白血病干细胞分子生物学特性及相应治疗策略研究进展

1、白血病干细胞分子生物学特性及相应治疗策略研究进展（浙江大学医学院附属第二医院血液科 古莹 邱曦 徐荣臻*，杭州310009）摘要：耐药与复发是白血病治疗失败两大主要原因但其病因与确切分子机制迄今不详。近年来，已有越来越多的研究表明，白血病患者体内除了含有大量幼稚白血病细胞外，还存在着一群比例极少的白血病干细胞（Leukemia stem cells, LSCs）。这些肿瘤性干细胞对目前常用的化疗药物无反应，被认为是白血病耐药和复发的主要根源，只有清除LSCs才有可能根治白血病。本文简要介绍白血病干细胞基本分子生物学特性及相应治疗策略研究进展。关键词 白血病干细胞; 白血病复发; 耐药白血病是一

2、类常见的严重危害人类健康的造血系统恶性肿瘤，在我国白血病发病率约为4-5/10万，是青少年第一大恶性肿瘤。化疗是目前白血病的主要治疗手段，但大多数患者只能获得短暂缓解，最终因白血病复发或耐药而死亡，但白血病复发和耐药的确切病因与发病机制迄今不详。近年来，已有越来越多的临床和实验研究资料显示，白血病患者体内存在着一群比例极少的白血病干细胞（Leukemia stem cells, LSCs），在启动白血病发生和发展中起着决定性的作用，被认为是白血病耐药和复发的主要根源，只有清除LSC才有可能根治白血病。与正常造血干细胞(HSC) 及分化相对成熟的白血病细胞相比, LSCs有其特有的一些特性, 本

3、文简要介绍近年来有关白血病干细胞基本分子生物学特性及相应治疗策略研究进展。1 白血病干细胞概念提出与检测方法白血病干细胞（Leukemia stem cells, LSCs）概念的提出主要基于白血病细胞呈克隆性生长以及大部分白血病细胞的增殖能力非常有限，推测白血病细胞克隆增殖起源于少数具有强大自我复制和多向分化潜能的类似于正常造血干细胞的细胞。早在1971年，Park 及其同事在研究多发性骨髓瘤细胞发现，只有一小部分细胞具有克隆增殖能力1。Bonnet 及其同事通过对大量的临床样本研究发现，急性髓细胞白血病（Acute myeloid leukaemia,AML）中CD34+CD38-细胞亚群

4、具有长期增殖能力，该类亚群虽然在AML患者中所占的比例很少（约0.2%），但它们却可能是将人类AML 转移至NOD/SCID小鼠的唯一细胞，这些白血病细胞被称为“白血病干细胞”2。 目前，鉴定白血病干细胞存在的主要实验技术采用NOD/SCID小鼠异种移植模型进行，Lapidot及其同事应用这一模型鉴定人类急性髓细胞性白血病(AML )中LSCs的实验方法如下: 将AML 骨髓细胞中分离出的CD34+CD38+和CD34+ CD38-的2个细胞亚群从尾静脉注入经亚致死量照射的NOD/SCID小鼠体内,经48周后以CD45+为标志从受体小鼠骨髓中分离出植活的人类AML 细胞,发现均为CD34+CD

5、38-细胞。它们还能在2次移植受体小鼠体内植活并传给下一代移植受体鼠。此实验显示能将白血病细胞转入受体NOD/SCID 小鼠体内的细胞仅仅存在于CD34+CD38-细胞群体内。这些细胞在受体鼠体内能诱发出除M3 以外的各种亚型的白血病。在2次移植受体鼠体内同样也如此,表明其中存在具有长期自我更新能力的LSCs3。2004年美国斯坦福大学Jamieson及其同事报道，他们从慢性期和急变期慢性粒细胞白血病（CML）患者鉴定出具有自我复制能力的白血病干细胞。令人意外的是，他们发现急变期慢性粒细胞白血病粒细胞-巨噬细胞祖细胞也具有自我复制能力。这些结果提示，CML可能含有两群白血病干细胞：经典的白血病

6、干细胞和急变期粒细胞巨噬细胞祖细胞样干细胞4。急性髓系白血病是最常见的成人白血病之一，主要表现为未成熟原始粒细胞克隆性增殖。日本学者Ishikawa及其同事用新生严重联合免疫缺陷NOD/SCID/IL小鼠建立原代人急性髓系白血病异种移植模型进行白血病干细胞研究。 结果发现其中部分细胞虽然数量极少，却能大量增殖，引发白血病。给发病的实验鼠注射抗癌药物，后来增殖产生的白血病细胞多数死亡，而最早注射入实验鼠体内的细胞却有70%-80%存活了下来。重新分离这些生存下来的细胞，注射入其他实验鼠体内，实验鼠随后也出现了白血病症状，表明这些细胞是具备自我复制并产生白血病细胞能力的白血病干细胞。 进一步研究显

7、示，白血病干细胞的分裂速度较普通癌细胞缓慢，而抗癌药物一般针对增殖速度快的细胞，于是白血病干细胞恰好能躲过抗癌药物的攻击。另外，白血病干细胞集中存在于骨髓中抗癌药物难以达到的区域，这使得它们更难被消灭5。目前，尽管有关白血病干细胞的存在及其在白血病复发和耐药中的作用还有争议，一些学者认为肿瘤生长不需要少数肿瘤干细胞启动6，但多数学者认为白血病干细胞的存在及其在白血病复发和耐药中起着十分重要作用7-10。2 白血病干细胞基本生物学特性增殖动力学对白血病干细胞增殖动力学研究发现，大多数白血病干细胞处在休眠状态。Guzman 及其同事研究发现，在急性髓系白血病中，95 %以上的白血病干细胞处于细胞周

8、期休眠期（G0期），白血病干细胞与相对分化的白血病幼稚细胞的细胞周期的差异,解释了应用细胞周期性化疗药物不能有效清除AML 细胞及治疗AML 获缓解后通常都会复发的原因11。 体外实验研究表明, CD34+CD38- 细胞对干细胞生长因子等细胞因子的反应性差, 难以被细胞因子活化从G0期进入细胞周期12。Dean 等的研究表明由CD34+ CD38- CD123+ 标记的白血病干细胞96%处于细胞分裂周期的G0 期, 处于静止期的LSC避免受到常规细胞周期特异性药物的攻击13。考虑到白血病干细胞增殖动力学特点,有必要对其分子特点进行研究,研发新的针对LSC 的治疗策略, 有效清除LSC ,去除

9、AML 复发的根源,达到根治AML ,长期缓解的目的。与正常造血干细胞的分裂方式相同，肿瘤干细胞可通过对称分裂和不对称分裂来实现其自我更新，对称分裂形成两个相同的干细胞，而不对称分裂由于其细胞质中的调节分化蛋白不均匀地分配，使得一个子细胞不可逆的走向分化的终端成为功能专一的分化细胞；另一个保持亲代的特征，仍作为干细胞保留下来。对称分裂和不对称分裂在肿瘤干细胞增殖动力学中的确切作用迄今不清。Boman 等认为，干细胞不对称分裂可能与肿瘤细胞爆发性增殖相关(进入指数增殖期)14。Morrison等认为干细胞不对称分裂主要是为了控制子代细胞数量，但在肿瘤中的作用仍不清楚15。2.3 白血病干细胞特异

10、性标志到目前为止，还没有白血病干细胞单一特异性标记，但有一些相对特异性标记可以进行联合筛选。大多数髓系白血病干细胞具有一些相似抗原标记。应用白血病干细胞移植于严重联合免疫缺陷NOD /SCID小鼠的实验显示，大部分的AML亚型（除急性早幼粒细胞白血病M3外）的白血病细胞均表达CD34+CD38-或者CD34+CD38+/low表型2, 16。CD123表达于白血病干细胞但不表达于正常造血干细胞17。新近，美国斯坦福大学医学院Weissman及其同事研究发现，CD96可能是人急性髓细胞样白血病(AML)的白血病干细胞的一种细胞表面特异性标志物，有可能成为一种新的针对白血病干细胞特异性药物治疗靶分

11、子。在被检测的29例AML样本中，有19例样本AML白血病干细胞富含CD96阳性细胞显著高于正常骨髓细胞。CD96在AML白血病干细胞的表达在M2比M0/M1或M4/M5样本更常见。在5例样本中的4例，CD96+ AML细胞可移植到受者小鼠的骨髓，而CD96-AML细胞却不能移植18。NF-B是一类重要的转录激活因子，可通过调控细胞因子的基因表达间接抑制自身及其他细胞凋亡，还可通过诱导和上调抗凋亡基因抑制细胞凋亡。在许多肿瘤细胞中存在N F-B 的激活，与肿瘤细胞生长和生存能力增强直接相关。一般活化的NF-B在增殖的恶性细胞表达较多,在休眠状的白血病干细胞群体中表达活化的NF-B是很独特的19

12、。在许多肿瘤细胞,包括淋巴瘤和淋巴细胞白血病中, NF-B的典型功能被认为是抗凋亡,从而赋予肿瘤细胞存活的优势。在正常HSCs中却测不出NF-B的活性。Guzman等研究发现, 在AML-LSC里的转录因子NF-B持续激活,而在正常造血干细胞中未见其表达20。3. 白血病干细胞靶向性治疗临床意义及其策略目前，多数学者支持白血病干细胞在白血病启动、复发以及耐药产生中起着十分重要作用，并认为只有清除白血病干细胞才能根治白血病。但由于白血病干细胞与正常造血干细胞有许多相似之处，使得靶向性清除白血病干细胞具有一定的难度。近年来，已有一些研究利用白血病干细胞一些特性，进行药物筛选与研究。核转录因子NF-

13、B靶向性药物： 已知NF-B白血病干细胞生存必需的因子，在白血病干细胞中呈持续性激活状态,而在正常造血干细胞中未见活化NF-B 的表达。Guzman 等18利用蛋白酶体抑制剂MG-132 处理原代AML 细胞,一方面通过阻止NF-B 负性调节子IKB 的降解,使NF-B表达下调,使CD34+CD38- 细胞发生凋亡;另一方面蛋白酶体抑制剂有效地阻止了与凋亡相关的蛋白如P53 的降解,而促进细胞凋亡。研究还发现MG-132 处理原代AML 细胞在NOD/ SCID 小鼠中的增殖能力受损,而对正常的CD34+CD38- 细胞无影响。因此MG-132 可以特异性清除白血病干细胞。随后，该研究小组发现

14、，小白菊内酯（Parthenolide）是一种能够杀死人类白血病干细胞的天然小分子药物。小白菊内酯能够选择地杀死白血病细胞而不伤害正常的细胞, 研究发现小白菊内酯介导凋亡的分子机制主要是通过抑制NF- B 的活性，特异性的诱导白血病干细胞凋亡, 将会成为靶向清除白血病干细胞的药物，具有进一步开发价值。新近，该研究小组已成功开发出效果更好的小白菊内酯衍生物21。利用白血病干细胞特异性表面抗原：寻找和发现LSC 的特异性细胞表面抗原及其在白血病发生中的生物学作用是目前LSC 研究的重点之一, 从抗体文库中筛选特异性抗原是发现LSC 特异性抗原的有效手段。CD123是IL-3 受体链,是目前发现的具

15、有开发潜力的特征性原,其仅在LSC 表面表达,正常造血干细胞表面不具有此抗原,基于此差异可以发展针对AML LSC的靶向治疗。通过对细胞膜代谢的研究显示,CD123 抗体与CD123 结合内化作用很弱,故不适合将抗CD123 抗体与毒素偶联,将毒素带入细胞内杀伤细胞,而适合将CD123 抗体与同位素偶联进行靶向治疗。CD96是新近发现的又一人急性髓细胞样白血病(AML)的白血病干细胞的一种细胞表面特异性标志物，有可能成为一种新的针对白血病干细胞特异性药物治疗靶分子。干扰白血病干细胞微环境: 白血病干细胞生存与增殖需要特定的微环境。最近研究发现粘附分子CD44 可以介导LSC 在骨髓和脾脏中归巢

16、, 利用一个可以直接粘附在CD44 上的单克隆抗体H90, 可以显著减少人类AML 细胞移植到SCID 小鼠身上的能力22。参考文献:1 Park CH, Bergsagel DE, McCulloch EA. Mouse myeloma tumor stem cells: a primary cell culture assayJ. J Natl Cancer Inst, 1971; 46:411-422.2 Bonnet D, Dick JE. Human acute myeloid leukemia is organized as a hierarchy that originates

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