞内的物理学方法。 PDS-1000/H台式基因枪可以实现对细胞的原位转导。 应用于包括培养细胞、组织、器官、植物、动物、细菌和细胞器官等各种不同的目标。 能够在两类不同宿主中复制、增殖和选择的载体。 如有些载体既能在原核细胞中复制又能在真核细胞中复制，或能在 E.coli 中复制又能在革兰氏阳性细菌中复制。 这类载体主要是质粒载体。 以2质粒为基础

42、的载体 YEps可以含有完整的2质粒，也可以只含有2质粒的复制起点。 YEp13是一个穿梭质粒，含有2质粒的复制起点和选择基因LEU2, YEp13还包含pBR322的完整序列，因此可以在大肠杆菌也可以在酵母中进行选择。 2质粒是非常好的克隆载体，它有6kb大小，在酵母细胞中的拷贝数在70-200之间，利用质粒的复制起始位点进行复制，许多酶由寄主细胞提供，质粒中含有编码蛋白质的基因REP1, REP2。 2质粒的问题：选择标记的问题。在实践中，利用酵母的正常的基因，一般是编码氨基酸合成的酶，如LEU2基因编码-异丙基苹果酸脱氢酶，参与丙酮酸向亮氨酸的转化。为了利用LEU作为选择标记，需要用到一

43、种特殊的寄主，寄主必须是LEU-2营养缺陷体这样的寄主只有在添加亮氨酸的条件下才能生长。质粒中含有LEU-2合成基因，可以在基本培养基上生长。 几乎所有双子叶植物都容易受到土壤农杆菌感染，而产生根瘤。它是一种革兰氏阴性土壤杆菌（A. tumefaciens）。 其致瘤特性由Ti（tumorinducing）质粒介导的。 农杆根瘤菌之所以会感染植物根部是因为植物根部损伤部位分泌出酚类物质乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮，这些酚类物质可以诱导Vir（Virulence region)基因的启动表达，Vir基因的产物将Ti质粒上的一段TDNA单链切下，而位于根瘤染色体上的操纵子基因产物则与单链TDNA结合

44、，形成复合物，转化植物根部细胞。 Ti质粒基因结构 Ti质粒大约在160240kB之间。其中T-DNA大约在15kb-30kb。Vir基因区在36kb左右。除此之外，Ti质粒上还存在Con区（region encoding conjugation)和Ori区（origin of replication)。 TDNA上有三套基因和左右两个边界。 其中两套基因分别控制合成植物生长素与分裂素，促使植物创伤组织无限制地生长与分裂，形成冠瘿瘤。 第三套基因合成冠瘿碱，冠瘿碱有四种类型：章鱼碱（octopine）、胭脂碱（nopaline）、农杆碱（agropine）、琥珀碱（succinamopine）

45、，使农杆菌生长必需的物质。 LB和RB是长为25bp的末端反复重复顺序，在切除及整合过程具有重要意义。 T-DNA切除由Vir区编码的特异性内切酶完成，分别在LB和RB的第三个碱基和第四个碱基之间产生缺口，并形成单链T-DNA。 T-DNA的LB和RB在整合中的作用是不对称的，RB顺序与整合有关，而LB无关。 T-DNA的整合可以是单拷贝的，也可以是多拷贝的，成串联形式排列，但整合位点的特异性尚未确定。 T-DNA克隆在大肠杆菌质粒上，含有E.coli的选择标记和植物选择标记Kmr。 首先在E.coli中筛选重组分子，然后将重组质粒转化到农杆菌中，质粒与Ti质粒上的同源序列发生同源重组，将外源

46、基因整合到Ti质粒上，用于侵染植物细胞。T-DNA重组分子整合到植物细胞染色体DNA上，Kmr筛选转化细胞。 目前T-DNA转化植物细胞的标准方法是双元系统，即穿梭质粒。插入外源基因的重组穿梭质粒直接转化含有Ti质粒的根瘤农杆菌，经筛选后直接感染植物细胞。与共整合系统所不同的是，含外源基因的质粒可在农杆菌内自主复制并保留下来。农杆菌侵染植物细胞后，植物的创伤信号启动Ti质粒上的Vir基因，随后将穿梭质粒的T-DNA切割下来，转移到植物细胞中。 Baculovirus SV40 Retroviruses 杆状病毒侵染昆虫细胞。 病毒基因组有极强的启动子，可以启动外源基因的过表达，生产大量目的蛋白

47、。 典型的杆状病毒表达系统是利用大肠杆菌中位点特异的转座或昆虫细胞中的同源重组来产生重组杆状病毒。这些过程要求大量的操作时间，周期长达几周。 BaculoDirect 杆状病毒表达系统可简化过程，节省大量时间。 BaculoDirect系统利用快速、简便的Gateway技术。 BaculoDirect线性DNA包含了attR位点，允许与包含有目的基因的Gateway入门克隆进行有效的重组。 将entry克隆、BaculoDirect线性DNA和Gateway LR Clonase酶混合物稍加混匀，在室温下反应1小时即可。最终的反应混和物中包含有携带目的基因的杆状病毒，可以直接用于转染昆虫细胞（

48、sf9或sf21）。 SV40 infects a number of mammalian species. Its utility for transferring large fragments is limited. 反转录病毒是一类RNA的病毒，进入受体细胞后，RNA反转录成DNA，通过两端由数百bp组成的长末端重复序列，整合到染色体上，成为原病毒。 反转录病毒的DNA基因组的两端各有一个长末端重复序列(5-LTR和3-LTR)，有一个包装病毒颗粒时必需的非编码序列+，同时有三个编码蛋白质的基因gag、pol和env。 反转录病毒载体可容纳外源DNA的长度约10 kb，以很高的转染率感

49、染宿主细胞，特别是分裂中的细胞。转入宿主的细胞后，反转录病毒载体随即整合到宿主细胞基因组内，这种整合的位点是随机的。 反转录病毒载体在构建时，删去了poi、env基因和gag基因的3端，但保留了病毒颗粒所需的+序列。其目的是在于提高载体的安全性，防止反转录病毒进入宿主细胞后进行增殖并包装成病毒颗粒对宿主细胞造成可能的伤害。在制备反转录病毒载体时，必须有一个辅助细胞系，这种细胞内有缺陷型病毒可以提供包装用的外壳蛋白，但自身没有包装信号。这样，反转录病毒载体就可利用这些外壳蛋白包装成病毒颗粒在辅助细胞系内大量扩增。 反转录病载体多半用于基因治疗，由于病毒载体在宿主细胞基因组上随机插入，可能会引起不安全的后果，这种载体还在不断改进之中。 是利用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的染色体的复制元件构建的载体，其工作环境也是在酿酒酵母中。 酿酒酵母的形态为扁圆形和卵形，生长的代时为 90 分钟；含 16 条染色体，其大小为 225-1900kb ，总计有14106 bp；具真核 mRNA 的加工活性。 YAC载体的必需元件 YAC载体的装载量为350 - 400 kb 酵母人造染色体的使用 YAC 载体的原理性工作流程YAC载体应含有下列元件 酵母染色体的