分析中学生物实验中DNA提取的技巧

1、.分析中学生物实验中DNA提取的技巧在中学教材中关于“DNA的粗提取与鉴定这一实验的实际操作过程中,虽然现象明显,但存在几个问题:实验材料本钱高1,操作步骤较复杂,需要仪器较昂贵等。因此,一般中学很难开展2。针对上述问题,本实验做了部分改进分别选用新颖的菜花和蒜黄作为材料,进展比较实验,试图到达材料来源广、试剂用量少、所需仪器少、操作更简单、结果较明显、一般普通中学均能开设的目的,从而有利该实验普及推广,让更多的中学生能从植物材料中提取DNA,增加学生的感性认识,进步学生的动手才能。一、材料和方法1.材料菜花和蒜黄。2.实验方法以经典的SDS提取方法3为对照:分别称取在-20条件下保存的两种植

2、物组织10 g,在液氮的冷冻下迅速研磨成粉末。参加提取液100 mM Tris·HCl pH 8.5,100mM NaCl,50 mM EDTA pH 8.0,2%SDS20 mL,充分研磨混匀,用两层纱布过滤,用移液器分别汲取5 mL滤液于10 mL的离心管中。将离心管置于65水浴中30 min,水浴过程中温和混匀几次。取出离心管,每管参加等体积的氯仿异戊醇V/V=11溶液,混匀后,10000 rpm离心10 min。小心将上清液移入另一离心管中,不要吸入杂质,重复步骤,将上清液小心移入另一新的离心管中。参加0.6倍体积的异丙醇,轻轻混匀,静置一段时间。6000 rpm离心2 mi

3、n,倒去上清液,吹干。用70%乙醇冲洗1次,然后用6000 rpm离心2 min。吹干后参加2mL的100×TE,溶解。贴上标签于-20冰箱保存。对照上述步骤对DNA提取做表1处理。3.鉴定DNA二苯胺鉴定法4汲取各种处理的DNA溶解液0.75 mL于5mL的试管中,再参加0.75mL配好的二苯胺溶液,置于100沸水浴中10min,观察离心管中颜色的变化。二苯胺溶液中参加DNA后会变蓝,DNA所含量越多,蓝色就越深。分光光度计鉴定法汲取各种处理的DNA溶解液0.5mL于比色皿中,参加1mL的水溶液,再在另一只同样的比色皿中参加1.5mL的水溶液作空白对照,测定不同处理的DNA在260

4、nm和280nm处的吸光值5。二、实验结果与分析1.不同材料对DNA浓度的影响菜花剪成小块不易研磨,可能存在研磨不充分,提取量少等问题,这样对DNA的浓度会有一定影响。而蒜黄剪成小段后,研磨明显比菜花充分,提取量较多,但蒜黄中含有的多糖物质较多,也会影响DNA的浓度。但就操作角度来看,采用蒜黄较好。2.不同处理方法对DNA提取的影响温度、液氮、氯仿异戊醇和离心机等都是影响DNA提取的重要因素。因此本实验采用不同的处理方法来讨论DNA的提取,以到达优化实验的目的。温度对DNA提取很重要,低温能更好地保持DNA不降解,见表2。液氮可使材料研磨充分。氯仿异戊醇起到了抽提蛋白质的作用,能很好地去除所提

5、溶液中的杂质,最后提出来的DNA浓度和纯度均较好。用静置的方法代替离心机,比较符合如今许多中学的现状,即静置后小心用吸管汲取上清液转移到干净的小烧杯中,可以到达良好的提取效果。参加异丙醇沉淀DNA,沉淀效果更好,而且用量是0.6倍的上清液的体积,菜花和蒜黄的效果都比较好,总体效果比加2倍体积的无水乙醇得到的沉淀更多。3.DNA鉴定二苯胺鉴定法是中学常用的方法,此方法操作简单,现象明显。本实验中-20条件,氯仿异戊醇的处理和异丙醇沉淀的DNA含量较多,能使二苯胺溶液变得较蓝。说明DNA含量较高,通过分光光度计检测260nm/280nm为1.752.0之间,纯度较高,到达实验的要求。三、讨论提取DNA的方法有许多,常见的有CTAB法和SDS法等。但由于所用材料及中学实验条件的限制,所提取的效果不尽如人意。本实验从中学实验条件着手,就DNA的SDS经典提取方法中有几处中学实验条件达不到的步骤做了不同处理。经过反复实验,实验材料采用蒜黄和菜花,在-20条件下,采用静置的方法处理并用冷的异丙醇沉淀DNA,得到的DNA浓度和纯度都较高,已经能到达中学的要求,能较好地观察到提