一株银杏内生真菌的鉴定及其活性代谢产物研究(修改稿)

1、一株银杏内生真菌的鉴定及其活性代谢产物研究王国平2，3#，王丽薇1，3#，张亚磊3，4，王佳莹2，3，徐旭辉5，章初龙2.3收原稿日期基金项目：公益性行业（农业）科研专项（）；杭州市创业种子基金（20102431K156）作者简介：对本文有同等贡献，王国平（1974-），男，本科，工程师，Tel: ；E-mail： ；王丽薇（1976-），女，博士，讲师，E-mail：。通迅作者：章初龙，男，博士，副教授，Tel: ; E-mail：fungi（1.杭州师范大学医药卫生管理学院，杭州 310036；2.浙江大化浙大生物药物研发中心，杭州 310029；3.浙江大学生物技术研究所，杭州 3100

2、29；4.浙江工业大学药学院，杭州 310029；5. 浙江大学农药与环境毒理研究所，杭州 310029）摘要：药用植物内生真菌是一类重要的微生物资源，能代谢产生多种生物活性物质，本研究从浙江天目山自然保护区银杏Ginkgo biloba中分离获得1株活性菌株。通过形态学和ITS rDNA序列分析，鉴定该菌株为团青霉Penicillium commune。发酵粗提物采用正相硅胶柱层析和Sephadex LH-20凝胶柱层析，以紫外光或碘蒸汽显迹，配合活性追踪。从菌株TMSF169发酵液中分离获得1个具抗真菌及除草活性的化合物TMSF169A，通过质谱和核磁共振波谱等技术将其结构鉴定为圆弧菌醛酸

3、（cyclopaldic acid）。活性测试表明，该化合物具有抗菌活性，对鸭跖草（Commelina suffruticosa），反枝苋（Amaranthus retroflexus），马唐（Digitaria sanguinalis）、空心莲子草（Alligator Alternanthera）、水稻（Oriza sativa L.）等植物均具有致病毒性，对芝麻（Sesamum indicum）和大豆（Glycine max）不敏感，该菌株具有较好的开发应用价值。关键词：内生真菌；团青霉；活性代谢产物；除草活性；圆弧菌醛酸中图分类号：S482.292，O658.1，O657.2 文献标识码

4、：AIdentification of an endophytic fungus of Ginkgo biloba TMSF169 and its antifungal metabolites Wang Guoping 2，3#, Wang Liwei 1，3#,Zhang YaLei3,4 , Wang JiaYing 2,3, Xu Xuhui5, Zhang Chulong 1,2*1. College of Medicine and Public Health Management, Hangzhou Normal University, Hangzhou 310036; 2. Zhe

5、jiang Dahua Zhejiang University Biomedicament R&D Center, Hangzhou 311616; 3. Institute of Biotechnology, Zhejiang University, Hangzhou 310029；4. College of Pharmaceutical science, Zhejiang University of Technology,Hangzhou 310029; 5. Institute of Pesticide and Environmental Toxicology, Zhejiang

6、 University, Hangzhou 310029, ChinaAbstract: Endophytic fungi in medicinal plants are important sources of microorganisms, which produce a variety of bioactive compounds. In this study, an endophytic fungus TMSF169 with antifungal activity was isolated from Ginkgo biloba in Tianmushan Nature Reserve

7、, Zhejiang. Strain TMSF169 was identified as Penicillium commune based on the morphology and ITS rDNA sequence analysis. Antifungal and herbicidal compounds were isolated from the fermentation broth of TMSF169 through normal-phase silica gel column chromatogra

8、phy and gel (Sephadex LH-20) column chromatography, traced by ultraviolet light or iodine vapor with bioassay-guided fractionation. TMSF169A one of these isolated compounds was elucidated as cyclopaldic acid based on mass spectrometry and n

9、uclear magnetic resonance spectroscopy. Antifungal activity assays showed that the compound had inhibitory to a series of plant pathogenic fungi. It was also showed that the metabolites of strain TMSF0169 have weeding activities to several plants of dicotyledon and monocotyledons，such

10、 as Commelina suffruticosa , Digitaria sanguinalis , Amaranthus retroflexus , Alligator Alternanthera and Oriza sativa L. In a word, TMSF0169 is deserved to develop further.Key words: endophytic fungus; Penicillium commune; active metabolite; herbicide activity; cyclopaldic acid化学除草剂具有迅速高效的特点，近半个世纪来

11、其获得了极大发展。由于长期施用，造成许多耐药性杂草种群和抗除草剂杂草的出现，同时也造成土地和水源污染，残留药剂通过食物链循环已严重威胁人类健康安全，因此人们开始研究利用生物及其代谢产物来防除杂草。生物源天然化合物具有化学合成药剂所无法比拟的优点，许多天然化合物得到开发应用，从鱼藤属豆科植物提取杀虫药物鱼藤酮1，以桉树提取物桉树脑为前体合成除草剂环庚草醚2，以桃金娘科红千层中分离的植物毒素纤精酮为前体合成除草剂Triketones3。微生物具有多种多样的生物学功能，其代谢产物也具有化学多样性和功能多样性，从微生物中极有可能捕捉到独特性能新型活性物质。张金林等4从葱叶枯病菌Stemphylium

12、botryosum中分离获得匍柄霉素、和对禾本科杂草马唐的防效与百草枯相当；姜述君等5从马唐生防菌画眉草弯孢霉QZ-200中分离获得大豆和棉花苗后除草剂长孺孢素，小藜、马唐和日本看麦娘等对该毒素敏感；张金林等6从葱紫斑病菌发酵液中分离获得对稗草具有活性的毒素。团青霉Penicillium commune主要生长在腌肉和乳制品中，其可代谢产生霉菌毒素环匹阿尼酸7,神经毒素Penitrem A和Roquefortine8及麦角碱类化合物fumigaclavines A和B9，但至今未报道团青霉能代谢产生圆弧菌醛酸。圆弧菌醛酸为真菌源植物毒素，具有抗菌活性10，其主要来源于Aspergillus D

13、uricaulis, Aspergillus Puniceus, Aspergillus Quadricinctus, Aspergillus Ustus11，Penicillium aurantiogriseum，Penicillium Viridicatum 12-13等植物病原菌。植物内生真菌是真菌的一个重要类群，据Dreyfuss和Chapel估计内生真菌总数达100万种，而现在只有少数几种被开发利用，植物内生真菌资源还远远未被充分发掘。植物内生菌具有多种多样的生态学功能14，生物多样性也意味着其化学多样性 15，“内共生理论”认为内生真菌与寄主协同进化，导致内生菌具有与宿主相同代谢途

14、径16，因此越来越多的学者开始注重对药用植物内生真菌的开发利用。笔者多年来从事植物内生真菌及其活性化合物的研究，从浙江天目山自然保护区银杏中分离获得1株活性菌株，根据形态学和分子生物学手段确定该菌株为团青霉。从其发酵液中分离获得1个化合物TMSF169A，并进行系统的抗菌活性和除草活性测试。1 材料与方法1.1 供试菌株、试剂、仪器和培养基菌株TMSF0169分离至天目山自然保护区银杏叶片，参照文献17-19对菌株进行分类鉴定。供试病原菌：链格孢（Alternaria alternata）、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、圆形炭疽菌（Colletotrichum orbicula

15、re）、尖孢镰刀菌黄瓜专化型（Fusarium oxysporum f.sp. cucumerinum）、柿盘多毛孢（Pestalotia diospyri）、终极腐霉（Pythium ultimum）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、齐整小菌核（Sclerotium rolfsi）、核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）、大丽轮枝菌（Verticillium dahliae）、褐孢霉（Fulvia fulva）和稻瘟菌（Magnaporthe oryzae），由浙江大学生物技术研究所林福呈教授提供。柱层析硅胶（200300目）购自青岛海洋化工厂；柱层析

16、凝胶（Sephadex LH-20）购自Amersham Pharmacia公司；色谱纯乙腈，美国Honeywell Burdick & Jackson；其它所用试剂均为国产分析纯。高效液相色谱仪（Waters 1525二元高压梯度泵、Waters 2487检测器、Breeze工作站），美国waters；3K-30高速台式离心机，德国Sigma；RE-6000A旋转蒸发器，上海亚荣；直径4cm、长50cm的玻璃层析柱；Llash EA 1112型元素分析仪，Thermo Finnigan公司制造；SPECORD 200紫外分光光度计，德国耶拿（蔡司）；X-4型显微熔点测定仪，北京泰克；

17、Frs-135型红外光谱仪，美国Bio-Rad；LCQ-Advantage型质谱仪，美国Finnigan；DRX-500型核磁共振仪，德国Bruker。马铃薯葡萄糖琼脂（potato dextrose agar，PDA）；马铃薯葡萄糖液体培养基（potato dextrose，PDB）；查氏发酵培养基（1L）：蔗糖30g，NaNO3 3g，MgSO4.7H2O 0.5g，KCl 0.5g ，FeSO4.7H2O 0.01g，K2HPO4 1g，pH 7.2；查氏发酵培养基+玉米面（1L）：玉米面20g，蔗糖30g，NaNO3 3g，MgSO4.7H2O 0.5g，KCl 0.5g ，FeSO4

18、.7H2O 0.01g，K2HPO4 1g，pH 7.2；1.2 菌株TMSF169发酵培养特性用接种环挑取少量石蜡油中保存的菌株TMSF169，涂布在PDA培养上，于25条件下避光培养活化。7-10d后往培养好的菌落平板中加入10mL无菌水冲洗孢子，3层擦镜纸过滤后，用无菌水调节孢子浓度为107-108个孢子×mL-1，以5%的比例接入PDB中（400 mL/1000 mL装液量），180r×min-1，25条件下避光培养3d作为种子液。将种子液以5%的比例接入3种发酵培养基中（PDB，查氏发酵培养基和查氏发酵培养基+玉米面），分静止和摇床两种培养方式，摇床转速为180

19、r×min-1，均在25条件下避光培养，定期取样品分析目的活性化合物浓度。1.3发酵液中活性组分提取分别将500 mL发酵液与500 mL石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇分3次进行萃取，收集萃取相（有机相）和萃余相（水相）。萃余相在80/-0.08 Mpa的条件下进行蒸发，回收萃取剂后定容至500 mL，经0.22 µm微孔滤膜过滤，用高效液相色谱仪萃余相中活性目标化合物的残留量进行分析。分析条件：色谱柱为C18柱（sunfire C18 5µm 4.6×250mm），流动相为乙腈:水（V/V）=3:2，流速1.0 mL×min-，检测波长为24

20、5 nm。1.4活性次生代谢产物纯化将乙酸乙酯粗提物溶解于甲醇，过滤拌入柱层析硅胶，挥干溶剂后装柱，以不同梯度石油醚/乙酸乙酯（7/3-3/7）的混合溶剂为流动相洗脱。收集各部位洗脱液，采用高效薄层层析色谱（TLC）追踪斑点，石油醚/乙酸乙酯最优化展开剂系统进行分离，以紫外光照射或碘蒸汽显迹，配合滤纸片扩散法进行抑菌活性追踪测定，将斑点位置相同并有抑菌活性的样品进行合并。活性部位反复通过正相硅胶柱和柱层析凝胶纯化，然后将样品在乙酸乙酯中进行重结晶。1.5 活性产物抑菌活性的测定1.5.1 菌丝生长速率法:用无菌水将供试样品稀释后加入到PDA中，混匀后倒入直径60mm的培养皿中制成有毒平板。每个

21、梯度3个重复，并以无菌水为空白（CK）对照。将活化的供试病原菌菌饼（直径5mm）接种至有毒平板中央，25培养至对照皿即将长满时，用十字交叉法测量各处理皿的菌落直径。用下式计算抑制率：抑制率（%）=利用DPS统计软件，采用剂量对数-抑菌率机值法计算求得半抑制稀释倍数（ID50）或半抑制浓度（IC50）及毒力回归方程。1.5.2 滤纸片扩散法:将活化后的指示菌菌饼（直径5mm）接种至PDA平板上进行初步培养，待菌落生长至直径20 mm时备用。取5L各组分样品的甲醇溶液置于滤纸圆片（5mm）上，略微风干后，置于上述供试PDA平板菌落边缘。以甲醇溶液作空白对照，各处理3个重复，25培养23d后测量抑菌

22、圈直径。1.6 活性产物对水稻根系生长的抑制作用水稻种子剥去外壳，用自来水中冲洗2-3h，再用0.1%的高锰酸钾水溶液消毒60min，用无菌水冲洗直到洗出的水无色为止，然后将处理后的种子置于培养皿中（下垫滤纸片保湿），在28人工气候箱中培养48h（L12：D12，RH 70%-75%），挑选生长良好且根长一致的水稻苗，移入另一含药培养皿中（药品终浓度为50、100和200g/mL，90mm培养皿中加入10mL药品溶液，每皿10株苗），在28的人工气候箱中培养96h（L12：D12，RH70%-75%），然后测量根茎长度。1.7活性产物对植物的致病性致病性测试采用针刺接种法，分别选取鸭跖草、反枝

23、苋、马唐、空心莲子草、水稻、大豆和芝麻的幼苗，选取相似部位叶片用自来水冲洗，再用75%表面消毒，无菌水冲洗后置于培养皿中（下垫滤纸片保湿）。在叶片中脉两侧先刺伤口，然后在伤口处滴加100L不同浓度的测试药品溶液和无菌水对照，28的人工气候箱中培养（L12：D12，RH70%-75%），待毒素液滴被叶片自然吸收48h后，测量叶片坏死面积，每处理3次重复。2 结果与分析2.1 活性菌株TMSF0169的分类鉴定从浙江天目山自然保护区药用植物银杏体内分离获得18株内生真菌，其中菌株TMSF0169对灰葡萄孢、终极腐霉和圆形炭疽菌等植物病原菌具有拮抗活性。在PDA培养基中28培养5-7 d，菌落直径为

24、35-58mm，菌落紧密细绒状浅灰绿色，边边缘整齐呈灰白色，具放射状轮生，无色素分泌，菌落表面有浅黄色水珠渗出，背面乳黄色（图1-A-1）；分生孢子梗从气生菌丝垂直生出，小梗瓶状，顶端细长，轮状分枝或生于短侧枝上（图1-A-2）；分生孢子呈规则圆球形（图1-A-3）。图1 TMSF0169菌落形态及产孢结构Fig. 1 Colony Morphology and conidiogenous structure of TMSF0169. 1-A-1: 菌株TMSF0169在PDA培养基上的菌落形态 (1×); 1-A-2: TMSF0169的分子孢子梗和分生孢子形态 (1000

25、5;).1-A-1: Colony morphology of TMSF0169 on PDA (1×); 1-A-2: conidiophore and conidia morphology of TMSF0169(1000×).将序列登录GenBank（登录号JN387908），利用BLAST软件（http:/ /blast/Blast.cgi）与GenBank数据库中的序列进行比对分析，获得最相近菌株的ITS rDNA序列，用Clustal x1.8按照最大同源性的原则进行排序，采用Kimura 2计算核苷酸差异值，并用Neig

26、hbor-joining构建系统进化树，自展数为1000。根据其产孢结构、分生孢子梗着生情况、孢子形态与颜色等形态学特征，结合ITS1/ITS2的DNA序列，确定该菌株为团青霉。图2 TMSF0169与参考菌株ITS rDNA序列构建的系统进化树Fig. 2 Phylogenetic tree based on the ITS rDNA sequences of TMSF0169 and its GenBank allies.2.2发酵条件与 化合物TMSF169A的积累关系静止和摇床两种发酵方式下，菌株TMSF169在查氏发酵培养基和玉米面查氏发酵培养基中均不能产生活性化合物TMSF169A

27、；而用PDB为培养基时，静止培养活性化合物随着时间延长而积累量增加，最佳发酵时间为15-18d，发酵液中化合物TMSF169A积累浓度达68.70-69.08mg/L，但摇动培养时，活性化合物不能有效积累，最高浓度只有0.043mg/L，具体取样测试结果如表1所述。表 1. TMSF0169于25黑暗下静止和摇动培养0-21天毒素积累情况Table 1. Toxin production by TMSF169 grown as stationary and waveringly culture at 25 for 21 days in the dark (mg×L-1)天数days静

28、止培养stationary摇动培养waveringlyABCABC1-3-50.08±0.01-77.83±0.43 -911.17±1.24 -0.014±0.009-1224.35±2.58-0.024±0.011-1568.70±5.81-0.043±0.014-1869.08±7.18-0.036±0.008-2159.40±5.16 -0.017±0.012-注：A、液体土豆培养基，PDB；B、查氏培养基；C、玉米面查氏培养Note: A、potato dextro

29、se，PDB；B、Czapeks medium；C、Czapeks medium +Indian meal2.3发酵液中活性产物提取与纯化500 mL发酵液用石油醚、乙酸乙酯、水饱和正丁醇萃取分别得102mg（淡黄色浸膏）、203mg（棕褐色浸膏）、532mg（黑色浸膏）。3种溶剂均能将目的活性化合物从中发酵中萃取出来，经萃取3次后，萃余相中目的活性化合物浓度均低于2mg/L。但石油醚为萃取剂时，会形成大量的乳化层而难以有效分离；正丁醇萃取所得浸膏中其它杂质较多影响后继的分离纯化，且有机溶剂正丁醇不易回收，因此后续研究以乙酸乙酯为萃取剂。图3 发酵液乙酸乙酯萃取前后HPLC图谱Fig.3 HP

30、LC chromatography of fermentation broth after extracted with ethyl acetate取4.2g乙酸乙酯粗提物溶于甲醇，加入15g层析硅胶拌匀，挥去甲醇后备用。将600g经105活化后的柱层析硅胶（200-300目）装入玻璃层析柱中，敲打实后将样品装入，用不同梯度的石油醚/乙酸乙酯（9/1-3/7）的混合溶剂为流动相进行梯度洗脱，100 mL为一个单位收得45份洗脱液，采用高效薄层层析色谱追踪斑点，以紫外光照射或碘蒸汽显迹，配合滤纸片扩散法进行抑菌活性追踪测定。其中第16-24份所收集的洗脱液对所选的指示菌有抑制活性，且斑点位置相同

31、。将所收集的16-24份洗脱液合并后浓缩，在-0.095MPa电热真空干燥器中抽24h，得3.5g淡黄色晶体。经过硅胶粗分后，所收集的淡黄色晶体样品的杂质斑点位置与主斑点相近，硅胶柱无法很好分离，采用凝胶柱（Sephadex LH-20）再纯化。将以上所述的淡黄色晶体溶于甲醇中，过微孔滤膜（0.45m），用吸管吸取澄清样品溶液加入凝胶柱，以甲醇为流动相进行洗脱，20ml为一个单位收集洗脱液，其中第65-68份为目的化合物。合并后浓缩得白色晶体3.28g，将样品溶于热的乙酸乙酯中，在室温下重结晶。2.4活性代谢化合物鉴定乙酸乙酯发酵粗提物通过硅胶柱和葡聚糖凝胶柱层析分离纯化，重结晶后得白色晶体，

32、以石油醚/乙酸乙酯=1：1溶剂为展开剂，Rf值为0.48；熔点230.4-231.1（未校正）。化合物TMSF169A经高效液相色谱（HPLC）测试，其纯度99.0%；IR（KBr）：=3297（OH）,2907(C=C),1723(O-C=O),1654（C=O）,1620(C=C)。根据ESI-MS中准分子离子峰m/s：237M-H和元素分析结果(实测值C55.51%,H4.20%,)可以推断其分子式为C11H10O6（理论值C55.46%,H4.20%）。1H NMR（500MHz, DMSO-d6 ,ppm）: 2.09 (3H,-CH3), 4.10 (3H,-OCH3), 6.89

33、(1H, H-3), 8.41 (1H, OH-3), 10.14(1H, CHO), 12.05 (1H, OH-6); 13C NMR（500MHZ，DMSO-d6, ppm）:8.1(CH3), 62.4 (-OCH3),98.4(C-3)，109.7(C-4)，111.6(C-5)，120.3(C-7)，152.5(C-9)，161.5(C-8)，165.2(C-6)，165.5(C-1)，193（-CHO）。所有数据与文献20-21相符合，推断其为圆弧菌醛酸（Cyclopaldic acid ）(图4)。图4 化合物TMSF169A化学结构图和MS图谱Fig.4 Chemical s

34、tructure and MS spectrogram of TMSF169A2.5化合物TMSF169A抗真菌活性 从菌株TMSF169发酵液中分离纯化得到的化合物TMSF169A具有抑制真菌活性，该化合物抑菌活性谱广，对供试的12种植物病原真菌都具有不同程度的抑制作用，特别是对桃褐腐病菌和油菜菌核病菌的抑制活性较强，半抑制浓度分别为39.28mg/l和60.62mg/l。表2 代谢产物TMSF169A对不同病原真菌的抑菌活性Table 2 Inhibitory activity of metabolite TMSF169A against different pathogenic fung

35、i植物病原菌Phytopathogens回归方程Regression equation相关系数r半抑制浓度IC50/mg·L-195%置信区间95% Fiducial limit / mg·L-1链格孢Alternaria alternatay=3.907+0.399x0.9748548.67295.88-1017.42灰葡萄孢Botrytis cinereay=2.1933+1.36x0.9815115.8291.83-146.07圆形炭疽菌Colletotrichum orbicularey=0.6262+2.2051x0.9606355.94234.15-541.08

36、尖孢镰刀菌黄瓜专化型Fusarium oxysporum f.sp.melonisy=0.0375+2.1352x0.9674228.66136.91-381.90柿盘多毛孢Pestalotia diospyriy=3.0951+0.4153x0.975238652.397180.11-208075.8终极腐霉Pythium ultimumy=3.185+0.8665x0.9935124.33101.74-151.94立枯丝核菌Rhizoctonia solaniy=2.9854+0.8978x0.9526175.3580.37-382.58齐整小菌核Sclerotium rolfsiiy=3

37、.6476+0.7223x0.968374.5849.33-112.77核盘菌Sclerotinia sclerotiorumy=2.8232+1.2211x0.970260.6243.84-83.82大丽轮枝菌Verticillium dahliaey=3.4018+0.9846x0.9827216.03142.10-328.41褐孢霉Fulvia fulvay=2.7312+1.4232x0.973239.2829.35-52.57稻瘟菌Pyricularia oryzaey=4.04117+0.68475x0.9789117.6894.12-157.962.6化合物TMSF169A对水稻

38、根系生长的影响挑选长势良好，根长均为5-8mm的水稻苗植于含化合物TMSF169A的水溶液中，28下培养96h（L12：D12，RH70%-75%），测水稻苗的根茎长度。测试结果表明，不同浓度的TMSF169A均能影响根系的生长，浓度为50、100和200 ug/mL下水稻苗的根系生长抑制率分别为80.84%、86.92%和87.77%，100ug/mL和200ug/mL下对根的抑制率无显著性差别。图5 化合物TMSF169A对水稻根生长的抑制Fig.5 Effect of TMSF169A on seedling root growth of Oriza sativa L2.7 活性产物对植

39、物的致病性活性化合物TMSF0169A用针刺接种到空心莲子草、鸭跖草、反枝苋、马唐、水稻、大豆和芝麻叶片上。48h后空心莲子草、鸭跖草、反枝苋、马唐、水稻叶片接种部位很快出现水浸状褪绿斑，表明该毒素对所选的这几种植物叶片会造成伤害反应，并且在叶片上形成坏死斑面积和浓度呈正相关性（具体测试数据见表3），随着样品浓度的增加病斑面积加大；但活性化合物TMSF0169A对大豆和芝麻不敏感，针刺接种48h、60h和72h后均未见明显伤害反应。表3 代谢产物TMSF169A对不同植物的致病性Table 3 Pathogenicity of metabolite TMSF169A against diffe

40、rent plants植物样品名称Description of Plant样品浓度(mg·L-1)Sample Concentration平均病斑面积(mm2)Area of Necrotic lesion空心莲子草Alligator Alternanthera Herb00.7852±0.068505.9856±0.9261008.3406±1.43120014.0731±2.17450021.9078±3.195100028.3346±3.781鸭跖草Commelina suffruticosa B100.6531

41、77;0.024509.7634±0.43810014.1175±1.21920017.8261±2.75650024.2196±2.983100032.4984±3.745反枝苋Amaranthus retroflexus L.00.6716±0.048503.6564±0.1641005.3853±0.4132007.2606±1.06450011.3171±1.752100015.8976±2.753马唐Digitaria sanguinalis00.1963±0.04

42、2503.4405±0.7121006.3049±1.1252008.9102±1.63250012.0423±2.017100016.2275±2.964大豆Glycine max00.0707±0.021500.0707±0.0211000.0707±0.0212000.1963±0.0425000.3081±0.02810004.9063±0.219芝麻Sesamum indicum00.0079±0.002500.0079±0.0021000.0079

43、77;0.0022000.0079±0.0025000.3336±0.01410001.1343±0.176水稻Oriza sativa L.00.0079±0.002500.1963±0.0141001.5994±0.2172002.9948±0.42650013.0408±1.275100019.6407±2.8643 讨论过去半个世纪化学除草剂的大规模使用，对许多杂草进行了成功控制，但由于长期施用也带来了很多的负面效应，因此寻求更安全有效的除草制剂已成为当今除草剂发展的方向。微生物除草剂具有资源丰富

44、、环境污染小等优点，符合可持续农业的发展要求。微生物作为除草剂应用，一种是直接利用活体菌剂来控制杂草，如稗草禾长蠕孢22控制稗草，但微生物活体菌剂具有加工和使用不方便，货架期短等缺点，应用受到限制。微生物代谢产物产生的活性化合物具有结构新颖，作用靶点多和作用方式独特，选择性强及易生物降解等优点，是化学合成除草剂和微生物活体菌剂所无法比拟的。目前已有许多微生物源除草剂应用到农业生产中，如日本开发成功的除草剂双丙氨膦为链霉菌的代谢产物，细菌梨火疫病菌代谢产物Messenge，尖孢镰刀菌产生的真菌蛋白等等23-24。圆弧菌醛酸是真菌源植物毒素，为多种植物病原真菌次生代谢产物，具有抗菌活性和除草活性。

45、浓度为50ug/mL的圆弧菌醛酸水溶液对水稻根系生长抑制率达80.84%，它对双子叶植物和单子叶植物（如鸭跖草、反枝苋、马唐、空心莲子草和水稻等）均具有致病毒性，但对大豆和芝麻不敏感，浓度为1000ug/mL的水溶液处理48h、60h和72h后均未见明显伤害反应，因此可将它开发成为控制大豆和芝麻杂草的真菌源新型生物除草剂。植物致病真菌Pestalotiopsis因为代谢产生圆弧菌醛酸而引起植物组织病变坏死，团青霉TMSF169为典型植物内生真菌，其主要代谢产物为圆弧菌醛酸，但其宿主银杏叶片并没有产生病变，原因值得我们以后进行更深入研究。参考文献1 Jan N, Juraj H, Ivanka

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