Western Blot免疫足迹

1、 Western印迹法这种技术是把电泳分离的组分从凝胶转移到一种固相支持体，并以针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测之。Western使用的探针是抗体，它与附着于固相支持体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。这种技术的作用是对非放射性标记蛋白组成的复杂混合物中的某些特异蛋白进行鉴别和鉴定。 所有电泳的试剂，包括上样buffer，SDS-PAGE配胶试剂盒，电泳buffer、蛋白Marker和蛋白染色试剂盒。第一步：根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度进行凝胶的配制，可以使用SDSPAGE凝胶配制试剂盒。第二步：进行蛋白变性，样品先置95的水浴加热5分钟，接着置冰浴中5分钟，10

2、000g离心20分钟，取上清液（样品可立即使用也可以分装冻存，-20可稳定保持数月）。蛋白上样缓冲液可以使用5SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。第三步依次加入预染蛋白分子量标准和待分析样品。基本操作流程：提取细胞或组织蛋白、测定大致含量制备SDS-PAGE胶蛋白样品变性、电泳电泳转膜封闭（2小时）一抗(4度过夜) TBST洗涤（洗4遍）HRP标记的二抗（1.5小时）TBST洗涤（洗四遍）ECL试剂作用X-光片曝光、显影结果分析详细操作流程1.试剂1.1 .SDS-PAGE蛋白上样缓冲液1.2 SDS-PAGE凝胶配制1M Tris-HCl （pH6.8）:称取24.23g Tris，加dd H2

3、O充分溶解，用浓HCl调节pH值至6.8（约14ml），定容至200ml，121oC 20min灭菌，室温保存。1M Tris-HCl （pH8.0）:称取24.23g Tris，加dd H2O充分溶解，用浓HCl调节pH值至8.0（约8.4ml），定容至200ml，12120min灭菌，室温保存。1.5M Tris-HCl （pH8.8）:称取36.34g Tris，加dd H2O充分溶解，用浓HCl调节pH值至8.8（约5ml），定容至200ml，12120min灭菌，室温保存。10%（W/V）SDS:称取50gSDS，加400ml dd H2O，68加热溶解。滴加浓HCl调节pH值至7.

4、2，定容至500ml，室温保存。30%（W/V）Acrylamide:称取29g Acrylamide，1g N，N-至甲双丙烯酰胺（BIS），加dd H2O溶解，定容至100ml，用0.45m滤膜滤去杂质，4避光保存。20xPBS：称取Na2HPO4 11.5g，KH2PO4 2g，KCL 2g ,NaCl 80g，定溶至500ml蒸馏水中。10%（W/V）过硫酸铵:称取1g过硫酸铵，加10ml dd H2O 充分溶解，4保存（有效期约为两周）,分装于1.5的离心管中，每管1mL，-20度长期保存。1.3 SDS-PAGE电泳液10Tris-Glycine Buffer （SDS-PAGE电

5、泳缓冲液）:称取15.1g Tris，94g Glycine，5gSDS，加ddH2O 充分溶解，定容至500L，室温保存。注：Tris和Glycine难溶，可70度水浴加热，并搅拌，室温保存。SDS溶解易起气泡，常用50mL 10%的SDS代替固体配制。1Tris-Glycine Buffer （SDS-PAGE电泳缓冲液）:量取50ml 10Tris-Glycine Buffer，定溶至500mL，混匀，室温保存。1.4 NC膜（硝酸纤维素膜）或PVDF膜1.5 Western转膜液10X电转液：称取2.9g Glycine，5.8g Tris，0.37g SDS，加ddH2O 充分溶解，

6、定容至500ml，混匀，室温保存。1X电转液：25mL 10X电转液，加100mL的甲醇，混匀，室温保存。1.6 洗涤液PBST Buffer:量取25ml 20PBS，0.25ml Tween 20，加dd H2O定容至500mL，混匀，室温保存。1.7 封闭液称取1.25g脱脂奶粉，加入25ml TBST Buffer中，充分溶解，4 oC保存。1.8 一抗（可重复使用，置于4度冰箱）PBST 1mL 加一抗1ug ,配成1ug/mL,4度冰箱过夜。次日，PBST洗膜4次。二抗 （1:5000）5%的奶粉：取0.25g奶粉，加5mLPBST,加1ug的二抗，于50mL大离心管，室温，1.5

7、小时。之后，PBST洗4次。1.9 EasySee Western Blot Kit1.10 预染marker1.11 BCA蛋白定量试剂盒2. 蛋白样品制备2.1蛋白粗提在人体中IgG占总抗体80%，成人血清中含量为12.5%/ml左右，IgG粗纯一般用饱和(NH4)2SO4(SAS)进行，一般操作如下：1）8ml血清中加入8ml PBS（0.02 PH7.0），混匀后滴加4ml SAS,使其终浓度为20%（目的是除去纤维蛋白原）。2）4，1h后7000rpm离心10min。3）留上清，补加12ml SAS，边振荡另滴加。（终浓度为50%，可除去AIb）4）4，1h后，7000rmp离心10

8、min。5）留沉淀溶于10ml PBS中，滴加5ml SAS，然后4，1h后，7000rmp离心10min。6）弃上清，沉淀溶于10ml PBS，滴加5ml SAS。7） 5）至6）重复三次8）弃上清，沉淀溶于4ml PBS中，PBS透析过夜（400ml）结果：整个实验需7h，注意在离心前离心机应降温。粗提的IgG抗体免疫反应可达到70%-80%。此浓度只针对IgG抗体，若分子量不同使用SAS浓度也不同。操作中应尽量让蛋白少起泡，防止变性减少蛋白损失。2.2 试剂盒提取（RIPA lysis buffer为例2.2.1 对于培养细胞样品：1）融解RIPA裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前

9、数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。2）对于贴壁细胞：去除培养液，用PBS或无血清培养液洗一遍(如果血清中的蛋白没有干扰，可以不洗)。按照6孔板每孔加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞1-2秒后，细胞就会被裂解。 对于悬浮细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装成50-100万细胞/管，然后再裂解。3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清，即可

10、进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。裂解液用量说明：通常6孔板每孔细胞加入150微升裂解液已经足够，但如果细胞密度非常高可以适当加大裂解液的用量到200微升或250微升。2.2.2 对于组织样品：1）把组织剪切成细小的碎片。2）融解RIPA裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。3）按照每20毫克组织加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。如果裂解不充分可以适当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。4）用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。5）充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，

11、取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。6）如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈vortex使样品裂解充分。然后同样离心取上清，用于后续实验。直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。 注：RIPA裂解液的裂解产物中经常会出现一小团透明胶状物，属正常现象。该透明胶状物为含有基因组DNA等的复合物。在不检测和基因组DNA结合特别紧密的蛋白的情况下，可以直接离心取上清用于后续实验；如果需要检测和基因组结合特别紧密的蛋白，则可以通过超声处理打碎打散该透明胶状物，随后离心取上清用于后续实验。如果检测一些常见

12、的转录因子，例如NF-kappaB、p53等时，通常不必进行超声处理，就可以检测到这些转录因子。 3 蛋白样品的初步定量（详细步骤见BCA试剂盒说明书） 蛋白质定量的方法比较多，目前用得比较多的是 BCA 法，其基本原理为要分析的蛋白在碱性溶液里与 Cu2+反应产生 Cu+，后者与 BCA 形成螯合物，形成紫色化合物，吸收峰在 562nm波长。此化合物与蛋白浓度的线性关系极强，反应后形成的化合物非常稳定。通过标准曲线可以确定对应样品的蛋白浓度，具体的操作步骤可以参考试剂盒说明书。Western Blot 的对蛋白浓度的检测要求通常1ug/ul，大部分培养的细胞或者组织都是可以满足的，注意因为测

13、定的是总蛋白浓度，而非特异性蛋白的量，有时可能会出现测量总蛋白含量很高，做WB时却求检测到目的蛋白条带，就是因为特异性蛋白质表达很低。所以这步只具有参考意义。在后面的检测中，都平行做内参的检测，以确定电泳系统的质控。 4 SDS-PAGE电泳 （1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗涤灵轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在架子上晾干后，保证玻璃板上无污性方可使用。 （2）灌胶与上样 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶，整个操作应轻柔，夹子平行按下，以免玻璃板破碎） 制备分离胶（pH 8.8）（试剂配方详见最后

14、附表）3. 灌胶时，可用1ml枪吸取1ml胶沿玻璃放出，溶液缓慢加入到装配好的板中至凝胶高度为6 cm左右，预留1.5 cm高度配制浓缩胶。然后胶上加一层水，液封后的胶凝得更快。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。）室温放置0.51小时左右至聚合完全。 当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干（注意吸水纸不可触及分离胶）。 制备浓缩胶（PH6.8）：将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产

15、生。插梳子时要使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。凝胶聚合约0.51小时左右。 将其放入电泳槽中，可用200ul枪吸取电泳液将胶里的各个孔轻轻吹吸几下，可将孔内气泡及碎胶赶出。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，槽另一边要垫一块WB专用玻璃板） 取提取好的蛋白，约1015ul与5SDS上样缓冲液按5：1的比例混合，加到1.5ml离心管中，然后沸水中煮35min使蛋白完全变性。 电泳：电泳的电压为100V较好，也可用120150V。电泳至溴酚兰刚

16、跑出即可终止电泳，时间长短根据检测蛋白质大小确定，然后进行转膜。注意：1）10%APS需现用现配，或配好分装后放入-20度以下冻存，一般4度保存的APS使用时间最好不好超过一个星期。否则易造成胶不凝。2）丙烯酰胺、TEMED均为毒性物质，使用时严禁与皮肤接触。3）配制Tris-Cl时，严格控制好其PH值，这对于蛋白分离至关重要。5 转膜 实验前的准备工作 1）、制备足够转移缓冲液以充满转移槽，另外准备200 ml用于平衡凝胶和膜以及润湿滤纸。 2）、从玻璃板上取下凝胶，去除所有浓缩胶。 3）、将凝胶浸入转移缓冲液中15-30分钟。 4）、滤纸在转移缓冲液中至少浸泡30秒。 5）、准备膜： a、

17、硝酸纤维素膜：将膜进入转移缓冲液中15-30分钟 b、PVDF膜（PVDF膜具有更好的蛋白吸附、物理强度以及具有更好的化学兼容性，根据目的蛋白大小选择膜孔径大小，有0.45um和0.22um）在甲醇中润湿膜15秒，保证膜由不透明变成半透明。 小心将膜放入双蒸水水中浸泡 2 分钟。 小心将膜放入转移缓冲液中平衡至少 5 分钟。 将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵垫，用玻棒单个方向（来回赶容易使胶破裂）赶几遍以赶走里面的气泡（一手赶另一手要压住垫子使其不能随便移动）。在垫子上垫三层滤纸（可边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。（转移液含甲醇，操作时要戴手套， 实验室要开门以使空气流通

18、。） 要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。（撬时一定要小心，玻板很易裂。）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破，同时在胶的右上角做个记号。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。在膜上盖3张滤纸并除去气泡。最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡 将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的红面对槽的红面。电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。转膜装置置于冰水中，打开电源30 mA过夜或200mA 2小时。 转完后在膜上做个记号，以判断膜的正反面，转膜结束后，若看见预染Marker条带，说明转膜成功。6免疫反应 （1）将膜用TBST从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下,用封闭液在脱色摇床上摇动封闭2h或者度过夜，如果预实验做完后，发现背景比较高，可以适当延长封闭时间（2）将一抗用封闭液稀释液（如回收，请用专用稀释液稀释）稀释至适当浓度；通常用自封袋装溶液（在平皿中反应也可以），溶液体积大概1-5ml，从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后（不必洗涤），将膜蛋白面朝上放于抗体液面上，脱色摇床上37孵育3h 后，用TBS