EST文库构建原理和应用

1、EST文库构建原理和应用文库构建原理和应用目录：目录：1. EST概述概述2. EST序列原理序列原理3. EST产生原因产生原因4. EST的应用的应用5. 展望展望EST概述： 表达序列表达序列标签标签（expressed sequence tags,ESTs）是指从不同组织来源的）是指从不同组织来源的cDNA序列，指的是一组序列，指的是一组cDNA的部分序列的部分序列,一般一般长度为长度为150500bp,是由大规模随机挑取的是由大规模随机挑取的cDNA克隆测序得到的组织或细胞基因组的克隆测序得到的组织或细胞基因组的表达序列标签。表达序列标签。一个一个EST代表生物某一时代表生物某一时期

2、的某种组织或细胞的一个期的某种组织或细胞的一个表达表达基因基因。注：注：cDNA 为具有与某为具有与某RNA链呈互补的链呈互补的碱基碱基序列的序列的单单链链DNA即即complementary DNA之缩写，之缩写，或此或此DNA链与具有与之互补的碱基序列的链与具有与之互补的碱基序列的DNA链所形成的链所形成的DNA双链。双链。 原理原理 ESTs（Expressed Sequence tags ） 是从已建好的是从已建好的cDNA库中随机取出一个克隆，从库中随机取出一个克隆，从5末端或末端或3 末端对插入的末端对插入的cDNA片段进行一轮单向自动测序，所获得片段进行一轮单向自动测序，所获得

3、的约的约150500bp的一段的一段cDNA序列。序列。EST产生的原因：产生的原因： 1990年人类基因组计划年人类基因组计划 (HGP)及其它模式生物的及其它模式生物的基因组计划实施以来基因组计划实施以来 ，人们对生物体生命现象的，人们对生物体生命现象的研究已不仅仅局限于局部某个或几个基研究已不仅仅局限于局部某个或几个基 因，而是因，而是把目光投向整个基因组把目光投向整个基因组 ，从整体水平去考虑基因，从整体水平去考虑基因的存在的存在 ，结构与功能，以及基因之，结构与功能，以及基因之 间的相互关间的相互关系等系等.而如何而如何快速、高效地从基因组中获取生物学快速、高效地从基因组中获取生物学

4、信息信息，已成为一个急迫而富有挑战性的课题摆在，已成为一个急迫而富有挑战性的课题摆在我们面前我们面前 。 EST技术就是基于这种认识而发展起技术就是基于这种认识而发展起来来 的，并成为基因组学研究的一个强有力的工具。的，并成为基因组学研究的一个强有力的工具。 表达序列标签表达序列标签（expressed sequence tags,ESTs）EST的制备程序的制备程序 某特异组织某特异组织总总RNA的提取的提取Poly（A）+mRNAcDNA两两端加接头端加接头与与zap载体连接、包载体连接、包装、裂解装、裂解转染转染E.coli的的XLIBlue细胞，进行细胞，进行in vivo excis

5、ion用含有用含有xgal和和IPTG的氨苄平板筛的氨苄平板筛选选随机挑取白色菌落随机挑取白色菌落提取质粒提取质粒M13活活T7通用引物测序。通用引物测序。 EST技术流程技术流程应用应用 EST作为作为表达基因所在区域的分子标签表达基因所在区域的分子标签因因编码编码DNA 序列序列高度保守高度保守而具有而具有自身的特殊自身的特殊性质性质，与来自非表达序列的标记（如，与来自非表达序列的标记（如AFLP、RAPD、SSR 等）等） 相比更可能穿越家系与相比更可能穿越家系与种的限制，因此种的限制，因此EST标记在亲缘关系较远标记在亲缘关系较远的物种间比较基因组连锁图和比较质量性的物种间比较基因组连

6、锁图和比较质量性状信息是特别有用。同样，对于一个状信息是特别有用。同样，对于一个DNA 序列缺乏的目标物种，来源于其他物种的序列缺乏的目标物种，来源于其他物种的EST也能用于该物种有益基因的遗传作图，也能用于该物种有益基因的遗传作图，加速物种间相关信息的迅速转化。加速物种间相关信息的迅速转化。 应用应用 构建基因组的遗传图谱与物理图谱构建基因组的遗传图谱与物理图谱(作为作为分子标记分子标记)；作为探针用于放射性杂交；作为探针用于放射性杂交； 用于定位克隆；用于定位克隆； (“电子电子”基因克隆基因克隆) 借以寻找新的基因；借以寻找新的基因； 用于研究基因的功能；用于研究基因的功能； 促进基因芯

7、片的发展促进基因芯片的发展;用于研究生物群体多态性；用于研究生物群体多态性；有助于药物的开发、品种的改良；有助于药物的开发、品种的改良； 构建基因组的遗传图谱与物理图谱构建基因组的遗传图谱与物理图谱(作为分子标记作为分子标记)； ESTs在多种以基因为基础的人和植物基因组物理图谱构在多种以基因为基础的人和植物基因组物理图谱构建中扮演着重要角色。建中扮演着重要角色。在这一应用中，从在这一应用中，从ESTs发展起来发展起来的的PCR或杂交分析可用来识别或杂交分析可用来识别YACs、BACs或其他含有或其他含有大片段插入克隆类型的载体，它们是大片段插入克隆类型的载体，它们是构建基因组物理图谱构建基因

8、组物理图谱的基础的基础，将，将EST与基因组物理图谱相比较即可辨认出含有与基因组物理图谱相比较即可辨认出含有剩余基因序列的基因组区间，包括调控基因表达的剩余基因序列的基因组区间，包括调控基因表达的DNA控控制元件，对这些元件进行分析就有可能获得对基因功能的制元件，对这些元件进行分析就有可能获得对基因功能的详细了解。物理图谱与遗传图谱间的相互参考，形成一个详细了解。物理图谱与遗传图谱间的相互参考，形成一个用途更广泛的综合资源，获得这张综合图谱后，研究人员用途更广泛的综合资源，获得这张综合图谱后，研究人员就可以孟德尔遗传特征为基础，将相关基因定位在基因组就可以孟德尔遗传特征为基础，将相关基因定位在

9、基因组区间上，并且通过查询以区间上，并且通过查询以ESTs为基础的苈图谱，即可获为基础的苈图谱，即可获得这一区间上所有基因的名单。该综合资源用途的大小取得这一区间上所有基因的名单。该综合资源用途的大小取决于决于EST数据库中拥有的基因数目。目前人和小鼠数据库中拥有的基因数目。目前人和小鼠EST的的不断扩充使其应用更加广泛和便捷。不断扩充使其应用更加广泛和便捷。 日本血吸虫（中国大陆株）表达基因的分离和序日本血吸虫（中国大陆株）表达基因的分离和序列测定列测定1事例：事例：材料材料 日本血吸虫（中国大陆株）成虫日本血吸虫（中国大陆株）成虫cDNA文库由南京医科大学陈淑文库由南京医科大学陈淑贞教授构

10、建。该文库系采用定向贞教授构建。该文库系采用定向克隆构建于克隆构建于 gt 11/1090系统中，系统中，所构建的基因表达文库容量为所构建的基因表达文库容量为3.13106重重设计并合成引物设计并合成引物单个重组噬菌体的随机挑选单个重组噬菌体的随机挑选重组克隆重组克隆PCR直接序列分析直接序列分析ESTs的同源性分析的同源性分析方法：结果：结果：重组克隆的分离及重组克隆的分离及P C R鉴定鉴定事例：事例： 杨梅果实杨梅果实EST文库构建文库构建2杨梅杨梅cDNA克隆测序图克隆测序图 作为作为探针探针用于用于放射放射性杂性杂交；交； 用于定位克隆；用于定位克隆； 序列后得到相应克隆的序列后得到

11、相应克隆的EST(31) ESTs与与“电子电子”基因克隆；基因克隆； 利用计算机来协助克隆基因，称为利用计算机来协助克隆基因，称为“电子电子”基因克隆（基因克隆（sillcon cloning），是与定位），是与定位克隆、定位候选克隆策略并列的方法之一，克隆、定位候选克隆策略并列的方法之一，即采用生物信息学的方法延伸即采用生物信息学的方法延伸EST序列，序列，以获得基因部分乃至全长的以获得基因部分乃至全长的cDNA序列。序列。EST数据库的迅速扩张，已经并将继续导数据库的迅速扩张，已经并将继续导致识别与克隆新基因策略发生革命性变化。致识别与克隆新基因策略发生革命性变化。 (4) 借以寻找新的基因；借以寻找新的基因；(5) 用于研究基因的功能；用于研究基因的功能；衰老叶片组织的衰老叶片组织的EST序列分析序列分析 (6) 促进基因芯片的发展促进基因芯片的发展 (7) 用于研究生物群体多态性；用于研究生物群体多态性； (8) 有助于药物的开发、品种的有助于药物的开发、品种的改良；改良； 人类基因组计划已进入后基因组时人类基因组计划已进入后基因组时代，基因组学的研究从结构基因组代，基因组学的研究从结构基因组学过渡到功能基因组学，利用结构学过渡到功能基因组学，利用结构基因组学的同存数据，充分发挥基因组学的