杏鲍菇多糖分离纯化及纯度鉴定-张丽霞2015

1、杏鲍菇多糖的分离、纯化及纯度鉴定杏鲍菇多糖的分离、纯化及纯度鉴定 主讲人：张丽霞主讲人：张丽霞 教务处教务处 2016.3.4生物技术综合大实验之三生物技术综合大实验之三内容提要内容提要一、多糖纯化的目的与意义一、多糖纯化的目的与意义二、材料与设备二、材料与设备三、实验方法步骤三、实验方法步骤四、实验考核四、实验考核一、多糖纯化的目的与意义一、多糖纯化的目的与意义 多糖纯化实质：多糖纯化实质：将粗多糖中的杂质（将粗多糖中的杂质（蛋白质、色素、蛋白质、色素、低低聚糖、无机盐）除去而获得聚糖、无机盐）除去而获得分子量分子量和和极性均一极性均一的多糖组分。的多糖组分。 多糖纯品实质：多糖纯品实质：一

2、定分子量范围内的一定分子量范围内的均一组分均一组分。 多糖的纯度多糖的纯度是研究平菇多糖化学结构与生物活性的基础。是研究平菇多糖化学结构与生物活性的基础。 本实验首先采用本实验首先采用三氯乙酸法三氯乙酸法对提取的平菇粗多糖进行对提取的平菇粗多糖进行脱蛋白脱蛋白，然，然后利用后利用过氧化氢过氧化氢对其对其脱色素脱色素；再根据多；再根据多糖所带电荷性质糖所带电荷性质及及分子量的不分子量的不同同，采用，采用DEAE- -纤维素纤维素和和Sepharose CL-6B凝胶柱层析相结合的方法，凝胶柱层析相结合的方法，对平菇多糖进行对平菇多糖进行分级纯化分级纯化，采用，采用旋光法旋光法对得到的级分进行对得

3、到的级分进行纯度鉴定纯度鉴定，为后续研究平菇多糖的结构特征和生物活性奠定基础。为后续研究平菇多糖的结构特征和生物活性奠定基础。以最简单的技术，以最简单的技术， 最少的步骤，最少的步骤， 最高的收率，最高的收率， 最低的成本，最低的成本， 获得纯度样品获得纯度样品。多糖纯化的目的多糖纯化的目的二、材料与设备二、材料与设备 1.1.材料：材料：已提取的已提取的杏鲍菇粗多糖杏鲍菇粗多糖，常规干燥，备用。，常规干燥，备用。 2.2.设备：设备： 低速离心机低速离心机 、旋转蒸发仪、旋转蒸发仪 、自动数显旋光仪、电热恒、自动数显旋光仪、电热恒温水浴锅温水浴锅 、兰格蠕动泵、自动部分收集器、梯度混合器、兰

4、格蠕动泵、自动部分收集器、梯度混合器、磁力搅拌器磁力搅拌器 、电子天平、电子天平 、电热恒温鼓风干燥箱、电热恒温鼓风干燥箱 、紫外可、紫外可见分光光度计见分光光度计 、干燥器。、干燥器。3.3.试剂试剂 三氯乙酸、三氯乙酸、30%过氧化氢、葡萄糖、苯酚、浓硫酸、过氧化氢、葡萄糖、苯酚、浓硫酸、DEAE - 纤维素、纤维素、Sepharose CL-6B、氯化钠、氢氧化钠、氯化钠、氢氧化钠、无水乙醇、无水乙醇、95%乙醇。乙醇。三、实验方法步骤三、实验方法步骤 1.1.杏鲍菇多糖的分离纯化流程杏鲍菇多糖的分离纯化流程 杏鲍菇粗多糖杏鲍菇粗多糖脱蛋白脱蛋白脱色素脱色素透析透析浓缩浓缩冷冻干冷冻干燥

5、得水溶多糖精品燥得水溶多糖精品DEAE-纤维素收集中性多糖组分纤维素收集中性多糖组分Sephade G-100柱层析收集最大组分柱层析收集最大组分透析透析浓缩浓缩醇沉过醇沉过夜夜离心离心沉淀经无水乙醇、乙醚洗涤沉淀经无水乙醇、乙醚洗涤常规常规干燥干燥纯度鉴纯度鉴定定纯多糖。纯多糖。2.2.脱蛋白脱蛋白 由于粗多糖中含有一定量由于粗多糖中含有一定量游离的游离的和和结合的结合的蛋白，为保蛋白，为保证多糖的纯度，必须将证多糖的纯度，必须将蛋白质蛋白质脱去。常用的脱蛋白方法有脱去。常用的脱蛋白方法有Sevag法、法、三氯乙酸法三氯乙酸法和蛋白酶法（链蛋白酶、胰蛋白酶、和蛋白酶法（链蛋白酶、胰蛋白酶、木

6、瓜蛋白酶）等。木瓜蛋白酶）等。 三氯乙酸法脱蛋白三氯乙酸法脱蛋白 将粗多糖配成将粗多糖配成5%的糖液，加入的糖液，加入30%三氯乙酸三氯乙酸溶液，溶液，使三氯乙酸终浓度为使三氯乙酸终浓度为15%，在，在4冰箱中放置过夜；离心，冰箱中放置过夜；离心，弃去沉淀，得无蛋白的多糖溶液，再用弃去沉淀，得无蛋白的多糖溶液，再用1 mol/L NaOH溶溶液中和至液中和至PH为为7。3.3.脱色脱色 过氧化氢法脱色素过氧化氢法脱色素 将脱蛋白后的多糖溶液，用将脱蛋白后的多糖溶液，用浓氨水浓氨水调至调至pH为为8.0，逐滴，逐滴滴加滴加20%H2O2至溶液为至溶液为浅黄色浅黄色，50水浴，保温水浴，保温2 h

7、后过滤。后过滤。 4. 4.透析脱盐透析脱盐 将脱蛋白、脱色后多糖配成将脱蛋白、脱色后多糖配成5%溶液，置于溶液，置于透析袋透析袋中，中，先用自来水先用自来水逆向流水透析逆向流水透析72 h后，再用后，再用蒸馏水透析蒸馏水透析24 h，每每4 h换水一次。换水一次。5.5.干燥干燥 将脱蛋白、脱色、脱盐后的杏鲍菇多糖溶液，水浴将脱蛋白、脱色、脱盐后的杏鲍菇多糖溶液，水浴80浓缩至浓缩至10 mL, 加加三倍体积的无水乙醇三倍体积的无水乙醇过夜，离心取过夜，离心取沉淀，经无水乙醇、乙醚洗涤后，常规干燥得平菇去蛋白沉淀，经无水乙醇、乙醚洗涤后，常规干燥得平菇去蛋白除色素多糖。除色素多糖。6. 6.

8、 多糖含量测定多糖含量测定 采用采用苯酚苯酚-硫酸法硫酸法测定样品中的多糖含量。测定样品中的多糖含量。 （1）测定原理为）测定原理为：游离的寡糖、多糖中的己糖或糖醛酸在浓硫：游离的寡糖、多糖中的己糖或糖醛酸在浓硫酸的作用下，酸的作用下，脱水生成糠醛脱水生成糠醛，再与，再与苯酚苯酚作用起作用起显色反应显色反应，在一定范围在一定范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，吸收值与糖含量呈线性关系。内其颜色深浅与糖的含量成正比，吸收值与糖含量呈线性关系。且己且己糖在糖在490 nm处（戊糖及糖醛酸在处（戊糖及糖醛酸在480 nm）有最大吸收，故用）有最大吸收，故用比色法比色法测测定多糖含量。该法简单，快速，灵

9、敏，对每种糖仅需制作一条标准曲定多糖含量。该法简单，快速，灵敏，对每种糖仅需制作一条标准曲线，且颜色持久。线，且颜色持久。 （2）标准曲线的制作：）标准曲线的制作：准确称取准确称取105干燥恒重的干燥恒重的标准葡萄糖标准葡萄糖50 mg定容于定容于500 mL容量瓶中，加水至刻度，用移液管分别吸容量瓶中，加水至刻度，用移液管分别吸取取0、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL转入试管中，转入试管中，各以各以蒸馏水蒸馏水补至补至1.0 mL，每个浓度，每个浓度重复三个平行重复三个平行。然后分别。然后分别向每支试管中加入向每支试管中加入6%苯酚试剂苯酚试剂0.5 mL

10、及浓硫酸及浓硫酸2.5 mL，摇匀，摇匀，沸水浴中煮沸沸水浴中煮沸10 min，冷却至室温，放置，冷却至室温，放置10 min后在后在490 nm处测定吸光值处测定吸光值A。以吸光值以吸光值A为纵坐标，糖含量为纵坐标，糖含量C为横坐标，为横坐标，得糖的标准曲线得糖的标准曲线A = kC。（3）样品溶液制备：）样品溶液制备：精密称取杏鲍菇多糖精密称取杏鲍菇多糖5 mg，先加，先加10 mL蒸馏水溶解，然后定容至蒸馏水溶解，然后定容至50 mL。（4）样品含量测定：）样品含量测定：用移液管吸取样品液用移液管吸取样品液1.0 mL，加入，加入6%苯苯酚溶液酚溶液0.5 mL及浓硫酸及浓硫酸2.5 m

11、L，按上述方法进行操作，测其，按上述方法进行操作，测其吸光值，以标准曲线计算样品糖含量。吸光值，以标准曲线计算样品糖含量。 7. 7. 分级分级 通过通过热水煮提方法热水煮提方法提取的多糖，通常是提取的多糖，通常是混合物混合物，且，且分分子量不均一子量不均一，其单糖组成、分子结构和聚合度往往不同，其单糖组成、分子结构和聚合度往往不同，可通过可通过柱层析柱层析的方法，对其进行分级以达的方法，对其进行分级以达纯化的目的纯化的目的。本。本实验中，采用实验中，采用DEAE-纤维素纤维素和和琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶Sepharose CL-6B柱层析相结合的方法对平菇多糖进行分级，分离纯化出各柱层析相结合的

12、方法对平菇多糖进行分级，分离纯化出各级分多糖。级分多糖。（1） DEAE-纤维素的预处理和装柱纤维素的预处理和装柱 将将DEAE-纤维素用纤维素用蒸馏水充分浸泡溶胀蒸馏水充分浸泡溶胀后，倾倒除去水分，后，倾倒除去水分，再用再用0.5 M NaOH溶液浸泡溶液浸泡1 h，用蒸馏水反复洗涤至，用蒸馏水反复洗涤至PH等于等于7。再用。再用0.5 M的的HCl溶液浸泡溶液浸泡1 h，用蒸馏水洗至，用蒸馏水洗至中性中性，真空，真空清除气泡，备用。清除气泡，备用。 装柱时，先将装柱时，先将DEAE-纤维素沿着纤维素沿着玻璃棒玻璃棒缓慢倒入，以防产缓慢倒入，以防产生气泡。柱子装好后，依次用生气泡。柱子装好后

13、，依次用5倍柱体积的蒸馏水倍柱体积的蒸馏水、3倍柱体倍柱体积的积的NaCl和和5倍柱体积的蒸馏水倍柱体积的蒸馏水进行平衡，流速设定为进行平衡，流速设定为20 cm h-1。（2）杏鲍菇多糖的离子交换柱层析的线性梯度洗脱）杏鲍菇多糖的离子交换柱层析的线性梯度洗脱 称取称取50 mg杏鲍菇多糖，溶于杏鲍菇多糖，溶于5 mL蒸馏水中，在已平蒸馏水中，在已平衡好的衡好的DEAE-纤维素离子交换柱纤维素离子交换柱(1.5 14 cm，Cl-型型) 上上进行上样，先用进行上样，先用100 mL蒸馏水蒸馏水做流动相进行洗脱，再用做流动相进行洗脱，再用01.0 M NaCl溶液溶液300 mL进行线形梯度洗脱

14、，进行线形梯度洗脱，流速流速1.0 mL/min，每个试管收集每个试管收集3 mL洗洗脱液，脱液，苯酚苯酚-硫酸法硫酸法测定洗测定洗脱液中相对的糖含量分布。脱液中相对的糖含量分布。（3）杏鲍菇杏鲍菇多糖的凝胶柱层析分析多糖的凝胶柱层析分析 取取5 mg杏鲍菇多糖样品，溶于杏鲍菇多糖样品，溶于1 mL的的0.15 MNaCl（生理（生理盐水）溶液中，离心（盐水）溶液中，离心（3000 rpm/min，5 min），取上清上），取上清上样于样于Sepharose CL-6B凝胶层析分析柱凝胶层析分析柱(1.5 90 cm)，洗脱，洗脱液为液为0.15 M NaCl溶液，流速为溶液，流速为0.18

15、mL/min，每管收集，每管收集2.2 mL，苯酚苯酚-硫酸法硫酸法检测洗脱液中相对糖含量分布。检测洗脱液中相对糖含量分布。8. 纯度鉴定纯度鉴定 旋光仪鉴定多糖纯度：旋光仪鉴定多糖纯度：不同的多糖具有不同的比旋度，它们在不同浓不同的多糖具有不同的比旋度，它们在不同浓度的乙醇中具有不同溶解度，所以，如多糖水溶液经不同浓度的乙醇沉淀度的乙醇中具有不同溶解度，所以，如多糖水溶液经不同浓度的乙醇沉淀所得的沉淀物，具有相同比旋度，则证明该多糖为均一组分。所得的沉淀物，具有相同比旋度，则证明该多糖为均一组分。 将杏鲍菇将杏鲍菇多糖多糖样品溶于水，成为近似样品溶于水，成为近似半饱和溶液半饱和溶液，置于，置

16、于磁力搅拌器磁力搅拌器上，上，在搅拌下在搅拌下滴加乙醇滴加乙醇，使溶液中，使溶液中乙醇浓度达到乙醇浓度达到20%，搅拌片刻，使沉淀完全，搅拌片刻，使沉淀完全，离心得沉淀离心得沉淀。上清液中再继续滴加乙醇，使溶液中。上清液中再继续滴加乙醇，使溶液中乙醇浓度达乙醇浓度达40%，所产，所产生的沉淀再经离心。生的沉淀再经离心。前后两次沉淀，分别干燥后在相同条件下测定其水溶前后两次沉淀，分别干燥后在相同条件下测定其水溶液的比旋度。液的比旋度。 将将10 mL5%饱和糖液饱和糖液用国产用国产WXG 6型自动旋光仪，钠灯光源，以蒸型自动旋光仪，钠灯光源，以蒸馏水调零点，馏水调零点，1dm管室温下测定。管室温

17、下测定。四、实验考核四、实验考核 根据实验内容撰写小论文；要求：格式根据实验内容撰写小论文；要求：格式按照按照“大庆师范学院学报自然科学版模板大庆师范学院学报自然科学版模板”格式撰写，格式撰写，3000字左右。字左右。层析技术层析技术 Ion Exchange (IEX)离子交换离子交换电荷 可用于 层析的任何步骤，根据纯度要求，包括粗纯捕获、中间纯化和最后的精细纯化Size Exclusion (SEC)分子筛（或凝胶过滤）分子筛（或凝胶过滤）分子大小 用于中间纯化、脱盐和缓冲液交换、最后精细纯化原理与操作原理与操作层析的层析的5个操作步骤个操作步骤装柱并平衡装柱并平衡上样上样平衡平衡洗脱洗

18、脱再生再生上样装填有层析介质的层析柱分离分离组分流出原理与操作原理与操作层析图层析图原理与操作原理与操作第一峰第一峰, 外水体积外水体积, Vo,不与柱中填料相互作用直接从柱中不与柱中填料相互作用直接从柱中流出。这是样品中的未结合物质流出。这是样品中的未结合物质VoVeVt蛋白质含量蛋白质含量 (A280), 由由UV检测器读出，检测器读出，y轴轴基线基线洗脱峰，有些可以很好的分离，洗脱峰，有些可以很好的分离，有些分得不是很好，有部分交叉有些分得不是很好，有部分交叉有时这里也显示梯有时这里也显示梯度浓度等检测值度浓度等检测值时间或体积，时间或体积，x轴轴凝胶过滤层析凝胶过滤层析离子交换层析离子

19、交换层析凝胶过滤层析凝胶过滤层析分离纯化原理分离纯化原理柱长的选择柱长的选择 分离：80120cm 脱盐：30cm以下 洗脱液洗脱液 离子强度低高离子作用 排阻作用（0.05-0.2M) 疏水作用 pH中性中性流速，流速，根据层析介质的说明，一般很低样品容量样品容量：13CV凝胶过滤层析凝胶过滤层析操作参数选择操作参数选择cationweakstronganionweakstrongDEAEDiethylamino-ethylQ Quaternary amineCMCarboxy-methylSSulfonate离子交换层析离子交换层析离子交换层析类型及其选择离子交换层析类型及其选择-O-CH2CH2-NH+C2H5C2H5-N+(CH3)3-O-CH2-C-O-O-SO3-Products:UNOsphere Q & S, M