正相柱还是反相柱

1、正相柱反相柱的使用特别注意HPLC使用过后的系统清洗：含有缓冲盐溶液的流动相的清洗方法：1、先用100%勺纯水冲洗，打开排放阀，用 35ml/min的流量，洗二十分 钟左右后停泵。此举主要是针对吸液系统、泵头、进出口单向阀等体积较大的空 间的清洗2、再用95: 5的甲醇/水清洗整个系统，关闭排放阀，用1ml/min的流量, 洗3060分钟后停泵。此举主要是用水清洗整个系统中的盐，用 5%勺甲醇主要 是为了保护色谱柱。3、最后用100%勺甲醇清洗整个系统，用1ml/min的流量，洗2分钟左右, 然后关机。如果流动相中不含盐，则使用上述第三步清洗即可。当固定相的极性大于流动相的极性时，可称为正相分

2、配色谱或简称正相色谱若固定相的极性小于流动相的极性时，可称为反相分配色谱或简称反相色谱在用于正相色谱时，可使用如正己烷的低极性流动相， 在用于反相色谱时，可使用甲 醇或水的强极性流动相正相色谱用的固定相通常为硅胶(Silica )以及其他具 有极性官能团胺基团，如(NH2 APS和氰基团(CN CPS的键合相填料。这 种填料做成的柱子就称为正相柱反向色谱用的填料常是以硅胶为基质，表面键 合有极性相对较弱官能团的键合相，常用的反向填料有：C18(OD$、C8(MOS、 C4 (Butyl )、C6H5( Phenyl )等.这种填料做成的柱子就称为反相柱.正相柱和反相柱缘于，柱上固定相与流动相之

3、间极性的对比。若固定相极性大于 流动相，为正相柱，反之，为反相柱。通常为反相柱应用较多。所有色谱均适用, 包括纸色谱和薄层。现在一般都用反相，正相在样品对水敏感等特殊情况下才使用。 正相的固定性是极性的，流动相是非极性的，适于分离强极性物质。反相的固定性是非极性的，流动相是极性的，适于分离弱极性物质。正相色谱柱与反相色谱柱的区别本质上是填料(固定相)的不同，正相色谱柱填料极性强，洗脱顺序由弱到强；反相 色谱柱填料极性弱，洗脱顺序由强到弱。以下是详细说明：1、 正相色谱 正相色谱用的固定相通常为硅胶 (Silica )以及其他具有极性官能 团胺基团，如(NH2 APS和氰基团(CN CPS的键合

4、相填料。由于硅胶表面的硅羟基(SiOH或其他极性基团极性较强，因此，分离的次序是 依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正已烷(Hexane，氯仿(Chloroform二氯甲烷(Methylene Chloride )等。2、 反向色谱 反向色谱用的填料常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官 能团的键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲醇、 乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被冲洗出，而极 性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。常用的反向填料有：C18 (OD$、C8 (MOS、C

5、4( Butyl )、C6H5( Phe nyl)等。色谱的正反相是根据固定相和流动相的相对极性比较而区分的。一般情况如下： 正相色谱：固定相极性大于流动相极性：常见的色谱柱有：硅胶色谱柱、氨基色 谱柱、苯基色谱柱、氰基色谱柱等。反相色谱：固定相极性小于流动相极性：常见的色谱柱有：C18色谱柱、C8色谱柱等。“生化色谱网”在色谱方面非常专业，建议你去看看。那里对色谱产品都按照“正相、反相”进行了区分。你查一下就知道了。正相色谱用的固定相通常为硅胶，以及其他具有极性官能团，如胺基团和氰基团 的键合相填料。由于硅胶表面的硅羟基或其他团的极性较强， 因此，分离的次序 是依据样品中的各组份的极性大小，

6、即极性强弱的组份最先被冲洗出色谱柱。 正 相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如：正乙烷、氯仿、二氯甲烷等。反相色谱填料常是以硅胶为基础，表面键合有极性相对较弱的官能团的键合相。 反相色色谱所使用的流动相极性较强，通常为水，缓冲液与甲醇，已腈等混合物。 样品流出色谱柱的顺序是极性较强组合最先被冲出，而极性弱的组份会在色谱柱上有更强的保留。常用的反相填料有 C18 C8 C4 C6H5等。反相色谱切换正相色谱流程：1、先将色谱柱用相应的溶剂冲洗干净，然后将色谱柱拆下来密封保存。用双通 将进样器与检测器连接。2、将贮液瓶内装入300ml的二次蒸馏水，将流速渐次提高到 2.0ml/min冲洗系 统

7、1.5h。注意观察泵压。3、将流速渐次降到 0ml/min，把二次蒸馏水更换为甲醇，将流速渐次提高到 2.0ml/min冲洗系统1h。4、 用同样的方法将甲醇更换为异丙醇、四氢呋喃，各冲系统1h05、 最后将四氢呋喃更换为预先配制好的流动相冲系统 1h,同时将柱塞杆清洗系 统内的10%异丙醇更换为流动相，保持50-60滴/min的速度清洗柱塞杆。再将双 通更换为正相色谱柱，待色谱柱平衡好以后就可分析样品了。请问正相色谱柱与反相色谱柱都有什么区别？在使用过程中，各需要注意哪些方面？另外，本人有一根正相的NH2柱,之前由于误用，使用甲醇和水作流动相，至今 里面仍然残留有甲醇和水，但我现在想用乙腈和

8、正己烷作流动相， 请问如何才能 把柱子里面残留的甲醇清洗掉？高效液相色谱法中反相柱的清洁和再生反相色谱是迄今在高效液相色谱中应用最广泛的技术，主要是因为它适用于分析 极大多数的非极性物质和很多的可离子化的及离子化合物。大多数用于反相色谱的固定相都是天然的疏水物质，因此，分析物是按照它们与固定相的疏水相互作 用的大小来分离的，含有疏水的机制也能以同样的保留方式分离。固定相上还有少数物质，如混合相（例如苯基-己基）、末端封闭和非末端封闭 种类和极性嵌入相-也存在于这些键合硅胶上。还有很多填料用于反相色谱，包括聚合物，聚合物表面涂上硅胶和氧化铝，无机-有机混合物，涂层氧化锆，和 石墨化碳。不同种类的

9、固定相有他们自己的优点和缺点。反相色谱柱利用各种流动相和添加物可以有很多的应用。一些技术利用添加物可 以改变或修饰填料的表面。有时候这些添加物有可能会污染键合相表面。硅胶表 面因为有着疏水键合相而有一些别的化学性质。 残留的硅烷醇存在于所有的硅胶 键合填料中。这些硅烷醇具有弱酸性，因此能与某些待分析物合基质成分， 特别 是碱性成分。因为硅烷醇的pKa值大约是4.5，离子化能在中性pH条件下发生 因此与阳离子产生静电相互作用就有可能发生。 较老的A型硅胶能容纳高浓度金 属离子（有时候100ppm或更多），而这能使硅胶表面的酸性更大甚至能发生金属 鳌合现象或清除一些化合物。残留硅烷醇在非末端封闭的

10、硅胶合短链键合相如 C2或C4上更让人烦恼。使用者必须清楚他们所用的固定相表面特殊性质和可能的分析物-固定相表面 的相互作用，这样当他们使用反相方法时才能考虑到可能的基质相互作用。 例如， 非常疏水的样品基质如玉米油，高芳香物质，和蜡能粘住固定相装填表面并且改 变他们的性质。含有蛋白质物质的生物流体也能吸附在装填表面。尽管分析者想尽最大努 力来保护HPLC柱子，某些分析物-基质污染能使固定相受到有害的影 响。当柱子被污染，它的色谱行为和没被污染的柱子会有些不同。 被污染的柱子能产 生反压问题。 被污染的反相柱子必须清洗和再生才能恢复原来的操作条件。这 部分的"柱子观察"将讨

11、论可行的方法使柱子回复原来的或差不多原来的状态。因为键合硅胶柱子是最受欢迎的，我重点讲述这种柱子。最后，我将讨论别的反相 柱子的清洁步骤。什么导致反相柱子污染产生？通常，样品中含有一些对分析者来说不感兴趣的东 西。盐、脂质、含脂物质、腐质酸、疏水蛋白质和其它一些生物物质是一些可能 在使用时与HPLC柱发生相互作用的物质。这些物质有比分析者的目标物或少或 大的保留值。那些保留值较小的物质如盐类一般来说在空体积时就被冲出色谱 柱。这些非目标产物的干扰能被检测器检测到而且能形成色谱峰，气泡，基线上移或者是负峰。如果样品成分在柱子中有很强的保留而且流动相溶液成分不足以 把这些物质洗脱下来，多次上样后，

12、这些吸附在柱子表面的物质通常就会积累在 柱头。这些行为通常只有通过平行实验才能发现。有着中等保留值的样品能被缓 慢洗出而且表现为宽峰，基线扰动，或者基线漂移。有时候这些被吸附的样品成分累积到一定程度足以使他们开始形成新的固定相。 分析物能与这些杂质作用形成一定的分离机理。保留时间会波动，拖尾会出现。 如果足够的污染产生，柱子的反压能超过泵所能承受的最大压力， 使柱子无法工 作以及在堵塞处产生空体积。清洗硅胶键合柱子再生被污染HPLC柱子的关键是知道污染物的性质并且能找到适当的溶剂来去 除。如果污染是因为重复进样时强保留物质的累积引起的，利用简单的步骤来除 去这些污染物往往能恢复其色谱行为。有时

13、候，经过多次操作以后的色谱柱用 90100%的溶剂B （双溶剂反相系统中较强的溶剂）冲洗 20个体积可以清除污 染物。例如，柱子中残留的脂质就能用非水溶剂如甲醇、乙晴、四氢呋喃。如果你使用的是缓冲液系统，不要直接切换到强溶剂，突然转换到高浓度有机溶 剂可能会使HPLC流动体系中的缓冲液沉淀，这样会导致更大的问题如柱头堵塞、管道堵塞、泵泄漏、活塞损伤或进样阀转轴失灵。应该先用无缓冲流动相（即 把缓冲液换成水）。冲洗510个体积以后才更换强溶剂。有时候，强溶剂也没法把残留在色谱柱上的污染物洗掉。那么更强的溶剂或者是 一系列溶剂就有必要用来清洗柱子了， 如果污染物是非生物物质，使用者可以跳 过一个或

14、多个另外的有机溶剂去除污染物。 溶剂与溶剂之间的组合有很多。到柱 子厂家的网页上能找到推荐的溶剂系统。一般来说，所有的清洗方法都有类似的形式。所用的溶剂都是随溶剂强度增加， 经常最后一个溶剂是非常疏水的（如醋酸乙酯甚至是烃），可以用来溶解非极性 物质如脂质和油类。我们必须保证一系列溶剂中每个溶剂都能与下一个溶剂互 混。清洗过程要结束时，必须借助一个中等强度能互混的溶剂而回到原始溶剂系统。 例如，异丙醇是一个非常好的作为中间步骤的溶剂，因为它能与正己烷或二氯 甲烷互溶又能与水相溶剂互溶。但是异丙醇粘度非常大，必须确保较低的流速以 免使泵压过高。当然，如果使用紫外检测器的话，避免溶剂在紫外区域有吸

15、收，要不然需使用大 量的溶剂冲洗才能使基线平稳。对于典型的硅胶键合柱来说如果没有缓冲溶液的话推荐使用以下溶剂系列：100%甲醇100%乙晴75%乙晴一25%异丙醇100%异丙醇100%二氯甲烷100%正己烷用二氯甲烷或正己烷以后，由于溶剂相容性柱子必须用异丙醇冲洗后才能用原来 的水相溶剂。每种溶剂至少冲洗 10个柱体积。如250mM 4.6mmHPL（分析柱， 分析者可以用12ml/min的流速来冲洗，要回复原来的溶剂体系，不需要每一 步都冲洗，可以跳过中间步骤。中间步骤推荐使用异丙醇，然后用没有缓冲的流动相，最后回复起始流动相配置。四氢呋喃是另外一种比较受欢迎的去除污染 的溶剂。如果使用者怀

16、疑柱子被严重污染，可以二甲基亚砜（DMSD或 者二甲基甲酰铵和水按50: 50的比例混合用低于0.5ml/min的流速流过色谱柱。成功 再生反相柱子是一个非常耗时间的过程，溶剂冲洗可以利用梯度系统过夜操作。 常见液相色谱柱性能比较一、高性能色谱柱特点：柱效高，价格高，通用性好，使用寿命长，pH范围宽1、Waters 公司 Xbridge评分902005年waters公司推出，杂化颗粒柱优点：pH 1-12,在高pH状态下，没有能与此色谱柱匹敌的，目前市场的宽 pH 色谱柱在高pH的状态下（9-12 ）普遍寿命很短，如Gem ini,资生堂公司Capcell， YMCPro-C18包括water

17、s的第一代杂化柱 Xterra 都是寿命不长，Zorbax Extend 更是不堪。柱效与一流的硅胶柱相当，甚至有过之无不及，杂化颗粒柱和聚合物色谱柱的问 题在于柱效，Xterra和常见的PSDVB勺色谱柱都有不错的pH范围，但是柱效低 的问题无法解决，这是聚合物填料一般比较软且不耐压的原因造成。在如此宽的pH范围，最大的好处是可以在化合物的保留平台区去开发方法 （pH1-3,pH9-12），这样能得到更稳定更容易重现的方法，对酸性，中性，尤其 是碱性化合物都能得到理想的峰形。注：Waters UPLC色谱柱与Xbridge采用同类型填料，只是颗粒度是 1.7um,所 以不再重复。缺点：价格高

18、，平均每支Y 7000多的，不是大多数中国客户可以接受的。2、MerckChromolith整体化色谱柱评分90Merck公司2001年推出，整体化色谱柱，2001年Pitticon Editors 金奖 优点：高流速、低压力，可以快速分析样品，因为压力低，所以可以串联色谱柱以获得更高的柱效而不用担心色谱柱耐压问题,低压力是因为硅胶棒的大量中孔在处理比较脏的样品的时候会优势特别适合之前分析时间超长的实验因为成分复杂，之前出峰要2个小的存在，中孔的存在也让这支色谱柱不怕堵, 很大（如中药），实际的寿命也因此延长。 这个色谱柱最大的特点是柱效高出峰时间快, 条件，目前很好的例子就是人参的指纹图谱,

19、 时，现在用整体化色谱柱30min就可以分析完了（已经在省药检所做过测试） 且不影响柱效，类似于UPLC但不像UPLC那么容易堵。如果需要谱图，我可以 免费提供。缺点：规格单一，单价比较高，单价Y 7000左右，所以通过串联获得更高柱效 的方式显得比较奢侈。市场推广的并不是很好，知名度比较低。3、Phe nomen ex公司 Gemini评分80 采用硅胶球聚合物包被技术。pH1-12，优点：因为聚合物涂层抑制了碱性溶液水解硅胶，所以可以承受一定的碱性条件， 由于是硅胶球颗粒，所以柱效不错，比 Xterra或者PSDVE这类色谱柱柱效好。 单价比较低，Y 3000以内。缺点：聚合物涂层稳定性比

20、较差，所以当涂层损失时，色谱柱会很坏被碱性溶液 溶解，这也是其寿命远不及Xbridge的原因。另外涂层损失也会影响结果重现性。4、资生堂Cap cell 评分70采用硅胶球聚合物包被技术。pH1-10，优点：其实采用了和Gem ini同样的技术，只是参数指标比phe nome nex低调。有 非官方消息称其实是phenomenex购买的资生堂的该项技术。缺点：市场推广远差于 phe no me nex,单价偏高，Y 5000以内。5、Agile nt ZorbaxExte nd评分50采用双配位键和相技术。pH2-10优点：不详缺点：在各公司的高pH使用时间测定表，基本上都会拉上 Extend

21、，大多数公司 的数据都说明该款色谱柱的耐高 pH能力很差，甚至不如一些高纯硅胶柱。单价Y 5000左右。一个理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯 品和低毒性等特征。选好填料（固定相）后，强溶剂使溶质在填料表面的吸附减少，相应的容量因子 k降低；而较弱的溶剂使溶质在填料表面吸附增加，相应的容量因子k升高。因此，k值是流动相组成的函数。塔板数 N般与流动相的粘度成反比。所以选择 流动相时应考虑以下几个方面： 流动相应不改变填料的任何性质。低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料有 时遇到某些有机相会溶胀或收缩，从而改变色谱柱填床的性质。碱性流动相不能 用于硅胶柱系统。酸性

22、流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。 纯度。色谱柱的寿命与大量流动相通过有关， 特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时。 必须与检测器匹配。使用UV检测器时，所用流动相在检测波长下应没有吸收， 或吸收很小。当使用示差折光检测器时，应选择折光系数与样品差别较大的溶剂 作流动相，以提高灵敏度。 粘度要低（应V2cp）。高粘度溶剂会影响溶质的扩散、传质，降低柱效，还会使柱压降增加，使分离时间延长。最好选择沸点在100C以下的流动相。 对样品的溶解度要适宜。如果溶解度欠佳，样品会在柱头沉淀，不但影响了纯 化分离，且会使柱子恶化。 样品易于回收。应选用挥发性溶剂。我下面写的也不是很专业，从自己的记忆

23、中大致如此吧，应该错误很少。如果要 想更好的理解下面的文字，你至少还要知道，何为正相色谱柱，何为反相色谱柱， 当然，了解什么是高效液相色谱主之类的废话我这里就不提了。你要知道这C8和C18是什么物质，或者他们代表什么。他们都是色谱填料的一 种，C8代表该化合物由8个碳组成，c18同理。色谱柱填料的特点是标志色谱柱 的重要方面，你常常会看到在C8或C18的前面，有些其他的名称，比如hypersil 之类的，他们表示在C8或C18的基础上，进行了一些该进，因此更适合于某类 特定化合物的分析。从表面上看，C18和C8的区别就是C18比C8少了 10个碳 原子，而我们要讨论的区别，就是差别这十个碳原子

24、带来的。 这反映了物质决定 意识的基本哲学原理，呵呵。其实谈到色谱，必须要搞清楚的一个就是极性，因为色谱分离的一个重要原理就 是“相似相容”。那我们就先谈谈极性。C8和C18都是反相色谱柱的一种，适用于分析弱极性的物质，而C8在弱极性较强的一侧，C18在极性较弱的一侧。也就是说，C8适合分析弱极性物质里极性稍 强的一类物质，C18适合分析弱极性物质里极性更弱的物质。这是他们极性上的 差别，但是差别并不是特别明显，一般能用C8分析的物质，在C18上也能分离。 这是因为，后者比前者的保留特性更好一些，这似乎和色谱柱填料的结构关系更 为密切。在让我们谈谈空间位阻的问题，也许由于 C18比C8的碳链更长，因此带来更好 的保留特性。因此C8就更适合分析大分子类的物质，比如一些球蛋白等，都用 C8和缓冲盐洗脱剂来配合使用。相反，分子量较小的物质，经常用C18来进行分析和分离。另外，你还会经常在C18前面看到“ ODS的字样，ODS是英文octadecyl silane