RNA-的提取琼脂糖电泳及RTPCR

1、RNA-的提取琼脂糖电泳及RTPCRRNA-的提取琼脂糖电泳及RTPCR目的目的 DNA片段片段 质粒质粒 TA载体载体重组质粒重组质粒目的目的 DNA转化转化无质粒的无质粒的 死亡死亡有质粒的有质粒的 存活存活含抗生素培养基中生长含抗生素培养基中生长PCR 2-3min 实验内容实验内容1、小鼠肝脏组织总、小鼠肝脏组织总RNA的提取；的提取；2、RNA的琼脂糖凝胶电泳；的琼脂糖凝胶电泳；3、以总、以总RNA为模板的逆转录反应；为模板的逆转录反应；4、以、以cDNA为模板的特定基因的为模板的特定基因的RT-PCR: 注：本次实验扩增注：本次实验扩增GAPDH基因基因(746bp)5、 PCR产

2、物的电泳及回收产物的电泳及回收（8：058：15）教师要有下午电泳时教师要有下午电泳时 播放的多媒体播放的多媒体 PCR Flash 动画动画 PCR在法医学上的应用在法医学上的应用RNA提取操作注意事项提取操作注意事项 RNA RNA分离的关键因素是减少分离的关键因素是减少RNARNA酶污染。酶污染。 RNA酶是一类自然界中广泛存在、生物活性非常稳定的酶类。环境中的灰尘、酶是一类自然界中广泛存在、生物活性非常稳定的酶类。环境中的灰尘、人体汗液、唾液、实验器材表面。人体汗液、唾液、实验器材表面。RNase耐热、耐酸、耐碱，不需要辅助因子就耐热、耐酸、耐碱，不需要辅助因子就具有活性作用。具有活性

3、作用。 1、尽量避免外源性、尽量避免外源性RNase 污染污染 a. 操作环境空气洁净。带手套、口罩。操作环境空气洁净。带手套、口罩。 b. 用新开封的化学试剂。（试剂应该专用）用新开封的化学试剂。（试剂应该专用） c.一次性塑料器材最好是新开封并经过一次性塑料器材最好是新开封并经过DEPC水处理及高压灭菌。水处理及高压灭菌。 d.玻璃器材、水都应该经过去玻璃器材、水都应该经过去RNase 处理。对玻处理。对玻 璃器材还应该进行高温烘烤。璃器材还应该进行高温烘烤。 2、应用、应用RNase 抑制剂抑制内源性抑制剂抑制内源性RNase 活性活性。 总总RNA 真核细胞的真核细胞的RNA主要分为：

4、主要分为： 1、mRNA: 1-5% 起始密码：起始密码：AUG 终止密码：终止密码：UAA,UAG,UGA。 5鸟嘌呤鸟嘌呤7位甲基化位甲基化CH3修饰。修饰。 1）免受核酸酶破坏，）免受核酸酶破坏， 2）起始、促进蛋白质合成。）起始、促进蛋白质合成。 3poly(A)尾巴结构尾巴结构 20-200个个A. 翻译所必需。翻译所必需。 2、tRNA: 10-15% 3、rRNA: 80-85% 大亚基大亚基60S: 28S=4718nt 5S=120nt 5.8S=160nt 小亚基小亚基40S: 18S=1874nt1 1）将）将1 ml Trizol 1 ml Trizol 试剂分装到试剂

5、分装到Eppendorf Eppendorf 管中备用。管中备用。2 2）实验教师操作）实验教师操作: : 取新鲜小鼠肝脏组织，组织块不宜过大取新鲜小鼠肝脏组织，组织块不宜过大, ,放在放在玻片上立即研磨玻片上立即研磨, ,研磨研磨要彻底要彻底。 3 3）将研磨后的组织（）将研磨后的组织（小米粒大小小米粒大小）转移至）转移至1 ml Trizol 1 ml Trizol 试试剂中，盖紧盖，上下颠倒混合剂中，盖紧盖，上下颠倒混合2 min2 min以上，使组织细胞充分裂以上，使组织细胞充分裂解。肉眼观察可见液体变成均匀浑浊状。解。肉眼观察可见液体变成均匀浑浊状。 4 4）室温孵育）室温孵育10

6、min10 min。（8：159：05）发放口罩，帽子，每个组来一个人领取。发放口罩，帽子，每个组来一个人领取。强调肝脏组织块不宜过大强调肝脏组织块不宜过大,研磨要彻底。研磨要彻底。第一部分：提取小鼠肝脏组织的总第一部分：提取小鼠肝脏组织的总RNA1、异硫氰酸胍法：、异硫氰酸胍法： GuSCN 是一种强的蛋白质变性剂，能够裂解细胞的同时，还能有效地是一种强的蛋白质变性剂，能够裂解细胞的同时，还能有效地抑制内源性抑制内源性 Rnase的活性，通过有机溶剂的分步抽提，可获得纯度较高的细的活性，通过有机溶剂的分步抽提，可获得纯度较高的细胞总胞总RNA。 特点：需低温操作，但价格经济。特点：需低温操作

7、，但价格经济。2、Trizol 试剂试剂（商品化产品）（商品化产品） 特点：在室温下可以提取细胞总特点：在室温下可以提取细胞总RNA， 具有简单、快速、提取量大、纯度高的优点。具有简单、快速、提取量大、纯度高的优点。3、mRNA提取试剂盒提取试剂盒 真核细胞真核细胞mRNA的的3末端有末端有ploy(A)尾，利用寡聚尾，利用寡聚 dT纤维素结合纤维素结合mRNA，将其从细胞总，将其从细胞总RNA中分离出来。中分离出来。课间介绍课间介绍 RNA提取的几种方法提取的几种方法室温孵育室温孵育10 minRNase抑制剂介绍抑制剂介绍1、DEPC, 二乙基焦炭酸盐二乙基焦炭酸盐 RNA操作时最常用的操

8、作时最常用的RNase抑制剂，对核酸酶有抑制剂，对核酸酶有 很强的抑制作用。很强的抑制作用。作用机制是与蛋白质中的组氨酸结合，使蛋白质变性。作用机制是与蛋白质中的组氨酸结合，使蛋白质变性。 使用方法：用来去除溶液中的使用方法：用来去除溶液中的RNase 。RNA提取中提取中 所有液体试剂都应该用所有液体试剂都应该用DEPC处理。处理。 有效浓度：有效浓度：0.05%-0.1%，室温磁力搅拌，室温磁力搅拌20分钟。分钟。 灭活条件：高压消毒，或灭活条件：高压消毒，或70 C 1 h。 在在Tris溶液中半衰期为。溶液中半衰期为。 储存方法：不能用聚苯乙烯器皿。储存方法：不能用聚苯乙烯器皿。4 C

9、 ，或液氮中。，或液氮中。2、肝素、肝素 使用浓度：使用浓度：0.110mg/ml 效效 果果: 37 C 时，可抑制时，可抑制95%的的RNase 活力。活力。 如果与如果与DEPC联合应用，联合应用， 具有极强的抑制具有极强的抑制 效果。效果。 室温孵育室温孵育10 min 结束结束5 5）加入）加入200 200 l l氯仿，震荡混匀氯仿，震荡混匀20-30 s20-30 s，室温放置，室温放置5 min5 min （此期间液体开始分层，不要轻易搅动液体）（此期间液体开始分层，不要轻易搅动液体） 10, 000 rpm10, 000 rpm，离心，离心 5 min (5 min (统一离

10、心统一离心) ) 7 7）将清澈透明的上层水相）将清澈透明的上层水相 转移至另一离心管中。转移至另一离心管中。9：0510：05RNA (清澈透明清澈透明)DNAProtein第一部分：提取小鼠肝脏组织的总第一部分：提取小鼠肝脏组织的总RNA RNA提取提取:RNA (清澈透明清澈透明)DNAProtein8 8）沉淀）沉淀RNARNA：加：加0.5 ml0.5 ml异丙醇，上下颠倒混匀，室温异丙醇，上下颠倒混匀，室温10 min10 min。 10, 00010, 000 rpmrpm，4 4 C C，( (统一统一) ) 离心离心10 min10 min，弃上清。，弃上清。1010）加）加

11、1ml 75%1ml 75%乙醇洗涤。乙醇洗涤。1111）7500rpm7500rpm，4 4 C C 离心离心 1 min1 min，弃上清，弃上清 再离心几秒钟，将管壁液体完全移净。再离心几秒钟，将管壁液体完全移净。在用在用TriZol试剂提取总试剂提取总RNA时，全程均在室温进行，当时，全程均在室温进行，当RNA沉淀用水溶解后，应该注意在冰上沉淀用水溶解后，应该注意在冰上操作，而且尽可能快地进入下一个环节。操作，而且尽可能快地进入下一个环节。离心离心10分钟时分钟时课间休息课间休息注意：注意：75%乙醇的作用：不起沉淀作用，只是为了清洗管壁加入方法一定是贴管壁在沉淀的对侧缓慢贴管壁在沉淀

12、的对侧缓慢加入，不要搅动沉淀加入，不要搅动沉淀12）室温干燥）室温干燥35 min（根据（根据RNA沉淀大小决定，干燥后的沉淀应该是沉淀大小决定，干燥后的沉淀应该是无色胶样透明状，避免过分干燥无色胶样透明状，避免过分干燥,此步骤非常关键。）此步骤非常关键。）注意事项：注意事项：RNA:自然室温干燥避免放在37oC孵箱中过度干燥以防无法溶解。RNA沉淀必须绝对干燥，微量乙醇残留，容易造成沉淀必须绝对干燥，微量乙醇残留，容易造成RT的失败，的失败，但过分干燥又是造成但过分干燥又是造成RNA不溶解的主要原因不溶解的主要原因 。判断。判断RNA沉淀沉淀是否充分干燥但又不是过分干燥是逆转录成功的关键环节

13、。干是否充分干燥但又不是过分干燥是逆转录成功的关键环节。干燥后的沉淀应该是无色胶样透明状。燥后的沉淀应该是无色胶样透明状。RNA pellet：乳白色，透明胶样乳白色，透明胶样干燥后无色透明干燥后无色透明13）用加样器吸取冰冷）用加样器吸取冰冷DEPC-H2O 18 l，加到，加到RNA上，进行吹打溶解上，进行吹打溶解RNA 沉淀。溶解的沉淀。溶解的RNA应置冰上保存。应置冰上保存。14) 14) 吸出吸出 9 9 l l溶液放到冰上备用溶液放到冰上备用( (将用于电泳将用于电泳).).15) 15) 剩余剩余 9 9 l l溶液溶液, ,放到冰上备用（用于放到冰上备用（用于RTRTPCRPC

14、R）. .RNA的溶解：的溶解：v注意：注意： RNA沉淀的溶解一定要耐心充分，沉淀的溶解一定要耐心充分，一定一定要用加样器要用加样器反复反复多次吹打方可。但由于溶多次吹打方可。但由于溶液体积非常小，要避免出现气泡影响液体积非常小，要避免出现气泡影响RNA的溶的溶解。解。避免气泡的方法：避免气泡的方法：用加样器的第一挡用加样器的第一挡每次吹打都不要打出气体每次吹打都不要打出气体判断溶解程度：判断溶解程度：吹打时液体流动不拐弯为止。吹打时液体流动不拐弯为止。 逆转录酶：逆转录酶： 存在于逆转录病毒体内。 常见有哺乳动物型37oC，禽类型42oC 。 以mRNA为模板的DNA聚合酶，形成与RNA碱

15、基相互补DNA链，后者称为互补DNAcDNA。 RNAaseH的活性：切掉DNA和RNA杂合链上的RNA。 RT第二部分：逆转录反应第二部分：逆转录反应 (RT)AAAAAA(n)mRNAAAAAAA(n)3-TTTTTT(18)-568-70oC, annealingAAAAAA(n)3-TTTTTT(18)-537-42oC, RTase mRNAmRNAcDNA10min1-2h RT 按照下列配方进行按照下列配方进行RNA的的RT反应：反应：第一步：第一步：总总RNA 9 l Oligo dT g/ml) 1 l (终：终：2.5 ng/ml) 轻弹管底混合，轻弹管底混合， 置置65水

16、浴水浴10min后，后， 立即冰浴立即冰浴2min。在水浴在水浴10分钟时，开始分钟时，开始RNA电泳。电泳。RT引物的用量非常少，引物的用量非常少，因为模板量是固定的，而因为模板量是固定的，而且只进行一次反应。且只进行一次反应。关键点：关键点：RNA是否充分溶解是否充分溶解根据组织或细胞的量确定逆转录反应的根据组织或细胞的量确定逆转录反应的体积，通常利用体积，通常利用1ml Trizol试剂提取出来试剂提取出来的总的总RNA适合于适合于20 l体积的逆转录反应体积的逆转录反应体系。体系。引物的量是否合适引物的量是否合适高温退火避免高温退火避免Oligo dT锚锭点错误，同时，锚锭点错误，同时

17、，打开打开RNA链之间的二级结构，利于链之间的二级结构，利于RT。 退火后一定迅速放在冰上退火后一定迅速放在冰上在水浴在水浴10分钟时，开始分钟时，开始RNA电泳。电泳。 将将 RNA 进行进行 1% 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 9 l RNA 样品样品 23 l 上样液轻轻混匀，上样液轻轻混匀， 上样上样 电泳电泳: 120伏，伏，1020分钟分钟 注意注意: 电泳槽的清洁及新的电泳液！电泳槽的清洁及新的电泳液！ 琼脂糖凝胶要新鲜配制！琼脂糖凝胶要新鲜配制！ 紫外透射仪观察电泳结果紫外透射仪观察电泳结果RNA电泳结果电泳结果 rRNA可以作为内部可以作为内部Marker分子，分子，通过观察

18、通过观察rRNA的两条带（的两条带（28S和和18S）的比例，可以判断所提取）的比例，可以判断所提取mRNA是否存在降解。是否存在降解。 RNA电泳并不能判断电泳并不能判断mRNA是否提是否提取成功，也不作为鉴定取成功，也不作为鉴定RNA提取质量提取质量的常规方法，因为的常规方法，因为在电泳过程中在电泳过程中RNA可能发生降解可能发生降解。重点讲解重点讲解28S、 18S和和5S的比例。的比例。 分析本次实验结果：分析本次实验结果：28S、 18S和和5S的比例。的比例。RNA电泳结果分析电泳结果分析第二步：向上述反应溶液中依次加入下列试剂：第二步：向上述反应溶液中依次加入下列试剂： 5 RT

19、-buffer 4 l RNasin (40U/ml) 1 l dNTPs (10mmol/L) 4 l AMV 1 l轻弹管底混合，可用离心机甩一下。轻弹管底混合，可用离心机甩一下。置置42 oC 水浴水浴1h。将上述反应移至将上述反应移至68 oC水浴水浴10min以灭活以灭活 RTase，并冰浴，保存备用。，并冰浴，保存备用。（10：3011：30 由老师结束实验，放由老师结束实验，放-20 oC，下午使用，下午使用 ）cDNA 4 l10PCR buffer（含MgCl2） 5 ldNTPs (10mmol/L) 1 l5引物 (10mol/L) 1 l3引物 (10mol/L) 1

20、l去离子水（补足反应体系） 39 l Taq DNA pol. (2U/l) 1 l 轻弹管底混合（用离心机甩一下）轻弹管底混合（用离心机甩一下）注意：最后加入注意：最后加入Taq 酶。酶。 PCR 操作操作 50l在一微量离心管中依次加入下列试剂：在一微量离心管中依次加入下列试剂：PCR仪设定的反应条件：仪设定的反应条件：94oC 45 S DNA变性变性55 oC 45 S DNA复性复性72 oC 1 min 产物链延伸产物链延伸 25-30个循环后个循环后 72 oC 10 min 根据待扩增基因片段的长短确定具体反应条件，一般情况下，基因片根据待扩增基因片段的长短确定具体反应条件，一

21、般情况下，基因片段在段在500-1000bp左右时，可按下列条件进行左右时，可按下列条件进行PCR。PCR仪介绍：仪介绍：如果上盖加热的如果上盖加热的PCR仪，可以直接放入仪器中进仪，可以直接放入仪器中进行行PCR；如果下面加热的如果下面加热的PCR仪，加入仪，加入2滴矿物油后，滴矿物油后，加入仪器中，不过这种仪器现在已经很少加入仪器中，不过这种仪器现在已经很少用到。用到。PCR反应期间讲解：反应期间讲解： 1：203：00PCR仪内发生的反应仪内发生的反应1）对于定性分析特定基因在不同样本中的表达情）对于定性分析特定基因在不同样本中的表达情 况时，一定要防止污染，尤其是况时，一定要防止污染，

22、尤其是PCR产物的污产物的污 染，为了排除假阳性结果，各种对照是必不可染，为了排除假阳性结果，各种对照是必不可 少的。少的。2）模板不是越多越好，模板过多，当引物与模板）模板不是越多越好，模板过多，当引物与模板 退火时会发生模板先互补结合，引物无法与模退火时会发生模板先互补结合，引物无法与模 板结合，因此，适量模板量是非常重要的。板结合，因此，适量模板量是非常重要的。 模板过多还能大量消耗镁离子。模板过多还能大量消耗镁离子。PCR反应注意事项：反应注意事项： 根据待扩增基因片段的大小确定延伸时间，小于500bp，一般采用1分钟即可，大于500bp，可采用2分钟，但一般超过202Xbp，一般可适

23、当延长延伸时间2-3分钟。 变性 温度一般选用941oC，变性时间可根据模板大小和浓度确定，一般采用30秒。 退火 温度与引物序列关系非常密切，退火时间与引物长度和GC含量有关。 引物长度一般在15-25bp之间。 Tm=4(G+C)+2(A+T)如何确定如何确定PCRPCR的变性、退火和延伸温度和时间？的变性、退火和延伸温度和时间？RT的引物选择：的引物选择： Oligo (dT)15-18 Specific anti-sense primer Random primer因为基因序列与因为基因序列与mRNA序列是一致序列是一致的。的。病毒病毒RNA作为作为RT模板模板时，一定要知道病毒是时，

24、一定要知道病毒是属于哪一种病毒：正链属于哪一种病毒：正链RNA病毒？负链病毒？负链RNA病病毒？毒？正链正链RNA病毒：病毒：RT引物用引物用anti-sense primer；负链负链RNA病毒：病毒：RT引物用引物用sense primer。 1.为什么要加入镁离子？为什么要加入镁离子？ 镁离子是镁离子是Taq DNA聚合酶的辅酶，聚合酶的辅酶，mM的浓度时酶活性最高。镁离子能的浓度时酶活性最高。镁离子能够和负离子集团结合，在够和负离子集团结合，在PCR反应中，模板反应中，模板DNA、引物、引物DNA、dNTP均可均可和镁离子结合，尤以和镁离子结合，尤以dNTP影响最大。一般镁离子应比影响

25、最大。一般镁离子应比dNTP高。高。 的浓度对的浓度对PCR有什么影响？有什么影响？ dNTP浓度过高，除容易引起碱基错配外，还可结合镁离子。浓度过高，除容易引起碱基错配外，还可结合镁离子。 3.3.为什么有时候需要进行热启动？为什么有时候需要进行热启动？ 热启动就是让热启动就是让DNA在变性温度下开始，在变性温度下开始，Taq DNA聚合酶在聚合酶在DNA双链充分打开之后再加入双链充分打开之后再加入PCR反应体系中，这样可以保证模板反应体系中，这样可以保证模板DNA变性变性充分，引物结合顺利并特异。充分，引物结合顺利并特异。 PCRPCR反应相关问题：反应相关问题：4、DNA聚合酶：聚合酶：1）Taq DNA聚合酶的特性聚合酶的特性:半衰期：半衰期：95oC ，40分钟分钟活活 性：性：5-3方向的聚合酶活性。方向的聚合酶活性。 5-3外切酶活性。外切酶活性。 缺乏缺乏3-5外切酶活性。外切酶活性。 因此没有校正功能。因此没有