超高效液相色谱法测定龙胆药材中的獐芽菜苦苷和龙胆苦苷

1、超高效液相色谱法测定龙胆药材中的獐芽菜苦苷和龙胆苦苷                      作者：曹悦，左代英，吴晓兰，刘敬武，孙启时【摘要】  目的建立超高效液相色谱（UPLC）法测定龙胆药材中活性成分的方法。方法采用L9（34）正交表安排实验，确定最佳提取条件。色谱柱：Shimadzu C18（3.0 mm×75 mm, 1.7 m）；流动相：乙腈-0.1%磷

2、酸（VV = 5.594.5），流速0.80 ml/min；检测波长235,270 nm；柱温为40。结果獐芽菜苦苷、龙胆苦苷分别在0.154 81.858 0 mg/ml，0.3225.152mg/ml范围内呈良好的线性关系，平均回收率分别为102.09%，RSD=1.68（n=6）；103.80%，RSD=1.11（n=6）。结论采用UPLC法控制龙胆质量，操作简单,结果准确，方法可行。 【关键词】  龙胆 超高效液相色谱 獐芽菜苦苷 龙胆苦苷Abstract：ObjectiveTo establish a method for the determination of swer

3、tiamarin and gentiopicroside in root of Gentiana scabra Bge.by UPLC.MethodsBy L9（34）orthogonal design, an optimal condition was confirmed. The separation was performed on Shimadzu C18（3.0 mm×75 mm,1.7m） column, the mobile phase was Acetonitrile-0.1% Phosphorylation（VV = 5.594.5）. The  flow

4、 rate was 0.8 ml/min, the detection wavelength was 235nm, 270nm, and the column temperature was 40.ResultsThis method had good linearity in the range of 0.3225.152mg/ml,and the average recovery was102.09 % with RSD of 1.68%for swertiamarin. It had good linearity in the range of 0.15481.858 mg/ml ,an

5、d the average recovery was 103.80% with RSD of 1.11%for gentiopicroside.ConclusionThis method is simple , accurate , and suitable for the quality control of root of Gentiana scabra Bge.by UPLC.Key words：Radix Gentiana Scabra Bge.;  UPLC; Swertiamarin;  Gentiopicroside    龙胆为

6、龙胆科植物条叶龙胆Gentiana manshurica Kitag，龙胆Gentiana scabra Bge，三花龙胆Gentiana  triflora Pall或坚龙胆Gentiana rigescens Franch的干燥根及根茎。具有清热燥湿，泻肝胆火的作用。用于湿热黄疸，阴肿阴痒，带下，强中，湿疹瘙痒，目赤，耳聋，胁痛，口苦，惊风抽搐1。龙胆的主要有效成分为环烯醚萜类化合物，有龙胆苦苷（Gentiopicroside）、獐牙菜苦苷（Swertiamarin）及獐牙菜苷（Sweroside）等,这类物质也是其苦味的物质基础2。目前采用常规液相分析时一般都需要较长的分析时间

7、，而超高效液相色谱(UPLC)技术的应用，是我们在满足有效分离样品的同时，极大地缩短了分析时间，有效地提高了工作效率，节约了成本。而本文就是采用UPLC建立了一种快速、准确控制龙胆质量的方法。1   仪器与试剂    岛津-UPLC超高效液相色谱仪，LC-solution色谱工作站。獐芽菜苦苷对照品（北京中西远大科技有限公司，批号070316 纯度99.06%），龙胆苦苷对照品（中国生物制品检定所，批号110770-200510），磷酸为分析纯，其余试剂均为色谱纯。2   方法与结果2.1  提取工艺的考察以獐芽菜

8、苦苷和龙胆苦苷为检测指标，选取提取溶剂、提取方法、提取时间3个因素，每个因素3个水平，采用L9（34）正交表进行实验，按“2.4”项制备样品溶液，按“2.5”项条件进行测定。综合直观分析和方差分析的结果，确定最佳提取工艺为：甲醇超声提取30 min。2.2   检测波长的选择取獐芽菜苦苷和龙胆苦苷对照品适量，加甲醇制成浓度为0.1 mg/ml的溶液，在200400 nm进行紫外扫描，结果獐芽菜苦苷的最大吸收波长在235 nm，龙胆苦苷的最大吸收波长在270 nm。2.3   对照品溶液的制备分别精密称取獐芽菜苦苷和龙胆苦苷对照品适量,加甲醇制成0.15

9、mg/ml和0.3 mg/ml的溶液。2.4   供试品溶液的制备取龙胆药材，粉碎成中粉，取1g置具塞三角瓶中,精密加入甲醇25 ml，称定重量，超声处理30 min（严格控制水温，15 min停1次），冷却至室温，以甲醇补足减失的重量，摇匀，经0.45m微孔滤膜滤过，作为测定獐芽菜苦苷的样品溶液，精密吸取上述溶液5ml，置25ml量瓶中加甲醇溶液稀释至刻度，作为测定龙胆苦苷的样品溶液。2.5   色谱条件色谱柱Shimadzu C18 （3.0 mm×75 mm, 1.7 m）；流动相为乙腈-0.1磷酸溶液（5.594.5），流速0.8 ml

10、/min，检测波长分别为235 nm和270 nm，柱温40，进样量4 l。2.6   线性关系分别精密量取獐芽菜苦苷对照品溶液（c=0.154 8mg/ml）1，2，4，6l、母液（c=0.309 7 mg/ml）4，6l注入液相色谱仪中，测定峰面积；分别精密量取龙胆苦苷对照品溶液，（c=0.322 mg/ml）1，2，4，8l、母液（c=0.644 mg/ml）6l、8l注入液相色谱仪中，按照“2.5”项的方法测定峰面积，结果表明，獐芽菜苦苷、龙胆苦苷质量浓度（X）在0.154 81.858 0 mg/ml和0.3225.152 mg/ml与峰面积（Y）呈线性关系。回归

11、方程分别为Y = 889 751X - 9 916.5，r=0.999 8; Y = 805 953X + 25 881, r=0.999 8。百事通2.7   精密度实验精密吸取同一供试品溶液4 l，连续进样5次，獐芽菜苦苷和龙胆苦苷的峰面积RSD分别为1.92,0.32（n=5）。2.8   重复性实验精密称取龙胆中粉1 g,按“2.4”项制备6份样品溶液，测定，计算獐芽菜苦苷和龙胆苦苷的含量，其RSD分别为0.79,2.0（n=6）。2.9   稳定性实验取同一供试品溶液分别在0，2，4，6，8，12，16 h测定，结果表明獐芽

12、菜苦苷和龙胆苦苷在16 h内稳定性良好，峰面积RSD分别为1.65,0.31。2.10   回收率实验分别精密称取已知质量分数的龙胆药材粉末，獐芽菜苦苷0.5 g,龙胆苦苷0.1 g,制备样品溶液，测定，结果獐芽菜苦苷的平均回收率102.09%，RSD为1.68（n=6）；龙胆苦苷的平均回收率103.80%，RSD为1.11（n=6）。2.11  样品测定18批样品系辽宁天瑞绿色产业科技开发有限公司提供的栽培品。取样品1 g,制备样品溶液，测定，结果见表1。色谱图见图14。表1  样品测定结果（略）3  讨论   

13、 从正交实验设计法的实验结果中发现，超声提取和回流提取两种方法，在使用甲醇作为溶剂、提取时间为30 min时，所测定的两个指标性成分的含量基本一致，但考虑到回流的操作相对复杂，而且一旦超出规定的回流时间，两类成分含量损失较大，分析原因是两类成分均为裂环烯醚萜苷类化合物，受热易分解，因此选择了耐用性较好的超声提取方法，并且在操作中严格控制温度。    UPLC法用于药品成分的检测目前还很少，其优点在于不影响正常分离度的情况下，通过缩小填料粒度、增加线流速的情况下，极大地缩短了分析时间。同常规液相相比，一般能够缩短410倍的分析时间，提高了工作效率。獐芽菜苦苷和龙胆苦苷均为水溶性成分，极性较大，所采用的流动相水的比例很大，采用常规液相需要100 min，而超高液相仅需要20多分钟，同时满足了獐芽菜苦苷的有效分离度。    所测定的样品均为辽宁清原的道地药材，其龙胆苦苷的含量范围为56.7585.61 mg/g，远高于中国药典1规定的10 mg/g的要求。獐牙菜苦苷的含量范围