多酚氧化酶在荔枝果皮花色素苷降解中的作用

1、多酚氧化酶在荔枝果皮花色素苷降解中的作用庞学群1，黄雪梅2，杨晓棠2，季作梁2，张昭其2（1华南农业大学生命科学学院，广州 510642；2华南农业大学园艺学院，广州 510642）摘要：【目的】荔枝果皮褐变与花色素苷含量、多酚氧化酶（PPO）活性的关系极为密切，本研究的目的是探讨PPO催化花色素苷降解而引起果皮褐变的机理。【方法】利用纯化的荔枝果皮PPO、花色素苷、花色素、花色素的降解产物及固定化PPO，探讨PPO在花色素苷降解中的作用。【结果】纯化的荔枝果皮PPO虽不能催化花色素苷降解，但在邻苯二酚存在下，花色素苷被PPO迅速降解，并形成褐色产物；PPO可直接催化氧化荔枝果皮花色素及其降解

2、产物并形成褐色产物；利用固定化PPO建立了PPO-酚-花色素苷反应系统，表明花色素苷的降解不依赖于PPO，而仅依赖于PPO催化形成的醌类物质。【结论】在荔枝果皮褐变过程中，首先是PPO催化氧化酚类物质、花色素及其降解产物形成相应的醌类物质，醌类物质进一步氧化花色素苷，导致花色素苷含量降低、褪色或变色。关键词：荔枝；多酚氧化酶；花色素苷；降解Role of Polyphenol Oxidase in Anthocyanin Degradation of Lychee PericarpPANG Xue-qun1, HUANG Xue-mei2, YANG Xiao-tang2, JI Zuo-li

3、ang2, ZHANG Zhao-qi2(1Collge of Life Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510642; 2College of Horticulture, South China Agricultural University, Guangzhou 510642)Abstract: 【Objective】 It is well established that anthocyanin and polyphenol oxidase (PPO) are involved in pericarp bro

4、wning of harvested lychee fruit. However, the mechanism by which PPO catalyzes the anthocyanin degradation and pericarp browning has not been well understood yet. 【Method】To understand the role of PPO in anthocyanin degradation, the in vitro degradation of anthocyanins was analyzed in the reactions

5、containing the purified anthocyanin, purified PPO or its immobilized style, exogenous phenol, anthocyanidin or its degraded products.【Result】Purified PPO did not catalyze the degradation of purified anthocyanin. However, in the presence of catechol, anthocyanin was degraded rapidly by PPO and then f

6、ormed to be brown by-products. PPO directly catalyzed the oxidation of anthocyanidin or its degraded by-product. A sequential reaction system of PPO-phenol-anthocyanin was established by application of the immobilized PPO. The study indicated that the anthocyanin degradation was independent of PPO,

7、but dependent of the quinones generated by PPO.【Conclusion】It was suggested that, during the pericarp browning of lychee fruit, PPO first catalyzes the oxidation of phenols, anthocyanidin and/or its degraded products, then forms quinones, and finally quinones oxidize anthocyanin to brown by-products

8、, leading to the decoloration, browning and reduced anthocyanin content. Key words: Lychee (Litchi chinensis Sonn.); Polyphenol oxidase; Anthocyanin; Degradation 0 引言【研究意义】荔枝是中国南方名特优果，在国内及国际市场上极具竞争力。荔枝采后贮运最严重的一个问题就是果皮褐变，它是限制荔枝长期贮运、导致荔枝货架寿命短和降低荔枝商品价值的主要因素。【前人研究进展】长期以来，荔枝果皮褐变被认为是由于多酚氧化酶（PPO）催化氧化果皮花色素苷

9、形成褐色物质的结果1,2。大量的研究表明，荔枝果皮褐变与花色素苷含量、PPO活性具有极为密切的关系35，然而，Jiang6发现荔枝果皮PPO不能直接催化花色素苷的降解，类似的报道还见于黑莓7、葡萄8等水果上。当向反应系统中加入酚类物质后，花色素苷降解速度迅速增加68。Jiang6,7详细研究了不同酚类物质对PPO催化花色素苷降解的影响，Sarni等8、Kader等9详细研究了PPO-酚-花色素苷反应系统的动力学特性。【本研究切入点】在酚类物质存在条件下，PPO是如何降解花色素苷的，目前还存在争论，这主要是由于PPO-酚-花色素苷反应系统复杂，增加了研究PPO降解花色素苷机理的难度。Kader等

10、9认为，若能在反应系统中直接采用纯的醌类物质将有助于进一步确定花色素苷的降解机理，但醌类物质的化学性质非常活跃，迄今未见有成功的报道。【拟解决的关键问题】本文利用纯化的荔枝果皮PPO、花色素苷、花色素、花色素的降解产物及固定化PPO等，深入探讨了在酚类物质存在下，PPO对花色素苷的降解机理。1 材料与方法 材料及处理荔枝品种淮枝（Litchi chinensis Sonn. cv. Huaizhi），采自广州从化，红熟后采收并立即运回实验室，挑选无病虫害及机械伤的果实，剥取果皮，用水冲洗，用于PPO、花色素苷等的提取，或液氮速冻后置于-80下备用。 花色素苷的纯化与含量测定花色素苷的纯化参照Z

11、hang等10的方法。取一定量的果皮，用1%（v/v）的盐酸提取花色素苷，将提取液上Amberlite XAD-7树脂吸附层析柱（ cm×40 cm），用蒸馏水洗柱以除去杂质和过多的盐酸，然后用0.1% HCl甲醇洗脱，将洗脱液用减压旋转蒸发仪低于40下浓缩，并通过Sep-Pak C18柱以除去不溶性杂质，得初步纯化花色素苷浓缩液。将花色素苷浓缩液上Sephadex LH-20凝胶层析柱（ cm×60 cm）进一步纯化，收集纯化的花色素苷备用。花色素苷含量测定参照Zhang等11的方法，采用植物化学中测定花色素苷的经典方法（即pH差示法测定）。 花色素的制备和含量测定参照H

12、ong和Wrosltad12的方法，用酸水解花色素苷糖苷键。取一定量纯化的花色素苷浓缩液，加入1/3体积的8 mol·L-1的盐酸，在沸水浴中加热20 min水解花色素苷，用异戊醇萃取方法检测花色素苷是否水解完全。冷却后，将水解液上Amberlite XAD-7树脂吸附层析柱（ cm×40 cm），用蒸馏水洗柱以除去过多的盐酸，后用0.1%HCl甲醇洗脱，收集红色含花色素的洗脱液，洗脱液于40减压旋转蒸发浓缩，后通过Sep-Pak C18柱以除去不溶性杂质，得澄清的花色素浓缩液。测定溶液在510 nm处的光吸收，以OD510代表花色素的相对含量。1.4 PPO的分离纯化按J

13、iang等13及林健巧等14方法进行。经30%70%饱和度硫酸铵分部盐析、Sephadex G-75柱层析（ cm×50 cm）和DEAE-Sepharose柱层析（ cm×50 cm）后，收集酶活性峰部分，测得PPO活性为1 896 U·ml-1，蛋白质含量为1.96 mg·ml-1，用于以下各反应系统。PPO活性以每分钟OD398变化0.001表示1个酶活性单位。 固定化PPO的制备参照林健巧等14方法。交联载体的准备：尼龙布（3 cm×3 cm/块）用含18.6% CaCl2和含18.6%水的甲醇溶液处理10 mol·L-1 H

14、Cl中水解45 mol·L-1、pH 8.5硼酸缓冲液配制，现配现用），20交联20 mol·L-1磷酸缓冲液洗去多余的戊二醛，吸干。溶液酶的浓缩：将1.4收集的酶液置于透析袋内，袋外覆以聚乙二醇，袋内水分被袋外的聚乙二醇所吸收，得到浓缩的溶液酶（蛋白质浓度为 mg·ml-1）。取2 g交联载体加入4 ml溶液酶，于4下固定7 mol·L-1磷酸缓冲液洗至洗脱液在280 nm波长下无光吸收，即为尼龙固定化PPO。1.6 反应系统吸收光谱的测定用岛津UV-2401PC 紫外可见分光光度计测定反应系统在350600 nm的吸收光谱。 邻苯二酚存在条件下PPO

15、对花色素苷的降解作用 mol·L-1 ml花色素苷稀释液，50 ml PPO酶液和50 ml ml花色素苷稀释液，100 ml ml花色素苷稀释液，50 ml mol·L-1邻苯二酚和50 ml PPO酶液。反应开始后每5 min测定1次花色素苷浓度，并测定5和15 min后各反应系统的吸收光谱。1.8 PPO对花色素的降解作用 mol·L-1的柠檬酸-磷酸缓冲液，反应系统含有：50 ml多酚氧化酶和3 ml花色素稀释液，对照以50 ml柠檬酸-磷酸缓冲液代替酶液，分别测定0 min和3 min后反应系统的吸收光谱。1.9 PPO对花色素降解产物的催化氧化作用取花

16、色素浓缩液稀释到pH mol·L-1柠檬酸缓冲液中，置于40水浴3 h，以促使花色素自发降解，以异戊醇检测花色素是否降解完全。反应体系为：花色素降解液3 ml和50 ml PPO，对照以50 ml柠檬酸-磷酸缓冲液代替酶液。测定450 nm OD值的变化代表酶活性，并在10 min后测定反应系统的吸收光谱。0 固定化PPO-邻苯二酚-花色素苷降解系统的建立取5 ml 10 mmol·L-1 mol·L-1的柠檬酸-磷酸缓冲液配制），加入固定化PPO 3块，反应5 min后取1 ml反应液加入到5 ml花色素苷溶液中，以邻苯二酚溶液取代反应液为对照，立即测定花色素苷

17、含量。2 结果与分析 在邻苯二酚存在条件下PPO催化荔枝果皮花色素苷的降解从图1可知，纯化的荔枝果皮花色素苷加入纯化的PPO或邻苯二酚后，其含量变化不显著。可见PPO不能直接催化氧化花色素苷降解，而邻苯二酚可与花色素苷共存。不过，在花色素苷溶液中同时加入PPO和邻苯二酚，则花色素苷含量迅速下降，可见在酚类物质存在条件下，PPO能催化花色素苷的降解。图1 在酚类物质存在条件下PPO对荔枝果皮花色素苷的降解（）Fig. 1 The effect of PPO on anthocyanin degradation in the presence of catechol (pH 4.0)2.2 PPO

18、、酚和花色素苷反应系统5 min后的吸收光谱曲线PPO-邻苯二酚-花色素苷反应系统在反应5 min后，对混合液进行了350600 nm波长光谱扫描，发现混合液在510530 nm的光吸收降低，同时在350450 nm光吸收增加（图2），说明在PPO和邻苯二酚存在条件下，花色素苷含量降低了，同时混合液出现了褐色物质。图2 PPO、邻苯二酚和花色素苷反应系统在pH Fig. 2 Absorption spectra of reaction system containing PPO, catechol and anthocyanin at pH 2.3 PPO催化荔枝果皮花色素的降解荔枝果皮花色素

19、不稳定，在自然条件下可自发降解。分别放置3 min、6 min后，花色素含量明显降低，但在花色素溶液中加入纯化的PPO后，进一步促进了花色素含量的降低（图3），说明PPO可直接催化花色素的降解。图3 PPO对荔枝果皮花色素降解的影响（）Fig. 3 The effect of PPO on anthocyanidin degradation (pH 4.0)2.4 PPO-花色素反应系统的吸收光谱从花色素波长光谱扫描曲线可看出（图4），花色素不稳定，可自发降解，自发降解产物在350450 nm处的光吸收没有增加。加入PPO后，花色素含量降低得更快，并在510530 nm处光吸收降低的同时，35

20、0450 nm处的光吸收相应增加，说明随着花色素含量的降低，形成了褐色产物。Fig. 4 Absorbance spectra of reaction system conatining PPO and anthocyanidin PPO和花色素降解产物的吸收光谱从图5可知，花色素降解产物的吸收光谱呈一平滑曲线，在510530 nm处无吸收峰，表明花色素已完全降解，用异戊醇亦能检验出花色素是否全部降解。荔枝果皮的褐色产物可以OD450的变化量表示15，当以花色素降解物为PPO的底物时，以OD450变化0.001代表1个酶活性单位，可测得PPO活性为137 U/min。从波长扫描曲线亦可看出，花

21、色素降解物在PPO的作用下，在所选波长范围内的光吸收都有增加，表明形成了褐色物质。2.6 固定化PPO与酚类物质的反应产物对花色素苷含量的影响采用固定化酶技术，成功地将荔枝PPO固定到尼龙交联载体上，固定效率为15.6%。固定化PPO加入到邻苯二酚溶液反应5 min后，立即吸取反应液（含邻苯二酚及相应的醌）加入到浓度为50 nmol·L-1 nmol·L-1。说明在酚类物质存在条件下，花色素苷的降解仅依赖于PPO催化氧化形成的醌类物质，而不依赖于PPO。图5 PPO与花色素降解产物反应系统的吸收光谱（）Fig. 5 Absorbance spectra of reactio

22、n containg anthocyanidin degradation products and PPO (pH 4.0)3 讨论长期以来，荔枝果皮褐变被认为是由于多酚氧化酶（PPO）催化降解花色素苷形成褐色物质的结果1,2，荔枝果皮褐变与花色素苷含量、PPO活性具有极为密切的关系35。早在1965年，Sakamura等16就针对PPO在降解花色素苷中的作用进行了详细研究，认为花色素苷的降解和褪色是由于被PPO催化氧化所致，然而，Wesch 和 Montgomer17发现，在PPO-花色素苷系统中，花色素苷含量降解得很慢，一旦加入邻苯二酚，花色素苷含量则迅速降低，认为虽然PPO可直接催化花色

23、素苷的降解，但不是花色素苷降解的主要途径。随后很多研究者均证实了邻苯二酚可促进PPO-花色素苷系统中花色素苷的降解69。本文采用的纯化花色素苷经过了Amberlite XAD-7树脂、Sephadex LH-20柱层析，排除了其它酚类物质的干扰10，然后与纯化的果皮PPO组成PPO-花色素苷反应系统。结果发现，花色素苷含量在反应时间（20 min）内没有降低（图1），采用氧电极法也不能检测到PPO活性（数据未列出），说明荔枝果皮PPO不能直接催化氧化花色素苷。Kader 等9认为，由于PPO-花色素苷反应系统中可能混有酚类物质或花色素，而导致某些报道中认为PPO可缓慢降解花色素苷。虽然荔枝果皮

24、PPO对花色素苷无活性，但能催化氧化花色素和花色素的降解产物。荔枝果皮主要花色素苷为矢车菊素-3-芸香二糖10，其B环类似邻苯二酚，在脱除糖组分后，可成为PPO的底物。本文研究表明，PPO加入到纯化的花色素溶液中，可导致花色素含量迅速降低。对反应混合液扫描结果也表明，反应混合液在510530 nm处光吸收降低的同时，350450 nm处的光吸收相应增加，说明花色素被氧化后形成了褐色产物。此外，花色素很不稳定，在自然条件下易开环形成简单酚类物质，而矢车菊素开环后形成的酚类物质的结构与邻苯二酚非常相似18，可成为PPO的合适底物，因为荔枝果皮PPO属邻苯二酚类PPO，能氧化二元酚和多元酚，而对一元

25、酚不起作用13。笔者用花色素自发降解产物作底物，能检测到高PPO活力，也证实了这一点。笔者以往的研究表明，荔枝果皮存在高活力的花色素苷酶10,19，花色素苷酶是一类能催化花色素苷-糖苷键水解生成花色素和糖的-糖苷酶10。Richardson和Finley20指出，花色素苷的糖苷键起到稳定花色素苷的作用，糖苷键被水解，花色素的吡喃环易开环，生成小分子量的酚类物质。此外，花色素苷糖苷键的存在还可能成为花色素苷与PPO结合的立体障碍21，导致PPO不能直接催化氧化花色素苷69, 23。综上所述，在荔枝果皮褐变过程中，果皮花色素苷酶可能催化花色素苷糖苷键断裂，形成花色素和糖，继而花色素自发裂解形成小分

26、子量的酚类物质，而花色素及其降解产物均可作为PPO的底物。PPO催化形成的醌类物质是如何进一步与花色素苷反应的，不同的人提出了不同的解释。一种观点认为醌类物质进一步将花色素苷氧化为褐色物质22；另一种观点认为醌类物质与花色素苷聚合形成高聚物17,23；此外，在PPO-酚反应系统中加入花色素苷，会导致反应系统吸氧量的额外增加9，因此认为酚类物质在PPO催化降解花色素苷过程中也可能具有一定的催化作用，即在酚类物质存在下，PPO可直接催化氧化花色素苷。由于PPO-酚-花色素苷反应系统复杂，增加了研究PPO降解花色素苷机理的难度，Kader等9认为，若能在反应系统中直接采用纯的醌类物质将有助于进一步确

27、定花色素苷的降解机理。但醌类物质的化学性质非常活跃，迄今未见有成功的报道。笔者的研究发现，花色素苷在PPO-邻苯二酚反应系统中，随着510530 nm处光吸收的降低，350450 nm处的光吸收显著增加（图2），说明形成了褐色产物，与邻苯二酚的反应规律类似，推测花色素苷被氧化的可能性较大。此外，本文将荔枝果皮PPO纯化并固定化，建立了PPO-酚-花色素苷反应系统。结果表明，PPO与邻苯二酚反应液（只含有邻苯二酚及相应的醌，无PPO）可导致花色素苷含量的降低，说明花色素苷的降解不依赖于PPO，而仅依赖于PPO催化形成的醌类物质。至于在PPO-酚反应系统中加入花色素苷导致的吸氧量的额外增加，可能的

28、解释是：由于醌类物质氧化花色素苷，自身又被还原为相应的酚类物质，维持了系统中酚类物质的含量8，从而导致系统吸氧量的额外增加。Sarni等8还发现，不同种类的花色素苷在相同的PPO-酚反应系统中的降解速度不一样，Cyanindin-3-glucoside的降解速度比Malvin-3-glucoside的降解速度快得多，认为前者对醌类物质敏感，容易被氧化。看来不同的花色素苷种类在PPO-酚-花色素苷反应系统中被PPO降解的模式是不同的，尚需要进行详细研究。4 结论在荔枝果皮褐变过程中，首先是PPO催化氧化果皮内存在的酚类物质、花色素及其降解产物形成相应的醌类物质，醌类物质进一步氧化花色素苷，导致花

29、色素苷含量降低、褪色或变色。References1Ray P K. Post-harvest handling of litchi fruits in relation to colour retention-A critical appraisal. Journal of Food Science and Technology, 1998, 35(2): 103-116.2Jiang Y M, Duan X W, Joyce D, Zhang Z Q, Li J R. Advances in understanding of enzymatic browning in harvested l

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