丹玄口康对槟榔提取液刺激下的人口腔黏膜成纤维细胞增殖及增殖细

1、丹玄口康对槟榔提取液刺激下的人口腔黏膜成纤维细胞增殖及增殖细胞核抗原表达的影响        【摘要】     ：目的 观察丹玄口康对槟榔提取液(Areca Nut Extract,ANE)诱导的人口腔黏膜成纤维细胞(Fibroblasts, FB)的增殖及增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)表达的影响。方法 体外培养人口腔黏膜FB,100 g/mL ANE为诱导剂,10%大鼠丹玄口康药物血清为干预物；用二

2、甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT)法测定细胞增殖速度,用免疫细胞化学法检测PCNA的表达。结果 MTT显示,丹玄口康组的OD值低于ANE刺激组(P<0.01或P<0.05),丹玄口康组免疫阳性细胞数及相对灰度值均低于ANE刺激组(P<0.01或P<0.05)。结论 丹玄口康能够抑制ANE刺激下的人口腔黏膜FB的增殖,下调PCNA的表达。     【关键词】  丹玄口康槟榔提取液成纤维细胞增殖细胞核抗原    Effect of Danxuan Koukang on Prolifera

3、tion and PCNA Production of Human Oral Mucosal Fibroblasts Induced by Areca Nut ExtractLI Yuan-cong, TAN Jin1, CHEN An, et al1.The First Affiliated Hospital, Hunan University of TCM, Changsha 410007, China；2.Hunan University of TCM, Changsha 410007, ChinaAbstract：Objective To study the effect of Dan

4、xuan Koukang (DXKK) drug serum on proliferation and proliferating cell nuclear antigen (PCNA) production of human oral mucosal fibroblasts (FB) induced by areca nut extract (ANE). Methods Human oral mucosal FB were cultured in vitro, 100 g/mL ANE was used as inducement and 10% DXKK drug serum as int

5、ervenor. The cell proliferation rates were measured by MTT assay, PCNA productions were examined by immunocytechemistry. Results MTT assay showed OD value in DXKK groups were significantly decreased compared with the induced group (P<0.05).  Immunocytechemistry showed counts and relative gre

6、y value of PCNApositive cells in DXKK groups were significantly decreased compared with the induced group (P<0.05). Conclusion DXKK can inhibit proliferation and PCNA production of human oral mucosal FB induced by ANE.    Key words：Danxuan Koukang；areca nut extract；fibroblasts；prol

7、iferating cell nuclear antigen    口腔黏膜下纤维化(Oral Submucous Fibrosis,OSF)是一种以胶原纤维堆积为主要病变特征的慢性隐匿性疾病,以口腔硬化、张口受限为主要特征。目前普遍认为咀嚼槟榔与OSF发病密切相关,但其发病机理仍不十分清楚,治疗尚无成熟方法。本研究从中医整体出发,利用现代实验手段,研究丹玄口康对口腔黏膜成纤维细胞(FB)增殖及相关因子增殖细胞核抗原(PCNA)表达的影响,旨在进一步阐明该方药作用的物质基础,揭示该方药抗OSF的作用机理,为临床治疗提供实验依据。1  材料与方法1.1&#

8、160; 主要仪器、试剂及药物    二氧化碳培养箱(M2300,美国),酶标仪(MK3,芬兰),DMEM培养基(GIBCO),二甲基噻唑二苯基四唑溴盐(MTT,Sigma),二甲基亚砜(DMSO,Sigma产品),PCNA免疫组化试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；槟榔提取液(ANE),按文献方法3制备；丹玄口康片,湖南中医药大学第一附属医院药剂科提供,批号20050208；显微镜(Motic),图像分析系统(Motic Images Advanced 3.2)。1.2  丹玄口康药物血清的制备    成年健康SD大鼠

9、30只,随机分为3组：正常组、丹玄口康低剂量组和丹玄口康高剂量组,每组10只,分别以生理盐水、丹玄口康4、12 g/kg(按照体表面积药物剂量换算公式计算,分别相当70 kg成人剂量的1、3倍)灌胃,2次/d,连续5 d。大鼠末次灌胃1 h后,无菌条件下颈动脉采血,室温静置2 h, 1 500 r/min离心10 min制备血清,56 灭活30 min,0.22 m滤器除菌后,用DMEM配制成含10%大鼠血清的培养液备用。1.3  成纤维细胞的培养与槟榔提取液诱导成纤维细胞增殖的浓度    人口腔黏膜FB的培养与鉴定按我们前期实验1介绍的方法进行,并根据

10、前期实验结果确定诱导FB增殖的ANE浓度为100 g/mL。用第34代细胞进行试验。1.4  细胞分组    第1组为正常对照组：10%正常大鼠血清；第2组为ANE刺激组：10%正常大鼠血清100 g/mL ANE；第3组为丹玄口康低剂量组：10%低剂量丹玄口康含药血清100 g/mL ANE；第4组为丹玄口康高剂量组：10%高剂量丹玄口康含药血清100 g/mL ANE。1.5  MTT法检测成纤维细胞增殖活性    细胞以5×104个/mL的密度接种于96孔板中,每组设复孔6个,培养48 h后弃培养液

11、,用无血清DMEM培养液洗后,每孔加入含5 mg/mL MTT的200 L无血清DMEM培养液,37 继续培养4 h。吸净孔内上清液,每孔加入150 L DMSO,振荡10 min,选择490 nm波长,在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值(OD),记录结果并重复2次。每组另设1孔只含培养液不含细胞的空白调零孔。1.6  免疫细胞化学方法检测增殖细胞核抗原的表达    细胞以5×104个/mL的密度接种于贴有盖玻片(经鼠尾胶处理)的24孔板中,培养48 h后,4%多聚甲醛室温固定15 min后进行免疫细胞化学染色,方法按试剂盒说明书进行。脱水、透

12、明、封片。每片取5个视野,在低倍镜下对免疫阳性细胞进行计数并求平均值,在高倍镜下摄取图像传至计算机,采用图像分析系统,测定免疫阳性细胞的灰度值,同时测量背低灰度值,计算其差值的绝对值,即得出免疫阳性细胞的相对灰度值。系统数字化图像的精度为256级,最黑的为0,最白的为255,故反应产物显色越深,灰度值越小,反之灰度值越大。1.7  统计学方法    实验数据用x±s表示,多样本均数比较采用方差分析法,两样本均数比较用t检验。2  结果2.1  丹玄口康对ANE刺激下的成纤维细胞增殖的影响(见表1)表1  丹玄口康对

13、ANE刺激下的FB增殖的影响(略)注：与正常组比较,P<0.01；与ANE刺激组比较,*P<0.05,*P<0.01；与丹玄口康低剂量组比较,#P<0.05(下同)2.2  丹玄口康对ANE刺激下的增殖细胞核抗原表达的影响    免疫细胞化学检测结果显示,PCNA免疫阳性物质在细胞核中表达,正常组细胞中也存在PCNA的表达,但染色较浅。见表2。表2  丹玄口康对ANE刺激下的PCNA表达的影响(略)3  讨论    近来研究表明,FB是OSF发病的主要细胞,在OSF组织增生、纤维化

14、时起重要作用。FB位于口腔黏膜下组织中,是口腔黏膜胶原蛋白合成的主要来源,而OSF病变的实质是胶原纤维等细胞外基质合成增加和降减不足,在口腔黏膜下过度堆积,因此,FB在OSF的形成中发挥着关键的作用2。一方面,在OSF发生中,咀嚼槟榔等刺激直接作用于口腔黏膜下组织,使FB受刺激后,对上皮下与其接触的FB产生细胞毒作用,同时出现上皮下炎性反应,刺激FB、炎性细胞及上皮细胞等释放大量细胞外基质,主要是各种促生长因子,如PCNA等,这些细胞因子形成一个网络,以自分泌或旁分泌方式调控FB增殖,促进其合成和分泌大量的胶原纤维,从而形成OSF；另一方面,槟榔有效成份的刺激可使OSF组织上皮细胞发生改变,表

15、面受体被激活,分泌产生各种促生长因子等活性物质,这些物质又进一步作用于FB,诱导细胞增殖,胶原沉积而导致口腔黏膜纤维化3。因此,如何抑制成纤维细胞的增殖,拮抗和阻断对FB的异常促增殖作用,将成为OSF防治的关键。    本实验运用中药血清药理学的方法研究丹玄口康对ANE刺激下的FB增殖的影响。通过MTT法检测细胞增殖情况,我们发现在丹玄口康含药血清和ANE共同的干预下,口腔黏膜FB的生长受到抑制(含药血清组与ANE刺激组相比,P<0.01或P<0.05),这种抑制作用呈剂量依赖性。而在文献3的实验中我们已经发现,在100 g/mL ANE作用下能显著的

16、促进FB的增殖,这提示丹玄口康含药血清能够剂量依赖性的拮抗ANE对口腔黏膜FB的促增殖作用。在OSF发病的过程中,槟榔中的生物碱可直接作用于口腔黏膜FB,促进其增殖分泌大量的胶原纤维,丹玄口康的这种拮抗作用可能是其防治OSF的原因之一。    PCNA是Mayachi于1978年发现的一种抗原,是DNA聚合酶的辅助蛋白,可以加速DNA聚合酶的作用,其表达水平是反映细胞增殖活性的较好指标；同时,PCNA还是与细胞周期有关的蛋白质,是细胞合成期必不可少的因子。PCNA含量随细胞周期的变化而变化,静止细胞中其含量相当少,G1期明显开始增加,S期达到高峰,G2、M期明显下

17、降,但是静止的细胞在受到血清及多种生长因子刺激后,PCNA表达水平可提高67倍,表明其表达水平直接与细胞增生和DNA合成有关,在DNA合成和细胞增殖调控中起重要作用4。有学者发现PCNA在有细胞增生的口腔黏膜疾病中也有不同程度的表达,其表达的多少与组织异常增生的程度密切相关。在口腔癌前病变中,在口腔黏膜上皮从正常发展至癌的过程中,PCNA量呈现逐渐升高的趋势5。本实验发现：正常培养的口腔黏膜FB存在PCNA的表达,经ANE刺激后FB的PCNA表达增强(ANE刺激组与正常组比较,P<0.01),更进一步证明了在100 g/mL浓度下,ANE能促进FB的增殖。丹玄口康含药血清作用于ANE刺激

18、下的FB后,能够抑制FB的PCNA表达(与ANE刺激组相比,P<0.01或P<0.05)。以上提示,丹玄口康含药血清是通过抑制细胞周期的DNA合成期来发挥抗增殖作用,可能是阻止细胞由G1期往S期过渡,使细胞G1期延长来抑制细胞的增殖,而这种抑制增殖的作用是通过细胞周期的自身调控还是细胞外信号对细胞周期的调控有待进一步的研究。    本实验结果显示,丹玄口康能够抑制OSF的FB增殖,下调PCNA过度表达,其效应呈现剂量依赖性,这可能是其逆转OSF取效的机制之一。    【参考文献】  1 谭 劲,李元聪,陈 明,等.槟榔提取物体外诱导人口腔黏膜成纤维细胞增殖模型的建立J.湖南中医药大学学报,2007,27(3)：1113.2 Trivedy C, Meghji S, Warnakulasuriya KA, et al. Copper stimulateshuman oral fibroblasts in vitro：a role in the pathogenesis of