第四章植物细胞工程的基本原理和技术基础

1、第二篇第二篇 植物细胞工程植物细胞工程第四章第四章 植物细胞工程的基本原植物细胞工程的基本原理和技术基础理和技术基础一、植物细胞工程的理论基础一、植物细胞工程的理论基础植物细胞的全能性植物细胞的全能性 1 1、定义：构成植物体的任何一个细胞都、定义：构成植物体的任何一个细胞都具有该物种的全部遗传信息，具有该物种的全部遗传信息，具有产生一具有产生一个完整植株的潜在能力个完整植株的潜在能力. .在特定环境下，都在特定环境下，都可进行表达，产生一个独立的完整个体。可进行表达，产生一个独立的完整个体。2 2、细胞的全能性的实现、细胞的全能性的实现PlantTissue/organ Removed Ne

2、w tissue/organMedium外植体外植体 explant New plantlet 细胞分化（differentiation）：导致细胞形成不同结构、引起功能改变或潜在发育方式改变的过程。n细胞分裂 细胞生长 细胞分化 植物组织/器官/个体 细胞分裂 细胞生长 细胞分化 组织/器官/个体1 1）培养条件下的）培养条件下的细胞脱分化细胞脱分化 脱分化（dedifferentiation):培培养条件下使养条件下使已分化已分化的的细胞细胞 回复到回复到原始原始无分无分化化状态或分生细胞状状态或分生细胞状态的过程。态的过程。 愈伤组织（愈伤组织（callus)愈伤组织愈伤组织由外植体组织

3、增生的细胞产生的一团不定型的疏散排列的薄壁细胞。 愈伤组织原是指生物在受伤以后于伤口表面形成的一团薄壁细胞。2）“生理脱离生理脱离”效应效应 植物细胞或组织从完整的有机体上分离下来，脱离母体（离体离体）的影响，在适宜的条件下（培养培养），有利于激发植物细胞全能性的表达。 1902年，Haberlandt 对高等植物的叶肉细胞、髓细胞、腺毛细胞、气孔保卫细胞、表皮细胞等材料进行了离体无菌培养，虽然某些细胞存活了很长时间，但始终没能发生细胞分裂和增殖，大家推测一下他失败的可能原因是什么？培养条件不完培养条件不完善善:培养基营养成分不够、缺少生长激素等取材不当取材不当:植物细胞全能性的差异根据细胞所

4、处的组织不同而不同Why failed?植物细胞全能性的差异植物细胞全能性的差异根据细胞所处的组织不同从强到弱为：根据细胞所处的组织不同从强到弱为：顶端顶端分生组织分生组织 居间居间分生组织分生组织 侧侧生生分生组织分生组织 薄壁组织薄壁组织( (基本组织基本组织) ) 厚角组织厚角组织 输导组织输导组织 厚壁组织。厚壁组织。双子叶植物的脱分化能力较单子叶植物和祼子植物强双子叶植物的脱分化能力较单子叶植物和祼子植物强 细胞分裂 细胞生长 细胞分化 脱分化脱分化再分化再分化组织/器官/个体 细胞再分化（redifferentiation):离体条件下，脱分化后具有分生能力的细胞，再经过细脱分化后

5、具有分生能力的细胞，再经过细胞分化胞分化，重新形成各类组织和器官、形成为新个体的过程。3 3）培养条件下的）培养条件下的细胞再分化细胞再分化组织组织分裂分裂生长分化生长分化分生组织细胞分生组织细胞分裂分裂已分化组织细胞已分化组织细胞脱分化脱分化分裂生长分裂生长再分化再分化器官器官植株植株愈伤组织愈伤组织离体条件下离体条件下活体条件下活体条件下 离体培养条件下，细胞全能性的表达离体培养条件下，细胞全能性的表达是通过细胞是通过细胞脱分化和再分化脱分化和再分化实现的。实现的。2、由、由愈伤组织再生植株的途径愈伤组织再生植株的途径121（1）1（2）胚状体胚状体(embryoid )(embryoid

6、 )的概念的概念 胚状体(体细胞胚, Somatic embyo)：在植物组织培养中起源于非合子细胞起源于非合子细胞，经过胚胎发生和胚胎发育形成的胚状结构。体细胞胚发育再生成植株有两个明显的特点： 一是体细胞胚具有双极性双极性（double polarity）；二是体细胞胚形成后与母体的维管束系统连系 较少，即出现所谓的生理隔离生理隔离（physiological isolation）现象。 二、植物细胞和组织培养的条件二、植物细胞和组织培养的条件 环境条件：光照、温度、湿度。 营养条件：培养基。一、营养条件一、营养条件培养基培养基培养基（Medium）：是为离体培养材料提供的近似于生物体内生

7、存的营养环境，满足其正常生长和维持其完整结构及功能。 无机盐类：大量元素：C、H、O、N、P、K、S、Ca、Mg 微量元素：Mo、Co 、Mn、Cu、Zn、Fe等 有机营养：碳源：蔗糖、葡萄糖、果糖 有机氮源：氨基酸类、酰胺类 活性物质：维生素类、肌醇、有机附加物 生长调节物质： 生长素类：IAA、NAA、IBA等 细胞分裂素类：激动素、玉米素等 其它类：赤霉素、脱落酸、乙烯 固化剂： 琼脂、明胶、卡拉胶等（一）培养基的组成（一）培养基的组成 元素名称元素名称 添加形式添加形式 N KNO3,NH4NO3大量元素大量元素 P KH2PO4 , NaH2PO4KKCl, KNO3 ,(0.5mm

8、ol/L Ca CaCl2 2H2O, Ca(NO3)2 4H20或100mg/l) Mg Mg2SO4 7H2O S Mg2SO4 7H2O, Na2SO4 微量元素微量元素 Fe Fe-EDTA(Na2- EDTA+FeSO4 7H2O ) B H3BO3 Mn MnSO4 7H2O( 0.5mmol/L) Cu CuSO4 Mo Na2MoO4 2H2O Zn ZnSO4 7H2O I KI Co CoCl3Murashige and Skoog stock solutions (MS Medium ) Macro elements Micro elements (0.5mmol/L)

9、(0.5mmol/L) (0.5mmol/L)MgSO4.7H2O 0.37 g/L KI 0.83 mg/LNH4NO3 1.65 g/L H3BO3 6.2 mg/LKNO3 1.9 g/L MnSO4.4H2O 22.3 mg/LCaCl2 0.33 g/L ZnSO4.7H20 8.6 mg/LKH2PO4 0.17 g/L Na2MoO4.2H2O 0.25 mg/L CuSO4.5H2O 0.025 mg/L CoCl2.6H2O 0.025 mg/L Na2.EDTA 37.3 g/L FeSO4.7H2O 27.8 mg/L（一）（一）母液的配制与保存母液的配制与保存 培养基母

10、液培养基母液：在配制培养基前将培养基中常用药品混合或单独配制成比所需浓度高10-100倍的浓缩液。（1）母液的配制与保存母液的配制与保存 配制母液的优点配制母液的优点：1）使用方便； 2）减少多次称量产生的工作量及称量所产生的误差；3）微量元素用量极小，配制成母液可保证称量的精确性。 常将大量元素、微量元素、铁盐、有机物类和激素类分别配制成比培养基浓度高10-100倍的母液，低温保藏。母液的配制母液的配制(以MS为例) 母液配制要求：母液配制要求： 1.母液浓缩倍数：大量元素母液浓缩倍数：大量元素10 ;微量元微量元素素10、铁盐、铁盐100;有机物有机物50100 . 2.选用蒸馏水、重蒸馏

11、水、分析纯或化学选用蒸馏水、重蒸馏水、分析纯或化学纯试剂纯试剂 3.防止沉淀防止沉淀 4.激素母液配制时的溶剂选择激素母液配制时的溶剂选择 混配法配制母液：配制母液时为减少工作量，增加准确度，将几种药品配在同一母液中。 通常大量元素、微量元素、有机物均可采用混配方法配成浓缩一定倍数的母液。collecting the ingredients无机盐L培养基中用量(mg)称取量（g）定容体积KNO3190019分别溶解后混合定容至1000 ml。NH4NO3165016.5MgSO47H2O3703.70KH2PO41701.70CaCl22H2O4404.40大量元素母液（扩大10倍） 注意：为

12、避免发生沉淀，应注意各种化合物的组合以及加入的先后顺序。 母液的浓度可用a ml/L表示，其意义为：配制1升培养基吸取该母液a毫升。Murashige and Skoog (MS） MediumMgSO4.7H2O 0.37 g/L KI 0.83 mg/LNH4NO3 1.65 g/L H3BO3 6.2 mg/LKNO3 1.9 g/L MnSO4.4H2O 22.3 mg/LCaCl2 0.33 g/L ZnSO4.7H20 8.6 mg/LKH2PO4 0.17 g/L Na2MoO4.2H2O 0.25 mg/L CuSO4.5H2O 0.025 mg/L甘氨酸 2mg/L CoCl

13、2.6H2O 0.025 mg/L盐酸硫胺素（VB1）0.5mg/L盐酸吡哆醇（VB6）0.5mg/L Na2.EDTA 37.3 g/L 烟酸 0.5 mg/L FeSO4.7H2O 27.8 mg/L肌醇 100mg/L 铁盐的配法: Fe2+在培养基中不稳定，故要用螯合剂Na2EDTA来配制，配制方法如下： 在装有400 ml蒸馏水的烧杯中加入2粒苛性钠，溶解后加入3.73g Na2 EDTA, 加热使其全部溶解，然后边搅拌，边慢慢加入2.78g FeSO47H2O直至全部溶解,冷却后定容至1000 ml（浓度10 ml/L)，倒入棕色试剂瓶棕色试剂瓶中，置于冰箱中冷藏，保存备用 单配法

14、配制母液：对于激素类等针对不同单配法配制母液：对于激素类等针对不同培养物需要调节用量的物质可配成单一化培养物需要调节用量的物质可配成单一化合物的母液。合物的母液。 这种母液的浓度一般用这种母液的浓度一般用a mg/ml。 其意义为：其意义为：每毫升母液中含有每毫升母液中含有a毫克溶质。毫克溶质。 某种激素母液浓度为某种激素母液浓度为0.25 mg/ml，如果要配，如果要配制该激素为制该激素为0.5 mg/l的的MS培养基培养基1L，则应，则应吸取该激素母液吸取该激素母液 ml。 激素母液的配制: 激素类物质一般都难溶于水,在溶解时要借助其它溶剂使其能溶于水中. 细胞分裂素类：一般先用少量细胞分

15、裂素类：一般先用少量1N盐酸溶解盐酸溶解后后,再加入温水再加入温水冷却后定容冷却后定容 生长素类：一般先用少量生长素类：一般先用少量95%酒精溶解酒精溶解后后,再加入一定量的温水再加入一定量的温水,冷却后定容冷却后定容 。 配制好的各种母液应分别贴上标签，写明母液名称、配制1L培养时的取用量、配制日期等，置于冰箱中冷藏保存。 培养基中的其它成分如琼脂（7g/L)、蔗糖(3%)等无需配成母液，在培养基配制时直接加入。（二）培养基的配制（二）培养基的配制正确的培养基配制顺序（主要步骤）： 在烧杯中加入一定量一定量的水依次加入各类母液加入蔗糖并充分溶解定容调pH值（加琼脂）分装封囗灭菌 fillin

16、g the vesselsautoclaving pHpH值值 组织培养最适pH是多少？如果pH值过高或过低会有什么后果?如何调节？不同植物的最适p值种 类最适pH值种 类最适pH值杜 鹃4.0月 季5.8越 桔4.5胡萝卜6.0蚕 豆5.5石刁柏7.0番茄、葡萄5.7桃 p值适度因材料而异，也因培养基的组成而不同，如以硝态氮和以铵态作氮源。 不同的植物对培养基最适pH值的要求是不同的; 一般来说当pH值高于6.5时，培养基会变硬； 低于5.0时，琼脂不能很好地凝固。铁盐稳定性影响酸碱数，EDTA-Fe能维持pH的稳定性。pH值大小调整可用1.0 M的NaOH和1. 0 M的 HCI来调整,调

17、节时一定要充分搅拌均匀。高温灭菌会降低pH值(约0.20.3个pH值)。培养基培养基pH的调节的调节如何配制如何配制1L的的MS + 30g/L蔗糖蔗糖 + 2mg/L 6-BA + 0.5mg/L NAA + 0.5mg/L 玉玉米素米素 + 8g/L 琼脂培养基琼脂培养基,并并分装在分装在20个个100mL三角烧三角烧瓶中瓶中?Stock solutionMS大量大量 10MS微量微量 100MS有机有机 1006-BA 1mg/mLNAA 0.1mg/mL玉米素玉米素 0.1 mg/mL请你实践：请你实践：录相:植物的组织培养及其应用配制培养基时应配制培养基时应注意的问题注意的问题 1）

18、培养基的各类成分可以配成母液，配制培养基时按比例吸取即可； 2）配制大量元素无机盐的母液时，要防止在混合各种盐时产生沉淀； 3）植物生长物质母液配制时要注意不同激素的溶解性质； 4）药品的称量和定容都要准确； 5）配好的培养基要调pH值。 二、环境条件二、环境条件 植物组织培养在最适宜的温度下生长分化才能表现良好，大多数植物组织培养都是在23-27 之间进行，一般采用25土2。温度温度 组织培养中光照也是重要的条件之一，主要表现在光强、光质、以及光照时间方面： 一般来说，光照强度较强，幼苗生长的粗壮，光照强度较强，幼苗生长的粗壮，而光照强度较弱幼苗容易徒长而光照强度较弱幼苗容易徒长。在培养初期

19、或愈在培养初期或愈伤组织增殖阶段，一般采用黑暗伤组织增殖阶段，一般采用黑暗/弱光条件下培弱光条件下培养养 ，在培养物分化期一般需要，在培养物分化期一般需要 强强/较强光照较强光照 光周期，最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。 光质，对愈伤组织诱导，培养组织的增殖以及器官的分化都有明显的影响。光照光照Light x hormone responses:In vitro rooting of Prunus insititaLight Colour+NAA- NAAWhite100 81Far Red 93 10Red100100Blue 36 71Darkness100 5(From Ross

20、i et al., 1993) 湿度的影响包括培养容器保持和环境的湿度条件，容器内湿度要保持在99%左右，环境的相对湿度一一般要求般要求70-80的相对的相对湿度。湿度。湿度湿度其它因素其它因素渗透压渗透压 培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化合物，因而影响到渗透压的变化。通常1-2个大气压对植物生长有促进作用，2个大气压以上就对植物生长有阻碍作用， 而5-6个大气压植物 生长就会完全停止， 6个大气压以上植物 细胞就不能生存。其它因素其它因素通气状况通气状况 氧气是组织培养中必需的因素，瓶盖封闭时要考虑通气问题，可用附有滤气膜的封口材料。固体培养基可加入活性炭来增加通气度，以利于发根。固体培养

21、基可加入活性炭来增加通气度，以利于发根。液体培养时，可考虑采取振荡培养的方式，以增加通气性。液体培养时，可考虑采取振荡培养的方式，以增加通气性。（三）培养基的筛选（三）培养基的筛选 1、无机盐的筛选：在建立一个新的实验体系时，最好先由一种已被广泛使用的基本培养基(如MS培养基或B5培养基)开始 。 2、有机物的筛选与使用：植物器官或组织培养一般不需添加复杂的有机成分；细胞和原生质体培养则往往需要附加一定量的有机营养才能成功。 3、激素的筛选：根据培养目的，考虑适宜的激素配比模式。（三）常用的培养基筛选方法（三）常用的培养基筛选方法 1、单因子试验：培养基中其他成分都维持在一般水平上，所以只变动

22、一个因子，找出这一因子对试验的影响和影响的程度。 2、多因子试验：对培养基培养基中两个或两个以上因素进行研究，试验可采用完全试验方案，也可选用正交设计方案 。 3、逐步添加和逐步排除的试验方法 4、广谱实验法 Effect of cytokinins on adventitious shoot regeneration from pumpkin ash hypocotyls after 16 weeksResponsive hypocotyl after 4 weeks on MS medium supplemented with 22.2 uM BA and 4.5 uM TDZSteven

23、s ME. et al., Plant Cell Tiss Organ Cul. 2011 august. online三、外植体的选择及消毒三、外植体的选择及消毒（一）外植体的选择（一）外植体的选择 1、取材部位：根据实验目的的不同选择不同的取材部位。 2、器官的发育阶段和生理状态： 发育阶段 :幼嫩组织比老的更具有较好的形态发生能力 生理状态 ：生长开始季节（即将进入旺盛生长期） 3、外植体的大小（P37表）：（二）外植体的消毒（二）外植体的消毒 植物材料带菌特点： 组织块越大，带菌越多 生长旺盛期（夏秋季）带菌多 田间生长比温度生长的带菌多 泥土中生长的比空气中生长的带菌多 选材原则：在

24、满足实验条件的前提下，尽可能选择带菌少的材料，以减少污染的发生。1. 外植体的选择外植体的选择常用外植物体的来源自然环境下自然环境下生长的植物生长的植物无菌环境下无菌环境下生长的植物生长的植物温室环境下温室环境下生长的植物生长的植物1.外植体的选择 来源：健壮、无病虫害、发育正常 大小：视培养目的而定部位（生理状态及发育年龄）取材季节：生长开始的季节。（苹果）脱毒时，最好找出茎原基所带叶原基的数目与生长点（茎尖）大小的相关性，这样在取材时就方便多了茎尖越小，脱毒效果越好，但是成活率茎尖越小，脱毒效果越好，但是成活率越低越低，因为对培养基的要求高，剥离技，因为对培养基的要求高，剥离技术要求高术要

25、求高一般选择12个叶原基的生长点如：茎尖外植体的大小与脱毒效果成反比灭菌的原则灭菌的原则：灭菌剂与外植体应接触足够长的时间以除去外植体表面的微生物，但应尽量减少对外植体细胞的损害。1、常用消毒剂、常用消毒剂2、常用外植体灭菌的具体操作、常用外植体灭菌的具体操作步骤步骤 冲洗植物材料除去泥土等大的颗粒； 切成适宜的大小; 浸入70-75乙醇乙醇，0.5-1min； 用2NaClO溶液（加1滴表面活性剂）表面 消毒5-30min；或HgCl2 (0.1 0.2%) 2-10 min 用无菌水冲洗至少3遍,每次1-2min; 灭菌的材料可用无菌纸吸干。 外植体用自来水冲洗 70%酒精浸1030s 无菌水冲洗2-3次 2-10%的次氯酸钠溶液浸泡10-15分钟 无菌水涮洗3次 Note:此步骤应在超净台上完成外植体无菌处理外植体无菌处理( (以茎段、叶片为例）以茎段、叶片为例）外植体的灭菌外植体的灭菌注意事项消毒时间 在酒精溶液中浸蘸的时间不能过长，一般不超过30秒，否则材料会严重脱水而死亡。在消毒液中消毒的时间随材料的大小、忍耐力、种类和浓度而异，最好要做预备试验