咪唑乙烟酸高效降解细菌的筛选及其原生质体制备的研究(完成)

1、东北农业大学学士学位论文 学号：A03050160咪唑乙烟酸高效降解细菌的筛选及其原生质体制备的研究学生姓名：王任指导教师：李春艳 教授所在院系：资源与环境学院所学专业：生物技术研究方向：应用微生物东 北 农 业 大 学中国哈尔滨2010 年 5 月Dissertation for Bachelors Degree of Mrtheart Agricultural University NO.：A03050160Study on the Screening of Imazethapyr Degradation Bacteria and Protoplast PreparationCandida

2、te: Wang RenSupervisor: Pro. Li ChunyanCollege: Resources Environment collegeSpeciality: BiotechnologyOrientation: Applied MicrobiologyNortheast Agricultural UniversityHarbin ChinaMay. 2010摘要除草剂咪唑乙烟酸是咪唑琳酮类性除草剂。咪唑乙烟酸具有杀草谱广、选择性强、活性高等优点，在世界范围内得到广泛应用。自从1993年咪唑乙烟酸国产化，成本下降，用量大幅增加，在我国大豆产区得到大面积的推广和应用。咪唑乙烟酸残

3、效期长，使下茬敏感作物容易产生药害，因此其在土壤中的归趋行为越来越引起重视。原生质是有组织的生活物质，是细胞生命活动的物质基础。原生质体是由原生质特化而来。原生质体技术的关键是对细胞壁进行消化，以形成大量的原生质体，并使原生质体能高频率的再生细胞壁，回复到正常细胞状态。本文利用富集驯化技术从长期生产咪唑乙烟酸的农药厂排污口处污泥及污水中驯化培养得到能够降解咪唑乙烟酸的细菌1株, 标记为P310-1，该菌株能够以咪唑乙烟酸为唯一碳源稳定生长。本实验采用化学方法制备筛选所得的降解菌的原生质体，经测定，当稳定剂为pH6.5、再生培养基的pH为7.5时，菌株P310-1原生质体制备及再生的最佳条件为：

4、溶菌酶浓度、温度、酶解时间条件为：2.9 mg/ mL、35、3.50 h。并采用药敏片方法测定降解菌的抗药性，并将其作为遗传标记，为对降解菌的后续原生质体融合研究提供试验数据。关键词：咪唑乙烟酸；降解菌；分离；原生质体制备AbstractHerbicide imazethapyr is the imidazolinone herbicide. Imazethapyr is a one of broad spectrum herbicides, also has high selectivity and high activity, therefore it had been widely u

5、sed around the world. Since 1993, the imazethapyr has been localization, and its cost has reduced, application amount has increased, it began to get the promotion and application of large area in Soybean producing areas of our country. The longer residual period of imazethapyr could make drug misadv

6、enture for sensitive crops, so the fate of its in the soil has been more and more attention.Archoplasm is the organizational living material, is the the material basis of cell vital movement, all the archoplasm has the similar basic components and characteristics. Protoplast is specializationed from

7、 the archoplasm. The key of protoplast technology is to digest the cell wall to form a large number of the protoplasts, and to make protoplast can regeneration cell wall altofrequently, so that to back to the normal cell state. In this paper, the bacteria 1 degrading imazethapyr can be acquired from

8、 the sludge and sewage in the long-term producting-imazethapyr factory by enrichment acclimation technique, labeled as P310-1, this bacteria can be stabilizly live with imazethapyr as the sole carbon.In this study, the protoplasts degradation bacteria prepared by chemical screening was determined th

9、at when the stabilizer is pH6.5 and regeneration medium pH was 7.5, protoplast preparation and regeneration optimum conditions of Strain P310-1: lysozyme concentration, tempera- ture, reaction time conditions were: 2.9 mg / mL、 35 、 3.50h.And the drug resistance of degradation bacteria was determine

10、d by using susceptibility test, and as genetic markers for providing the research test data on study of the subsequent of degradation bacteria protoplast fusion.Key words: imazethapyr ; degradation bacteria; screen; protoplast preparation目录摘要IAbstractII1 前言11.1 咪唑啉酮类除草剂的发展概况11.1.1 咪唑啉酮类除草剂的应用11.1.2

11、咪唑啉酮类除草剂作为长残效除草剂的危害11.1.3 治理生物降解菌的优点11.2 咪唑乙烟酸的简介11.2.1 理化性质11.3 生物修复21.3.1 生物修复的定义、分类，微生物修复21.3.2 微生物降解农药的研究21.3.3 基因工程菌在微生物降解、生物修复中的应用31.4 原生质体融合的研究进展31.4.1 定义、原理、应用方向31.4.2 构建方法、影响因素31.4.3 原生质体融合在微生物降解中的应用41.5 本研究的目的及意义42 材料与方法62.1 试验材料62.1.1 试验仪器62.1.2 试验药品及试剂62.1.3 试验培养基的配制72.2试样采集72.2.1 试样来源72

12、.2.2 试样采集72.3 降解菌的驯化与分离纯化82.4 回接试验及高效降解菌筛选82.5 降解菌株的形态学观察82.5.1 降解菌菌体形态的观察82.5.2 降解菌菌落形态的观察82.5.3 降解菌液体培养观察82.6 降解菌株原生质体制备及再生影响因素的研究92.6.1 降解菌株P310-1遗传标记筛选92.6.2 菌株P310-1原生质体的制备及再生93 结果与分析123.1 咪唑乙烟酸降解菌株的筛选123.2 降解菌株原生质体制备及再生的研究123.2.1 降解菌株P310-1遗传标记筛选123.2.2 降解菌株D310-1生长曲线绘制133.2.3 菌株P310-1原生质体制备及再

13、生影响因素分析144 讨论164.1 咪唑乙烟酸降解菌的筛选164.2 降解菌P310-1原生质体制备及再生影响因素165 结论18参考文献19致谢211 前言1.1 咪唑啉酮类除草剂的发展概况1.1.1 咪唑啉酮类除草剂的应用咪唑啉酮类除草剂是20世纪80年代美国氰胺公司发现的一类超高效除草剂。主要用于大豆、花生、蔬菜等旱田作物，防除众多的一年生和多年生禾本科杂草以及阔叶杂草、莎草科杂草等。咪唑啉酮类除草剂的作用机理是：这类除草剂是乙酰乳酸合成酶（ALS）或乙酰羟酸合成酶（AHAs）的抑制剂，即通过根、茎、叶吸收，并在木质部和韧皮部传导，积累于植物分生组织内，抑制植物的乙酰乳酸合成酶，阻止支

14、链氨基酸，如颉氨酸、亮氨酸、异亮氨酸的生物合成，从而破坏蛋白质的合成，干扰DNA合成及细胞的分裂与生长，最终造成植株死亡。1.1.2 咪唑啉酮类除草剂作为长残效除草剂的危害咪唑啉酮类除草剂作为一种长残效除草剂很难分解。比如我国北方地区的寒冷气候条件使土壤中长残效除草剂很难在短时间内降解。严重影响了种植业结构调整和换茬轮作，南方多季种植结构仍会造成除草剂的残留药害。因此有关长残效除草剂的危害问题日趋严重。1.1.3 治理生物降解菌的优点生物降解菌在处理长残效除草剂的危害方面具有速度快、消耗低、效率高、条件温和，无二次污染、对环境友好等显著优点，为从根本上解决长残效除草剂的危害问题提供了无限的希望

15、。1.2 咪唑乙烟酸的简介1.2.1 理化性质咪唑乙烟酸，通用名称咪草烟(imazethapyr)，纯品外观为白色无味结晶体，熔点172750.蒸汽压15 mm强抑制作用，由药敏试验结果可知：利福平、替考拉宁、头孢噻吩、苯唑青霉素、呋喃妥因对P310-1无作用，依诺沙星、多粘菌素B有弱作用，试验范围内的其他抗生素均有强抑制作用；3.2.2 降解菌株D310-1生长曲线绘制 按照2.6.2.1操作获得降解菌株P310-1的生长周期分布，见图3-2。由图可知，菌株P310-1在牛肉膏蛋白胨培养基中培养生长迅速，30 h后即可进入稳定期，按照延滞期、对数期、稳定期、衰减期时间分布选择适合原生质体试验

16、的生理状态进行后续试验。图3-2 降解菌株P310-1生长曲线3.2.3 菌株P310-1原生质体制备及再生影响因素分析 3.2.3.1 菌龄对原生质体制备和再生的影响在本试验中，菌株P310-1菌体生长至对数期中、后期（稳定期初期）时菌体破壁及再生效果接近，后期效果略好于中期，明显优于初期。表3-3 不同菌龄的破壁及再生效果初始OD600值菌株P310-1破壁率%再生率%破壁率再生率1.810051.280.511.699.8849.940.501.310044.830.453.2.3.2 稳定剂配比及其pH值对菌株P310-1原生质体释放的影响按照2.6.2.3（2）中所列的稳定剂配比范围

17、，进行组合，逐一检测，测得出发菌株的原生质体各破壁和再生率。试验结果证明0.55 M蔗糖+0.02 M MgCl26H2O为最佳组合，两株菌的破壁率大于80%，破壁率再生率均大于0.5。稳定剂pH值对菌株P310-1原生质体制备和再生的影响较大（表3-4），在稳定剂为pH6.5时，菌株P310-1的破壁率再生率达0.72，破壁率84.33%。表3-4 不同pH值对破壁及再生的影响初始pH值菌株P310-1破壁率%再生率%破壁率再生率684.8280.270.686.584.3385.830.72779.3774.990.607.580.8573.330.593.2.3.3 再生培养基及其pH值

18、对菌株P310-1原生质体再生的影响由表3-5可以看出，菌株P310-1的原生质体在5种再生培养基上都可以生长，但在MNP上再生长量很少；完全培养基中进行再生培养时，不易形成单菌落现象；完全培养基中再生培养，菌落较小，且生长时间较完全培养基中长；完全培养基中再生株菌生长较分散、菌落相对较小，2-3 d可完成再生培养，菌株P310-1可在完全培养基中良好再生原因可能在于此培养基中主要成分是蔗糖，而细菌、放线菌中多数菌采用糖系统作稳定剂。表3-5 不同培养基对再生的影响培养基菌株P310-1MNP MNP 完全培养基完全培养基完全培养基注：“”表示再生菌株较多，效果明显，“”表示有再生菌株，“”再

19、生菌株较少由再生培养基pH值对原生质体再生影响的试验显示：菌株P310-1形成的原生质体在pH6的再生培养基上生长效果不满足实验要求，pH7.0与7.5 效果一致，综合考虑，确定再生培养基的pH为7.5。3.2.3.4 酶解浓度、时间、温度对原生质体制备和再生的影响溶菌酶的浓度、作用时间及作用温度是菌体原生质体释放、再生的关键，是影响原生质体融合的主要因素。随着溶菌酶浓度的增加，原生质体化程度会增加，但过量的酶作用，会造成细胞壁去除过于彻底，缺少细胞壁再生的引物，会导致再生率降低；酶浓度过大也会引起菌体凝聚成团，降低菌酶接触面积，不利于原生质体的制备；酶解时间短，酶解不彻底，酶解时间长，细胞壁

20、溶解的彻底，但过长时间，溶菌酶继续作用原生质体，致其损伤、破裂，无法再生；酶解温度适宜，使酶活性完全发挥，利于酶解反应，但如果酶解温度过高，溶菌酶钝化、失活，温度过低，会延长酶解时间，影响试验进程。由预实验可知，在酶解过程中溶菌酶的浓度、作用时间及作用温度对对原生质体制备及再生影响是相互关联的，试验中将作综合考虑，结果见表3-6。表3-6 菌株原生质体制备正交试验结果列号因素1因素2因素3破壁率再生率11110.5421220.5431330.7242130.7052210.5262320.6873120.6683230.4993310.58均值10.6000.6330.547均值20.633

21、0.5170.627均值30.5770.6600.637极差0.0560.1430.090由预实验可知，在酶解过程中溶菌酶的浓度、作用时间及作用温度对原生质体制备及再生的影响是有相互影响的，综合考虑进行正交试验，结果见表3-6。由各因素均值分析可知：菌株P310-1破壁及再生最佳组合条件为A2B3C3，即最佳条件配比为：酶解37、作用时间3.50 h、加溶菌酶2.9 mg/mL，根据极差分析各因素对破壁及再生影响大小顺序依次为：溶菌酶作用温度作用时间酶浓度。4 讨论4.1 咪唑乙烟酸降解菌的筛选本试验采取液体富集培养方法，以长期使用长残留除草剂咪唑乙烟酸的土壤为分离源，以咪唑乙烟酸为目标菌株生

22、长的限制性底物，并逐渐提高选择压(增加咪唑乙烟酸的浓度)来诱导菌株的适应能力，经长期的液体富集培养，然后在含药的基础培养液中进行筛选，在这种选择压力的作用下，淘汰不适应的菌群，适应的生存下来，并逐渐增强了其适应能力，即可分离、纯化出可降解咪哇乙烟酸的高效菌株。制备土壤浸出液时，直接在无机盐培养基中加入低浓度的农药，一方面利于选择，因为目标菌能利用农药作为碳源和氮源在不含外源碳源和氮源的培养基中生长，而其他菌种由于缺少能源，不能生长。另一方面，在不断更换新鲜培养基加大稀释倍数的同时，也要加大农药的浓度，使菌种逐步被分离且性状稳定。 保存菌种时，需始终维持底物（咪唑乙烟酸）含量，避免筛选获得菌株的

23、降解能力的退化。 4.2 降解菌P310-1原生质体制备及再生影响因素 本试验是设定其他条件一定的情况下试验其他条件对咪唑乙烟酸降解菌株原生质体制备及再生条件进行测定的。原生质体由于失去细胞壁，失去了保护作用，细胞对外界条件反应敏感，尤其是渗透压，所以必须调结细胞所在的环境溶液浓度，以保证原生质体的稳定。不同的微生物细胞对溶液浓度与种类的要求不同。菌体的不同生理状态，直接影响到细胞壁的结构、菌体的代谢水平及菌体的活力等。菌龄过短的菌丝经酶解破壁形成小原生质体，有的细胞器不完全，营养供给不足，再生能力也较低。菌龄长的原生质体再生率高，且再生时间远比菌龄短的原生质体再生时间短。酶中往往含有对原生质

24、体有害的酶类，随着酶量的增加，杂酶的浓度也会随之增加，当达到一定浓度时，必然会影响原生质体的活性;而且酶浓度过大，细胞脱壁太彻底，必然降低原生质体的再生率。酶解液pH值不仅影响酶的活力和底物的特性，改变溶壁效果，而且影响己脱壁原生质体的稳定。酶解过程中轻微振荡有利于原生质体的释放，能与酶充分接触菌丝体或与氧的供应有关。此外，有一些影响因素如:菌体浓度、分散程度和遗传性等。原生质体制备时的酶浓度和酶解时间对原生质体再生的影响较大。酶浓度的高低也影响原生质体的再生，因为在过高浓度的酶制备原生质体时细胞受损伤较大，失去了重新建成原来细胞所必要的因子，影响原生质体的再生。酶解时间与原生质体形成率成正比，与再生率成反比。原因是酶解时间越短，细胞壁脱壁越不完全，较易再生出细胞壁，酶解时间越长，脱壁越完全，原生质膜易被酶液破坏，再生较困难。原生质体的再生率还受菌株木身的性质、菌体预处理方式等多种因素影响。在原生质体制备和再生的过程中，应该综合考虑原生质体制备和再生的影响因素，达到较高的原生质体再生率和最佳的原生质体制备条件的统一。5 结论1、 本试验结合三种驯化方法，从长年生产咪唑乙烟酸的农药厂排污口的污泥及废水中分离得到1株能以咪唑乙烟酸