实验二动物细胞培养液的配制与灭菌1

1、细胞生物学与细胞工程实验的总体安排细胞生物学与细胞工程实验的总体安排（10-18周）周） 实验一 显微镜的技术参数及特殊光镜的演示实验显微镜的技术参数及特殊光镜的演示实验 实验二实验二 动物细胞培养液的配制与灭菌动物细胞培养液的配制与灭菌 实验三实验三 动物细胞的组织块培养法动物细胞的组织块培养法 实验四 动物组织的消化及细胞冻存动物组织的消化及细胞冻存 实验五 细胞复苏及活力测定细胞复苏及活力测定 实验六实验六 细胞骨架的光镜观察细胞骨架的光镜观察 实验七实验七 小鼠骨髓细胞染色体玻片标本的制作小鼠骨髓细胞染色体玻片标本的制作 实验八实验八 细胞融合细胞融合 实验九实验九 血涂片的制备及细胞

2、大小的测量血涂片的制备及细胞大小的测量一、实验目的与要求一、实验目的与要求 了解动物了解动物细胞细胞培养对条件设施的要求；培养对条件设施的要求； 掌握动物细胞培养用液的种类及作用；掌握动物细胞培养用液的种类及作用； 学习学习各种动物细胞培养用液的配制方法及各种动物细胞培养用液的配制方法及灭菌方法。灭菌方法。二、实验原理二、实验原理 无污染环境（无毒、无菌）：无菌培养室（更衣间、缓冲无污染环境（无毒、无菌）：无菌培养室（更衣间、缓冲间、操作间）、新洁尔灭擦拭地面、超净工作台间、操作间）、新洁尔灭擦拭地面、超净工作台 温度适宜；溶解氧、温度适宜；溶解氧、pH和气体环境和气体环境 各类营养成分：糖（

3、能量）、氨基酸（合成蛋白质的原料各类营养成分：糖（能量）、氨基酸（合成蛋白质的原料）、维生素（细胞内酶的辅酶或辅基）、生长因子（激素）、维生素（细胞内酶的辅酶或辅基）、生长因子（激素类等促进细胞增殖）类等促进细胞增殖） 渗透压渗透压 附着物（贴壁生长）等附着物（贴壁生长）等1、细胞培养的基本条件：、细胞培养的基本条件：无机盐、微量元无机盐、微量元素、葡萄糖、氨素、葡萄糖、氨基酸、促生长因基酸、促生长因子等子等 温度：温度：36363737 pH : 7.27.4 95%95%空气和空气和5%CO5%CO2 2 (维持培养液维持培养液pH) 培养基中加入抗培养基中加入抗生素生素 超净台超净台2、

4、常用细胞培养用液：、常用细胞培养用液： 水水 培养基培养基：天然培养基、合成培养基、无血清培养基天然培养基、合成培养基、无血清培养基 生理盐生理盐液液：PBS 消化用液消化用液：胰蛋白酶胰蛋白酶 抗生素液抗生素液：青链霉素青链霉素3、常用的灭菌方式：、常用的灭菌方式： 紫外线消毒紫外线消毒: 紫外线是一种低能量的电磁辐射，可杀死多种微生物。紫外线的直接作用是通过破坏微生物的核酸及蛋白质等而使其灭活，间接作用是通过紫外线照射分解空气中的氧气形成臭氧杀死微生物。 蒸汽湿热灭菌法：蒸汽湿热灭菌法： 是目前最常用的一种灭菌方法。它利用高压蒸汽以及在蒸汽环境中存在的潜热作用和良好的穿透力，使菌体蛋白质凝

5、固变性而使微生物死亡。 湿热灭菌法一般采用121，灭菌20-30min。 高温干热灭菌法：高温干热灭菌法：恒温干燥箱，恒温干燥箱， 120C150C的高热。的高热。果蝇培养瓶、玻璃试剂瓶等。果蝇培养瓶、玻璃试剂瓶等。 过滤除菌：过滤除菌：是将液体或气体通过有微孔的滤膜是将液体或气体通过有微孔的滤膜过滤，使大于滤膜孔径的细菌等微生物颗粒阻留过滤，使大于滤膜孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌的方法。培养基等的灭菌。，从而达到除菌的方法。培养基等的灭菌。 化学消毒法：化学消毒法：仅限于表面的消毒。用于不能用物理方仅限于表面的消毒。用于不能用物理方法进行消毒的物品、空气、工作面、操作者皮肤以及某

6、些法进行消毒的物品、空气、工作面、操作者皮肤以及某些实验器皿等。实验器皿等。 酒精酒精 甲醛甲醛 高锰酸钾高锰酸钾 抗生素：抗生素：用于培养液，是培养过程中预防微生物污染用于培养液，是培养过程中预防微生物污染的重要手段以及作为微生物污染不严重时的的重要手段以及作为微生物污染不严重时的“急救急救”措施措施三、实验仪器与材料三、实验仪器与材料 仪器仪器：玻璃杯，玻璃棒，电子天平，量筒， PH试纸，试剂瓶等 试剂试剂：NaCl, KCl, Na2HPO412H2O，KH2PO4，HCl, NaOH，NaHCO3，DMEM， 蒸馏水，双蒸水四、实验内容四、实验内容1 1、配制、配制PBSPBS（1 1

7、）烧杯中加适量的蒸馏水或去离子水）烧杯中加适量的蒸馏水或去离子水; ;（2 2）准确称量药品，依次放入烧杯）准确称量药品，依次放入烧杯; ;（3 3）人工搅拌或磁力搅拌器搅拌使药品充分溶解）人工搅拌或磁力搅拌器搅拌使药品充分溶解; ;（4 4）调节）调节PHPH值使之约为值使之约为7.2;7.2;（5 5）定容；（）定容；（6 6）高压灭菌）高压灭菌,120,120 1515分钟；（分钟；（7 7） 分装保存分装保存。2 2、 配制配制100ml DMEM100ml DMEM培养基培养基（1 1） 烧杯中加适量的蒸馏水或去离子水烧杯中加适量的蒸馏水或去离子水; ;（2 2）准确称量药品）准确称

8、量药品DMEM 1.17gDMEM 1.17g，（3 3）准确称量药品）准确称量药品NaHCONaHCO3 3 0.37g; 0.37g;（4 4）准确称量药品谷胺酰胺）准确称量药品谷胺酰胺0.003g0.003g；（5 5）准确称量药品）准确称量药品HEPESHEPES（乙基哌嗪乙硫磺酸）（乙基哌嗪乙硫磺酸） 0.5958g, 0.5958g, 依次放入烧杯依次放入烧杯; ;加入青霉素加入青霉素100IU/ml100IU/ml、链霉素、链霉素100ug/ml.100ug/ml.（6 6）人工搅拌或磁力搅拌器搅拌使药品充分溶解）人工搅拌或磁力搅拌器搅拌使药品充分溶解; ;（7 7）调节）调节P

9、HPH值使之约为值使之约为7.2;7.2;（8 8） 定容；（定容；（9 9） 过滤灭菌；（过滤灭菌；（1010）分装保存。）分装保存。3、PBS的高压灭菌的高压灭菌高压灭菌高压灭菌锅，锅，120，15分钟分钟2013-2014-1遗传学实验14、DMEM培养基滤器灭菌培养基滤器灭菌（1）将塑料环放在上盖与下底之间，锁紧。用双层牛皮纸包好高压蒸汽灭菌。 （2）选一个适当的容器，如锥形瓶试管窄口瓶等亦高压蒸汽灭菌。 （3）将微孔滤膜用平头镊子夹住，放在微孔滤膜装置中一起高压蒸汽灭菌。 （4）将需要灭菌的实验器材溶液配置好。 （5）将无菌的微孔滤膜装置由下底口套在无菌的容器上。用塑料注射筒吸取要灭菌的溶液。 （6）注射筒口插入微孔滤膜过滤装置之上盖口。 挤压注射筒的推管，使溶液流经微孔滤膜流入无菌容器中。（7）移去微孔滤膜，将容器口通过酒精灯火焰，盖上盖子标上溶液名称及日期。 （8）拆开微孔滤膜装置，将微孔滤膜丢掉（或灭菌后丢弃），其它装置清洗干净。 本次实验的任务本次实验的任务 每组配制每组配制1LPBS 生理盐液，并包好瓶口；生理盐液，并包好瓶口； 每组仔细清洗每组仔细清洗5-6个培养皿和细胞培养瓶（个培养皿和细胞培养瓶（保证每人一个），分别一