LCMSMS测定伊曲康唑脂质体小鼠血浆中浓度

1、LC-MS/MS测定伊曲康唑脂质体小鼠血浆中浓度魏华1，刘艳1，董迪1，宋笑丹2，吴琳华1*(1. 哈尔滨医科大学附属第二医院药学部；黑龙江省高校重点实验室，哈尔滨 150086；2. 哈尔滨医科大学附属第一医院药学部，哈尔滨 150001)摘要:目的建立LC-MS/MS测定小鼠血浆中伊曲康唑浓度的方法。方法以尼莫地平为内标，采用乙腈-水-甲酸(80：20：0.2)为流动相，以Cl8色谱柱(Waters XTerra®MS-C18，2.1×150 mm, 3.5 µm)为分析柱，流速为0.2 mL . min-1，通过正离子电离(ESI)，以多反应离子监测(MRM

2、)方式进行正离子检测。用于定量分析的离子反应分别为m/z 705.3m/z 392.1(伊曲康唑)和m/z 419.3m/z 343.3(内标，尼莫地平)。结果测定血浆中伊曲康唑的线性范围为10-1280 ng . mL-1，定量下限为10.00 ng . mL-1。日内、日间精密度(RSD)小于10%，回收率大于90%。结论 本方法专属性强、灵敏度高、操作简便、适用于伊曲康唑脂质体在小鼠体内药代动力学研究。关键词:伊曲康唑；液相色谱-质谱联用法；脂质体；血浆药物浓度LC-MS/MS Determination of Itraconazole Liposome in Mice PlasmaWE

3、I Hua1, LIU Yan, DONG Di1, SONG Xiao-dan2, WU Lin-hua1* (1. Department of Pharmacy, the Second Affiliated Hospital of Harbin Medical University, Key Laboratory of College in Heilongjiang Province, Harbin 150086, China; 2. Department of Pharmacy, the First Affiliated Hospital of Harbin Medical Univer

4、sity, Harbin 150001, China)ABSTRACT: OBJECTIVE To establish a LC-MS/MS method for the determination of itraconazole in mice plasma. METHODS Nimodipine was used as the internal standard. Itraconazole was separated using a Cl8 column（Waters XTerra®MS-C18，2.1×150 mm, 3.5 µm).The mobile p

5、hase consisted of acetonitrile-water-formic acid（80:20:0.2,v/v/v）, at a flow-rate of 0.20 mL·min-1. Waters Micromass Quattro API tandem mass spectrometer equipped with electrospray ionization source (ESI) was used as detector operated in the positive ion mode. multiple reaction monitoring (MRM)

6、 with the precursor to product ion combinations of m/z 705.3m/z 392.1 and m/z 419.3m/z 343.3 were performed to quantify itraconazole and the internal standard(nimodipine), respectively. RESULTS The linear calibration curves were obtained in the concentration range of 10-1280 ng·mL-1 .The lowest

7、 limit of quantification was 10.0 ng·mL-1 . The inter-and intra-day precision（RSD）was less than 10% .The average recoveries were above 90% . CONCLUSION The method was proved to be sensitive, rapid, convenient and suitable for pharmacokinetics of itraconazole liposome in mice.KEY WORDS： itracona

8、zole; liquid chromatography-tandem mass spectrometry; liposome；plasma concentration伊曲康唑(itraconazole , ITR)是三唑类衍生物，对念珠菌属及酵母菌、霉菌、皮肤癣菌和其他治病真菌具有光谱抗真菌活性。通过干扰真菌细胞膜中麦角甾醇的合成，最终导致真菌膜的通透性变异，而产生抗真菌活性1。已上市的伊曲康唑注射液，主要用于深部真菌感染2，但是其辅料羟丙基-环糊精，是通过肾小球过滤排泄，具有肾毒性3。将伊曲康唑制成脂质体的剂型，可以更好地发挥其疏水性，减少用药剂量，提高其生物利用度，提高伊曲康唑在靶器官的浓

9、度4，从而降低心脏、肾脏毒性。本实验采用高效液相色谱-串联质谱法，测定小鼠血浆中伊曲康唑浓度，操作简便、快速、灵敏度高、专属性强，可用于伊曲康唑脂质体小鼠体内药动学研究。1 仪器与试药1.1仪器Waters2695高效液相色谱系统；Waters Micromass Quattro API 三重四极杆串联质谱仪；Mass lynx 4.0数据工作站；HH-1型旋涡混合器 (天津市富兰斯电子科贸有限公司); LD4-2型低速离心机(北京医用离心机厂)。 1.2试药 伊曲康唑对照品(中国药品生物制品检定所，含量99.3%，批号：200401)；伊曲康唑脂质体(本实验室自制)；尼莫地平(内标，中国药品

10、生物制品检定所，批号：200501)；甲酸、乙腈(色谱纯，山东禹王实业有限公司)；其它试剂均为分析纯，水为超纯水。1.3动物 昆明种小鼠，雄性，体重(20±2) (哈尔滨医科大学实验动物中心)。2 实验方法2.1 色谱条件 采用Waters Cl8色谱柱(XTerra®MS-C18，2.1×150 mm，3.5 µm)；流动相为乙腈-水-甲酸(80：20：0.2)，流速为0.2 mL . min-1，进样量为10 µL，柱温30 。2.2 质谱条件离子源为ESI源(电喷雾电离源)；电喷雾电压为3.6 kv；锥孔电压为50V；碰撞室电压为40 V

11、；脱溶剂气温度为300；脱溶剂气(N2)速为500 L·hr-1；正离子方式检测；扫描方式为多反应监测(MRM)，用于定量分析的离子反应分别为m/z 705.3m/z 392.1(伊曲康唑)和m/z 419.3m/z 343.3(内标，尼莫地平)；扫描时间为0.3 s。2.3 血浆样品处理取血浆样品100 µL，置于1.5 mL聚丙烯试管中，分别加入甲醇25 µL、内标溶液(400 ng . mL-1尼莫地平甲醇液)25 µL和乙腈400 µL，涡旋5 min，14 000 r . min-1离心15 min，分取上清液，0.45µm

12、滤膜过滤，取10 µL进行LC-MS/MS分析。2.4 质谱分析伊曲康唑和内标尼莫地平在电喷雾电离方式下，(一级)全扫描质谱主要生成M+H+ 准分子离子峰，分别为m/z 705.3和m/z 419.3。对准分子离子峰M+H+进行二级质谱分析，生成的较稳定的主要碎片离子分别为m/z 392.1和m/z 343.3，并将其作为定量分析时监测的产物离子。3 实验结果3.1 方法的专属性取空白血浆样品100 µL，置于1.5 mL聚丙烯试管中，加入乙腈400 µL，按“2.3”项下操作，进样10 µL，记录色谱图；将一定浓度的伊曲康唑标准液加入到空白血浆中，依同

13、法操作，记录色谱图；待测药物伊曲康唑的保留时间为3.93 min，内标尼莫地平的保留时间为3.41 min；取健康小鼠给药后收集的血浆样品，同法操作，记录色谱图。结果表明，空白血浆中的内源性物质不干扰伊曲康唑及内标物的测定。图1 小鼠血浆中伊曲康唑及内标尼莫地平的典型MRM色谱图A,D-空白血浆；B,E-空白血浆加入伊曲康唑及内标；C,F-受试小鼠尾静脉注射伊曲康唑脂质体6 h后血浆样品；1-伊曲康唑；2-尼莫地平(内标)Fig1 Typical chromatogram of itraconazole and the nimodipine (internal standard, IS) in

14、 mice plasma by the multiple reaction monitoring (MRM) scan modeA,D-blank plasma; B,E-blank spiked with itraconazole and internal standard; C,F- plasma sample 6 h after an iv administration itraconazole liposome and itraconazole injection in mice; 1-itraconazole; 2- nimodipine(internal standard)3.2

15、线性范围及检测灵敏度取空白血浆100 µL，依次加入伊曲康唑标准系列溶液25 µL(用甲醇配制成400g.mL-1的储备液，按一定比例稀释成标准系列溶液)配制成相当于伊曲康唑血浆浓度为10.0， 20.0，40.0，80.0，160.0，320.0，640.0，1280.0 ng . mL-1 的血浆样品)，按“2.3”项下操作，进样10 µL，记录色谱图；以待测药物浓度X(ng . mL-1)为横坐标，待测药物与内标的峰面积比Y为纵坐标，用加权(w = 1/X2)最小二乘法进行回归计算，求得的直线回归方程为：Y = 3.764×10-3 X +2.79

16、2×10-2 (r = 0.9975)。结果表明，伊曲康唑血浆浓度在10.0 1280.0 ng . mL-1内，质谱响应的线性关系良好，最低检测限为10.0 ng . mL-1。3.3 日内与日间精密度及方法回收率取空白血浆100 µL，按“3.2”项下制备伊曲康唑低、中、高3个浓度(分别为10.0，160.0，1280.0 ng . mL-1)的质量控制(QC)样品，每一浓度进行5样本分析，连续进行5 d，并与标准曲线同时测定，以当日的标准曲线计算QC样品的浓度，将QC样品的结果进行分析，求算本法的回收率与精密度，结果见表1。实验数据表明，日内、日间精密度(RSD)均小

17、于10.0%，方法回收率良好。表1 测定方法的准确度和精密度(n=5)Tab 1 Accuracy and precision (n=5)加入浓度 /ng . mL-1测得浓度/ng . mL-1RSD/%方法回收率/%日内日间 10.0 9.169.797.7591.63160.0157.683.676.2298.561280.01269.212.014.7299.163.4 稳定性考察3.4.1 冰冻稳定性 按“3.2”项下制备备伊曲康唑低、中、高3个浓度(分别为10.0，160.0，1280.0 ng . mL-1)的样品，置冰箱中分别冷冻保存15，30 d后取出化冻，按“2.3”项下操

18、作测定，并将结果与0 d结果进行比较。结果表明，伊曲康唑血浆样品在冰冻15 d及30 d条件下稳定，测定结果的RSD分别为2.73%，6.54%，7.92%。3.4.2 溶液稳定性 对伊曲康唑血浆样品经蛋白沉淀处理后，低、中、高3个浓度（10.0，160.0，1280.0 ng . mL-1）的溶液常温放置的稳定性进行考察，结果表明处理后的伊曲康唑血浆样品在常温放置4h,10h,24 h稳定，测定结果的RSD分别为5.35%，3.72%，8.17%。3.5 分析方法在药代动力学研究中的应用昆明种雄性小鼠36只，随机分为6组，每组6只。设10 min，30 min，2 h，4 h，8 h，12

19、h，6个时间点，每个时间点含伊曲康唑脂质体和注射液各1组，按10 mg · kg-1的剂量小鼠尾静脉注射给药，给药后于不同时间点眼眶取血，全血置肝素化离心管中，3000 r · min-1离心10 min得血浆，-20 低温保存备用。按“2.3”项下方法操作，进行LC-MS/MS测定，记录色谱图。以当日的标准曲线计算个时间点的血药浓度，同时制备高、中、低3个浓度的质控血浆（同“3.2”项），每个浓度各三份，测得药时曲线见图2。 图2 36只小鼠10 mg · kg-1尾静脉注射伊曲康唑脂质体后的血药浓度参比制剂； 受试制剂Fig 2 Plasma concentr

20、ation-time curve of 36 mice after an iv administration itraconazole liposome reference formulation; test formulation4 讨论4.1 生物样品常用的预处理方法有固相萃取法（SPE），液-液萃取法（LLE）等。固相萃取、液-液萃取法成本高、使用溶剂量大、提取步骤复杂、费时。药物代谢动力学研究本身样品数多，样品分析的时间越短越好。本实验采用乙腈沉蛋白的方法处理生物样品，操作简便，与所选用流动相一致，提取回收率高，精密度好，且成本较低。本实验还分别考察了200 µL乙腈 、40

21、0 µL乙腈、600 µL乙腈沉蛋白效果，结果发现加入200 µL乙腈时蛋白沉淀不完全，加入400 µL 和600 µL乙腈时蛋白沉淀效果一样，但是加入600 µL乙腈沉蛋白时样品被稀释的倍数太大。本实验最终选择400 µL乙腈沉时沉，沉淀蛋白效果好，提取回收率高，而且峰形较好。4.2 文献报道5-9测定生物样品中伊曲康唑大多用高效液相色谱-荧光检测法或紫外检测法，但测试时间长，而且由于生物样品内源性物质的干扰，均需通过液-液或液-固萃取、浓缩，样品预处理繁琐。本实验应用LC-MS/MS法，通过优化条件，选用分离度高的Cl8

22、短柱（2.1×150 mm, 3.5 µm），样品只需要100 µL，并以专属性更好的二级MS检测样品，分析时间短，每一样品只需要4.5 min。生物样品预处理采用直接沉淀蛋白法，上清不需要浓缩，节省了样品预处理时间。4.3 由于采用正离子检测、沉淀蛋白法处理样品，因此在流动相中加入了少量甲酸，减少由于蛋白带来的电离抑制，从而提高了灵敏度，结果良好。4.4 该法灵敏度高，专属性强，具有良好精密度和准确度，分析时间短，所需样品用量少，适合于伊曲康唑体脂质体小鼠体内药代动力学研究。REFERENCES1 Karel DB, Jef VG. Pharmacology o

23、f itraconazoleJ. Drugs, 2001, 61(Suppl 1):S27 - S37.2 CAI Yong-ning, Liang de-rong.Efficacy and safety of itraconazole injection in treatmeat of deep fungal infecfionsJ. Chinese Journal of New Drugs (中国新药杂志), 2004，13（2）：161-163.3 Walsh PM.Physicians desk referenceM.57ed.Montvale NJ:Thomson PDR, 2003.1794- 17974 DONG D, LIU H M, SONG X D. Chin J Pharm Anal(药物分析杂志), 2007, 27 (9) :1453-1455.5 CHEN L J. Determination of itraconazole in human plasma by HPLC J. West China J Pharm Sci(华西药学杂志),2006,21