基因结构与功能

1、分子生物学第二部分分子生物学研究的方法策略与技术支持分子生物学研究的方法策略与技术支持任课教师：肖尚英任课教师：肖尚英基础医学院医学基础医学院医学生物化学与分子生物学研究所生物化学与分子生物学研究所第七章 基因结构与表达分析的基本方法本章内容简介：m序列分析；m 核酸杂交；m 体外扩增；m 核酸测定（存在分析有无、多少）；第一节 DNA序列分析Nucleic Acid Sequence Analysisn核酸序列分析的基本原理方法： 化学裂解法 (Maxam-Gillbert法) 双脱氧末端终止法 (Sanger法)m核苷酸序列测定最早始于20世纪60年代，即Sanger和Brownlee等建

2、立的RNA序列测定技术。m真正意义上的DNA序列分析方法，是在具有极高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE)技术的基础上建立并发展起来的。通过电泳可以分离长度达300500个碱基，而差别仅1个碱基的同系单链核苷酸序列。m70年代初，Sanger建立了第一种直接测定DNA序列的方法加减法，并用该法测定了X174噬菌体DNA的全长5375个核苷酸序列。1977年Sanger又建立了更为简便、精确的“双脱氧核苷酸末端终止法”(dideoxynucleotide chain termination method)测定DNA序列。

3、这种方法迄今仍然是绝大多数实验室中最常用的DNA序列分析方法。m几乎在同一时期，Maxam和Gilbert于1977年建立了另一种快速测序的方法化学降解法。这两种方法虽然原理不同，但是对DNA序列分析技术的快速发展都具有深远的影响。m此后，以双脱氧核苷酸末端终止法为基础，利用与光敏元件相连的计算机系统，建立了荧光DNA序列分析技术，实现了DNA测序过程的自动化。DNA序列分析技术伴随现代分子生物学的发展而不断完善，这项技术已成为生命科学研究工作者探索生命奥秘的重要工具之一。ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶

4、解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长DNADNA的复制的复制ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引物RNA引物DNADNA的复制的复制ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶DNA聚合酶DNADNA的复制的复制

5、一、双脱氧末端终止法m ATP、dATP和ddATP的结构示意图DNA合成反应原理图末端终止部位示意图PhosphodiesterbondP R P R P R P R P R P ROH531 135A1 12 23456APO4 2-H352 2HdideoxynuceotideddNTP Sangers Method: How Terminated Normal LinkingCan not reactJuang RH (2004) BCbasics双脱氧末端终止法测序反应的基本原理和过程m1How DNA Sequence Is Determined?Polyacrylamide Ge

6、l ElectrophoresisATC32PAT32PA32PT A G CTACGATCG32PATCGA32PATCGAT32PATCGATC32PATCGATCG32PATCGATCGA32PATCGATCGAT32PDNA fragments having a difference of one nucleotide can be separated on gel electrophoresisBut these bands cant tell usthe identity of the terminal nucleotidesIf those band with the samet

7、erminal nucleotide can begrouped, then it is possible to read the whole sequenceJuang RH (2004) BCbasicsGATC 测序反应 电泳AACGTGGACTAACGTGGACAACGTGGAAACGTGGAACGTGAACGTAACGAACAAA5 3 正极负极ddGddAddTddCn链末端合成终止法测定DNA序列的原理末端终止测序反应产物电泳区带放射自显影二、化学降解法m化学降解法是建立在对原有DNA的化学降解过程基础之上的。m在化学降解法中，单侧末端标记的DNA片段在5 5组组相互独立的化学反

8、应中分别得到部分降解，其中每一组反应特异地针对某一种或某一类被修饰碱基，因此形成5组带有放射性标记的长短不一的DNA混合物。它们的长度取决于该组反应所针对的碱基在原有DNA片段上的位置。m然后，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分别分离这5组DNA混合物，再通过放射自显影来检测末端标记DNA链的电泳区带位置。Maxam-Gilbert 法所用的化学技术碱基特异修饰方法GPh8.0,用硫酸二甲酯对 N7进行甲基化,使 C8-C9键对碱基裂解有特殊敏感性A+GpH2.0 哌啶甲酸可使嘌呤环的N原子化,从而导致脱嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鸟嘌呤的糖苷键C+T肼可打开嘧啶环,后者重新环化成五元环后易除去C1.5 m

9、ol/L NaCl存在时,可用肼除去胞嘧啶化学法测序实例哌啶Sangers Method:Maxam-Gilberts Method:How to Obtain DNA Fragments32P32PATCGATCG32PATCGATATCGATATCGTAGCTAGCTATAGCTAGCTATAGCTAGCTAATCGA32PSpecific Reaction to G ATCGSTOPATerminatedKeep on goingBiosynthetic methodChemical methodTemplateorNon-radioactive(invisible)32PA,T,C,G

10、AAnalogueDestroy CleavageDestroy CleavageATCGATCGATProducing various fragmentsJuang RH (2004) BCbasics三、三、Sanger第一步：加入复制终止剂荧光检测探头电泳，看谁跑得快荧光偶联法自动DNA测序结果四、新一代DNA测序技术m自学第二节 核酸分子杂交技术Nuclic Acid Molecular Hybridization杂交简介m1969年，Pardue等建立了细胞原位杂交技术。m1975年，Southern建立了检测DNA的southern印迹杂交技术。m1977年，Stark建立了检测m

11、RNA的Northern印迹杂交技术。m随后，在液体介质中进行的分子杂交技术，如核酸酶S1保护分析法、RNA酶保护分析法、抑制性消减杂交等技术也得到了充分发展。m分子杂交是研究核酸的有力工具，在分子克隆、基因诊断、基因表达分析、核酸序列分析等方面发挥着重要作用。核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最广泛应用的技术之一，它的应用大大地推进了分子生物学的迅猛发展。一、核酸分子杂交的原理m1.变性（denaturation）m2.复性（renaturation)m3.杂交（hybridization）1.核酸的变性m维系DNA双股螺旋的主要力量是氢键和疏水作用力。其中氢键是一种次级键，能量较低，因此，

12、加热、强酸和强碱、有机溶剂（如甲醛、甲酰胺）及高盐等条件都可破坏DNA二级结构，DNA的双螺旋结构解旋，两条链完全解离，但未破坏其一级结构，此过程称为DNA的变性(denaturation)。m实验室中常用的使DNA变性的方法是加热。由于GC碱基对之间形成3个氢键，A=T碱基对之间为2个氢键，因此DNA分子中GC配对越多，解链所需的温度就越高。DNADNA变性的本质是双链间氢键的断裂变性的本质是双链间氢键的断裂例：变性引起紫外吸收值的改变例：变性引起紫外吸收值的改变DNA的紫外吸收光谱的紫外吸收光谱增色效应：增色效应：DNA变性时其溶液变性时其溶液OD260增高的现象。增高的现象。目目 录录m

13、当核苷酸摩尔数相同时，A260值大小有如下关系：m单核苷酸单链DNA双链DNA，这种关系称为DNA的减色效应(hypo-chromic effect)；m在DNA变性过程中，随着碱基暴露程度的增加（分子内的共轭双键暴露程度增加），其溶液的A260值增高的现象称为增色效应(hyperchromic effect)；mDNA变性从开始到完全解链，只是在一个相对窄的温度范围内完成，在这个温度范围内，A260值达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度(melting temperature,Tm);此时，DNA分子内50%的双链结构被打开。mDNA链越长，Tm值越高；DNA分子中G和C的含量越高

14、，Tm值越高。热变性解链曲线：解链曲线：如果在连续加热如果在连续加热DNADNA的过程中以温的过程中以温度对度对A260（absorbance，A，A260代表溶液在代表溶液在260nm260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线链曲线。目目 录录 Tm：变性是在一个相变性是在一个相当窄的温度范围内完成，当窄的温度范围内完成，在这一范围内，紫外光在这一范围内，紫外光吸收吸收增加增加值值达到达到最大最大增增加加值值的的一半一半时的温度称时的温度称为为DNA的解链温度，又的解链温度，又称融解温度称融解温度(melting temperature, Tm)

15、。其大小与其大小与G+C含量成正含量成正比。比。目目 录录2.核酸的复性m变性的两条互补DNA单链在适当条件下重新缔合形成双链的过程称为复性(renaturation)或退火。m复性并不是变性反应的简单逆反应过程。复性的过程是相当复杂的。m变性过程可以在一个极短的时间内迅速完成，而复性却需要相对较长的时间才能完成。如果使热变性的溶液迅速冷却，则只能形成一些不规则的碱基对，而不能立即恢复DNA双链的原有结构。m但是，将此变性的DNA溶液在低于Tm值25的温度下维持相当长的一段时间，则可回复到天然的双链结构状态。复性RNADNA3.核酸的杂交m如果把不同的DNA链放在同一溶液中作变性处理，或把单链

16、DNA与RNA放在一起，只要有某些区域有形成碱基配对的可能，它们之间就可形成局部的双链，这一过程被称为核酸杂交( hybridization)。m生成的核酸双链称为杂交双链。m核酸探针是指标记有放射性或带有其他标记物的单链多聚核苷酸片段，用于检测核酸样品中的特定核苷酸序列。m标记的核酸探针是核酸分子杂交、DNA序列测定等技术的基础，已被广泛应用于分子生物学领域中的克隆筛选、酶切图谱制作、DNA序列测定、基因点突变分析及疾病的临床诊断等方面DNA-DNA杂交双链分子杂交双链分子变性变性 复性复性 不同来源的不同来源的DNA分子分子（一）印迹技术利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到NC等各

17、种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为“blotting”，译为印迹技术。 用放射性核素、生物素或荧光染料标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸链被称为“探针”，探针可以与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否有同源的核酸分子存在。 （二）探针技术印迹技术的类别及应用（一）DNA印迹 (Southern Blotting)（二）RNA印迹 (Northern Blotting)（三）蛋白质的印迹 (Western Blotting)用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。 用于RNA的定性定量分析。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。三种印迹技术的比较二、

18、Southern印迹杂交Southern印迹杂交印迹杂交( (Southern blotting)是指将电泳分离的待是指将电泳分离的待测测DNADNA片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程，是目前最常用的一种中标记的核酸探针进行杂交的过程，是目前最常用的一种核酸分子杂交方法。核酸分子杂交方法。19751975年，英国爱丁堡大学的年，英国爱丁堡大学的Southern首创了这一方法，并称首创了这一方法，并称之为之为Southern印迹转移。印迹转移。利用利用Southern印迹杂交可进行克隆基因的酶切图谱分析、基印

19、迹杂交可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性和定量分析、基因突变分析及限制性片段因组基因的定性和定量分析、基因突变分析及限制性片段长度多态性分析长度多态性分析(RFLP)(RFLP)等。等。目前用于印迹转移的固相支持物有硝酸纤维素膜（目前用于印迹转移的固相支持物有硝酸纤维素膜（NC膜）、膜）、尼龙膜、化学活化膜和滤纸等尼龙膜、化学活化膜和滤纸等。Southern印迹的基本步骤m(1)制备基因组DNAm(2)用限制性内切核酸酶消化基因组DNAm(3)适当浓度的琼脂糖凝胶电泳分离DNA酶切片段m(4) Southern印迹转移前的凝胶预处理m(5) Southern印迹转移m(6)用标记的

20、核酸探针与转移到固相支持物上的核酸片段进行杂交m(7)杂交结果的显示（a）（b）（c）（d）（e）基因组基因组DNADNA限制片段限制片段硝酸纤维素滤膜硝酸纤维素滤膜同探针同源杂交的同探针同源杂交的基因基因DNA片段片段X光底片光底片放射自显影照片三、Northern印迹杂交mNorthern印迹杂交(Northern blotting)是指将RNA变性及电泳分离后，将其转移到固相支持物上，然后利用杂交反应来鉴定其中特定mRNA分子的含量及其大小的过程。m1977年，Stark建立了这一方法，被对应地称为Northern印迹杂交。Northern印迹杂交可以对mRNA进行定性和定量分析，即基因

21、表达分析。mNorthern印迹杂交除了在样品的制备、凝胶电泳分离及凝胶的处理步骤与Southern印迹杂交不同外，其他步骤与Southern印迹杂交基本一致。四、斑点杂交和狭缝印迹杂交m斑点杂交斑点杂交(dot blotting)和狭缝印迹杂交狭缝印迹杂交(slot blotting)是指RNA或DNA变性后直接点样于硝酸纤维素膜或尼龙膜上，然后再与相应的探针杂交并显示结果，除无需电泳分离外，其整个过程与Southern印迹杂交基本相同，用于基因组中特定基因及其表达的定性及定量研究，称为斑点杂交。m斑点杂交也是分子生物学实验中常用的技术之一。与Southern印迹杂交及Northern印迹杂

22、交相比，其优点是简单、迅速；可以在同一张膜上同时进行多个样品的检测；对于核酸粗提样品的检测效果也较好。m其缺点是不能确定所测基因或基因片段的分子质量大小，而且特异性不高，有一定比例的假阳性五、原位分子杂交m组织细胞的核酸原位分子杂交(in situ hybridization)是用已标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核酸互补序列杂交，从而对组织细胞中的核酸进行定性、定位和相对定量分析。m这一方法已被广泛应用于组织细胞中mRNA及病毒DNA和RNA的检测、特定基因在染色体上的定位及基因转移（易位）效果分析等领域m核酸原位分子杂交的基本原理仍是根据碱基互补配对原则，在一定条件下使两条互补核酸单

23、链形成双链复合体。m可用放射性核素或非放射性物质（如生物素、辣根过氧化物酶、荧光素等）标记核酸探针，与细胞涂片、染色体压片或组织切片上具有互补序列的单链DNA或RNA形成双链结构（杂交），然后通过放射自显影或激发荧光、酶底物显色等方法检测特定核酸分子所在的部位；还可利用显微分光光度法进行定量分析；也可将显微镜和计算机联用，把激发荧光信号数字化，由计算机进行定性和定量分析荧光原位杂交原理示意荧光原位杂交原理示意 荧光原位杂交过程荧光原位杂交过程 急性骨髓白血病急性骨髓白血病10、11号染色体间易位号染色体间易位10、11号染色体易发生号染色体易发生断裂的基因断裂的基因(MLL)位点位点荧光原位杂

24、交荧光原位杂交m将标记的核酸探针与将标记的核酸探针与细胞或组织中的细胞或组织中的核酸进行杂交，核酸进行杂交，称为原位杂交。称为原位杂交。m特点特点 能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究。 不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高。 能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态。Florescence in-situ hybridization, FISH核酸原位杂交的基本步骤核酸原位杂交的基本步骤m细胞或组织的固定：载玻片细胞或组织的固定：载玻片m组织细胞

25、杂交前的预处理组织细胞杂交前的预处理 用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质用去垢剂或蛋白酶除去核酸表面蛋白质m探针的选择和标记探针的选择和标记m杂交杂交m杂交结果检测杂交结果检测FISH的基本原理m是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。m由于由于DNADNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂线性排列，因而可以将探针直接与染色体

26、进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位交从而将特定的基因在染色体上定位。m与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。等特点，因此在分子细胞遗传学领域受到普遍关注。m目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。诊断、肿瘤遗传学

27、和基因组进化研究等许多领域。 六、液相杂交m液相杂交(solution hybridization)是将标记的探针与待测样品置于同一溶液体系中，即杂交反应在一个均匀的液相中进行，互补的碱基序列彼此配对形成杂交分子，杂交反应完成后，以含变性剂（通常为尿素）的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离并进行信号显示。第三节 聚合酶链反应Polymerase Chain Reaction(PCR)m聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是K.Mullis于1985年发明的一种模拟天然DNADNA复制复制过程的核酸体外扩增技术。mPCR技术的发明使人们梦寐以求的体外无限扩增核酸片段的愿

28、望成为现实。m耐热Taq DNA聚合酶的发现实现了PCR的完全自动化，从此，PCR及其相关技术更以惊人的速度发展，迅速地应用于医学、生物学、考古学等各学科领域PCR PCR 可以把可以把 数数量放大量放大染色体PCR 基因放大连琐反应一、一、PCRPCR反应的基本原理反应的基本原理PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35解旋酶解链酶DNA解旋解链合成引物子链延长DNADNA的复制的复制PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCG

29、ATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5引物酶引物酶RNA引物RNA引物DNADNA的复制的复制PCR技术简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明ATCGCGATAGCGTAGCTGCGACCTAGC53TAGCGCTATCGCATCGACGCTGGATCG35DNA解旋解链合成引物子链延长GGAUCG5AUCGCG5TAGCGCTATCGCATCGACGCT3ATAGCGTAGCTGCGAGGATCG3DNA聚合酶DNA聚合酶DNADNA的复制的复制PCR技术

30、简史DNA的复制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明m19711971年，年，KhoranaKhorana提出：经过提出：经过DNADNA变性，变性，与合适引物杂交，用与合适引物杂交，用DNADNA聚合酶延伸引聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆物，并不断重复该过程便可克隆tRNAtRNA基基因。因。m但由于测序和引物合成的困难，以及但由于测序和引物合成的困难，以及7070年代基因工程技术的发明使克隆基因成年代基因工程技术的发明使克隆基因成为可能，所以，为可能，所以，KhoranaKhorana的设想被人们遗的设想被人们遗忘了忘了核酸体外扩增的设想核酸体外扩增的设想PCR技术简史DNA的复

31、制核酸体外扩增的设想聚合酶链反应的发明m19851985年，美国年，美国PE-CetusPE-Cetus公司的公司的MullisMullis等人发明了聚等人发明了聚合酶链反应（合酶链反应（PCRPCR）m基本原理是在试管中模拟细胞内的基本原理是在试管中模拟细胞内的DNADNA复制复制m最初采用最初采用E-coli DNAE-coli DNA聚合酶进行聚合酶进行PCRPCR，由于该酶，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错m耐热耐热DNADNA聚合酶的应用使得聚合酶的应用使得PCRPCR能高效率的进行，能高效率的进行，随后随后PE-CetusPE-C

32、etus公司推出了第一台公司推出了第一台PCRPCR自动化热循自动化热循环仪环仪m19931993年，年，MullisMullis等因此项技术获诺贝尔化学奖等因此项技术获诺贝尔化学奖聚合酶链反应的发明聚合酶链反应的发明 聚合酶链反应的发明聚合酶链反应的发明PCRPCR应用应用PCR应用应用引物引物引物引物聚合酶链反应的发明聚合酶链反应的发明XX聚合酶链反应的发明聚合酶链反应的发明因此因此PCR仪也称热循环仪仪也称热循环仪 Thermal Cycler聚合酶链反应的发明聚合酶链反应的发明PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点标准的标准的PCRPCR反应体系反应体系4 4种种dNTP

33、dNTP混合物混合物 各各200umol/L200umol/L引物引物 各各1010100pmol100pmol模板模板DNA DNA 0.10.12ug2ugTaq DNATaq DNA聚合酶聚合酶 2.5u2.5uMgMg2+ 2+ 1.5mmol/L1.5mmol/L1234522557294时间（min）温度（）PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点适温延伸3高温变性1低温退火2重复1-3步25-30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCRPCR的基本原理的基本原理mPCR反应条件mPCR过程mPCR

34、的特点1234522557294时间（min）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA95PCRPCR的基本原理的基本原理mPCR反应条件mPCR过程mPCR的特点 55引物1引物2DNA引物PCRPCR的基本原理的基本原理mPCR反应条件mPCR过程mPCR的特点引物1引物2DNA引物 72Taq酶Taq酶PCRPCR的基本原理的基本原理mPCR反应条件mPCR过程mPCR的特点第1轮结束 95第2轮开始PCRPCR的基本原理的基本原理mPCR反应条件mPCR过

35、程mPCR的特点095 55 72TaqTaqTaqTaqPCRPCR的基本原理的基本原理mPCR反应条件mPCR过程mPCR的特点72第2轮结束PCRPCR的基本原理的基本原理mPCR反应条件mPCR过程mPCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点m灵敏度高n 皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平n 能从100万个细胞中检出一个靶细胞n 病毒检测的灵敏度可达3个RFUn 细菌检测的最小检出率为3个细菌m简便、快速n 一次性加好反应液，24 小时完成扩增n 扩增产物一般用电泳分析

36、m对标本的纯度要求低1.血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNAPCR的扩增效率m在指数扩增期，扩增产物的量取决于最初靶DNA的数量、PCR扩增效率及循环次数。公式y =A (1+E)n可描述它们之间的关系，式中y表示扩增产物的量，A代表最初靶DNA分子的数量，E代表PCR扩增效率，n代表循环次数。m扩增效率对扩增程度影响较大：m当 扩 增 效 率 为 1 0 0 % 时 ， 2 5 个 循 环 后 ，y=225A=33554432A：m当效率为90%时，y=l.925A =9307649A，扩增产物为前者的28%。m从图7-10中可以看出，比两引物限定区长的延伸产物（又称为

37、引物延伸产物）仅能发生在以原始模板DNA为模板的扩增过程中，第一个循环扩增后这种引物延伸产物仅增加2条，即以倍数形式扩增，当起始模板数为A、n个循环后，理论上有An2个拷贝的引物延伸产物产生。这种产物极其微量，在电泳中是无法检测到的。平台期与平台效应m实际上，PCR扩增反应并不是无限的。经过一定数量的循环后，随着产物的对数累积趋于饱和，DNA片段不再呈指数积累，而是进入线性增长期或静止期，此过程称为平台效应(plateau effect)。根据反应条件和热循环，下列因素与平台期有关。引物、dNTP快速掺入底物中，浓度降低，掺入速率减慢。随着产物的增加，酶与模板的比例下降。当合成的DNA量超过反

38、应体系中DNA聚合酶在限定延伸时间内所能复制的能力时，底物便过量了，这时，反应产物便不再以指数形式增加。在2.5U Tag DNA聚合酶/l00 ul体系中，产物DNA约lug时(相当于3 nmol dNTP)便出现底物过量。非特异性产物或引物二聚体与反应物的竞争。产物的再结合。变性后的单链DNA片段在引物退火前即自身配对结合，这种抑制作用是因为分支迁移和引物被取代，还是因为DNA聚合酶的无效取代合成所致，目前尚不清楚。当产物浓度达到l0 pmol/ul时常出现这种限制效应，而且很难避免，除非稀释反应溶液。二、耐热的DNA聚合酶m早期在PCR技术中使用的是大肠杆菌DNA聚合酶工的大片段，即Kl

39、enow片段，延伸温度为37。由于Klenow片段在95时完全失活，因此需要在每轮循环变性步骤后再添加新酶。同时，由于Klenow片段聚合反应温度偏低，使非特异性产物增多，受DNA二级结构影响较大，聚合反应不完全。改用T4 DNA聚合酶，效果也无明显改善。直至1987年发现了热稳定Taq DNA聚合酶才使PCR技术有了重大发展。Taq DNA聚合酶能经受95以上高温而不失活，同时它催化的聚合反应的最适温度为7080。m现已发现多种耐热DNA聚合酶，如Tth DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶等。其中以Taq DNA聚合酶应用最为广泛。三、PCR引物设计的原则m1长度及碱

40、基分布 m2引物之间及引物自身的碱基序列m3引物3端 m4引物5端 m5二级结构区 m6简并引物 图7-11A表示引物与引物之间或引物与模板的非引物结合部位部分互补。那么，DNA聚合酶的5-3外切核酸酶活性可能将5端的碱基切除；同时，DNA聚合酶也可发挥5-3聚合活性，此即发生了非特异性扩增。图7-11B表示引物形成3 端突出的发夹结构，DNA聚合酶发挥5-3 外切核酸酶活性，切去引物5端的碱基。图7-11C表示引物形成5端突出发夹结构，DNA聚合酶将发挥5-3 聚合活性。图7-11D表示引物间3 端互补黏合，从3端发生模板依赖性延伸，形成引物二聚体。这样形成的二聚体是非常有效的PCR扩增模板

41、；如果发生在早期PCR循环，可以很快成为主要的PCR产物。四、PCR反应条件的优化五、常用的PCR改进技术m（一）反转录-PCRm反转录-PCR (reverse transcription PCR，RT-PCR)是一种快速、简便、敏感性极高的检测RNA的方法。m其原理是先在反转录酶的作用下，以mRNA为模板合成cDNA，再以此cDNA为模板进行PCR反应(图7-12)。这样，低丰度的mRNA通过RT-PCR得以扩增，便于检测。mRT-PCR中的关键步骤是RNA的反转录，要求RNA模板必须是完整的，且不含DNA、蛋白质等杂质。m常用的反转录酶有两种，即鸟类成髓细胞性白血病病毒(avian my

42、eloblastosis virus，AMV)反转录酶和莫洛尼鼠类白血病病毒(Moloney murlne leukemia virus，MMLV)反转录酶（二）、定量RT-PCRm定量RT-PCR(quantitative RT-PCR，QRT-PCR)是当前精确定量分析基因表达的一种最快速、敏感的方法。与传统的RNA分析法相比具有敏感度高、特异性强及能快速分析大量样本等优点。m由于在PCR扩增的指数期内很小的扩增效率的改变会极大地影响其产量，所以RT-PCR很难获得数量信息。如果设立一定的RNA竞争性参考标准，将能利用RT-PCR对mRNA水平进行半定量或绝对定量分析选择内源性基因模板标准

43、：m内源性基因模板标准是选用在组织中普遍表达、表达量比较恒定的一类mRNA。编码这些mRNA的基因都是一些保守性强的管家基因，如2-微球蛋白、-肌动蛋白、核糖体蛋白、翻译延长因子、二氢叶酸还原酶和磷酸甘油醛脱氢酶等基因（三）实时荧光定量PCRm定量定量PCRPCR概念概念m以外参照或内参照为标准，通过对以外参照或内参照为标准，通过对PCRPCR终产物终产物的分析或的分析或PCRPCR过程的监测，对过程的监测，对PCRPCR起始模板量起始模板量的的定量定量 PCR 反应过程监测 n高浓度高浓度/ /高效率高效率n高浓度高浓度/ /低效率低效率n低浓度低浓度/ /高效率高效率N N: :扩增分子的

44、数目扩增分子的数目n n: :扩增循环的次数扩增循环的次数log-phase analysislog-phase analysisN Nn nend-point analysisend-point analysisPCR PCR 和定量问题定量定量PCRPCR与定性与定性PCRPCR测定测定指数扩增期指数扩增期扩增的平台期扩增的平台期常规PCRPCR与定量PCRPCR的比较 常常规规PCR 定定量量PCR 反反应应方方式式 2步步法法 3步步法法 2步步法法 3步步法法 反反应应液液成成分分 dNTP，引引物物，模模板板，酶酶 dNTP，引引物物，模模板板，酶酶，探探针针，参参照照 结结果果检

45、检测测 琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳 ELISA，或或实实时时荧荧光光检检测测 结结果果性性质质 定定性性 定定量量，或或定定性性 结结果果准准确确性性 无无法法区区别别假假阳阳性性假假阴阴性性 有有效效识识别别假假阳阳性性假假阳阳性性 荧光定量PCRPCR高灵敏性高灵敏性光谱技术光谱技术高精确性高精确性高灵敏性高灵敏性高特异性高特异性高精确性高精确性DNA杂交杂交高特异性高特异性淬灭基团R荧光定量PCR示意图模板DNADNA探针RQQ报告基团Taqman 技术（2）m原理：原理： 当溶液中有当溶液中有PCRPCR产物时，该探针可与模板的特异序列结合产物时，该探针可与模板的特异序列结合 当当T

46、aqTaq酶靠近探针时，激活了酶靠近探针时，激活了TaqTaq酶的外切酶活性，将探针酶的外切酶活性，将探针55的的R R切下，切下，R R基团发出荧光基团发出荧光 根据荧光强度计算初始模板的数量根据荧光强度计算初始模板的数量 特异性荧特异性荧光双标记光双标记探针探针 Taq酶酶 5353外切酶活外切酶活性性TaqMan实时荧光定量PCR分子信标实时荧光定量PCRTaqman 技术（4）m方法学评价：方法学评价： 不足不足 荧光淬灭难以彻底，本底较高荧光淬灭难以彻底，本底较高 定量时受酶性能影响定量时受酶性能影响570077007000 Molecular beacon 法技术（1）m罗氏公司开

47、发罗氏公司开发m原理：原理： 将荧光分子（将荧光分子（R R基团）和荧光淬灭分子（基团）和荧光淬灭分子（Q Q基团）基团）分别标记在可与同一模板相邻的序列杂交的两个分别标记在可与同一模板相邻的序列杂交的两个不同探针上不同探针上 杂交后，两个探针上的杂交后，两个探针上的R R基团与基团与Q Q基团紧密相邻，基团紧密相邻， R R基团发出的荧光被基团发出的荧光被Q Q基团淬灭基团淬灭 荧光淬灭程度与起始模板数量成反比荧光淬灭程度与起始模板数量成反比Molecular beacon 法技术（2）Molecular beacon 法技术（3）m方法学评价：方法学评价： 优点优点 淬灭效率高淬灭效率高

48、不足不足 由于两个探针结合于模板上，影响扩增效率由于两个探针结合于模板上，影响扩增效率 两个探针合成成本高两个探针合成成本高其它改进的PCR技术m（四）、反向PCRm（五）、Alu-PCRm（六）、不对称PCRm（七）、长片段PCRm（八）、巢式PCRm（九）、多重PCRm（十）、固相锚定PCRm（十一）、原位PCR第四节 基因芯片和微阵列技术Gene chip & Microarray 生物芯片生物芯片( (biochip or bioarray) )的概念源于半导的概念源于半导体、计算机芯片。体、计算机芯片。 生物芯片生物芯片是指通过微电子、微加工技术在芯片表是指通过微电子、微加工

49、技术在芯片表面构建的微型生物化学面构建的微型生物化学分析系统分析系统，以实现对细胞、，以实现对细胞、DNADNA、蛋白质及其他生物组分的快速、敏感、高效的、蛋白质及其他生物组分的快速、敏感、高效的的处理。的处理。 生物芯片生物芯片是指包被在是指包被在固相载体固相载体如硅片、玻璃、塑如硅片、玻璃、塑料和尼龙膜上的料和尼龙膜上的DNADNA微阵列、寡核苷酸微阵列和蛋白微阵列、寡核苷酸微阵列和蛋白质微阵列。质微阵列。m 生物芯片的生物芯片的微阵列微阵列是由生物活性物质以点阵是由生物活性物质以点阵（array）的形式有序地固定在固相）的形式有序地固定在固相载体载体上形成的，上形成的，在一定的条件下进行

50、生化在一定的条件下进行生化反应反应，反应结果用化学荧，反应结果用化学荧光法、酶标法、同位素法光法、酶标法、同位素法显示显示，再用扫描仪等光学，再用扫描仪等光学仪器进行仪器进行数据采集数据采集，最后通过专门的计算机软件进，最后通过专门的计算机软件进行行数据分析数据分析。slide生物芯片分类D N A C h ip s P ro te in C h ip sL a b C h ip sB io c h ip s按阵列活性物质分按阵列活性物质分m按用途分按用途分 1.1.样品制备芯片样品制备芯片 2.2.生化反应芯片生化反应芯片 3.3.检测芯片检测芯片m芯片实验室芯片实验室是生物芯片技术发展的最

51、终目标是生物芯片技术发展的最终目标m基因芯片(Gene chip)技术是指通过微阵列(Microarray)技术，将高密度DNA片段阵列通过高速机器人或原位合成方式，以一定的顺序或排列方式使其附着在如玻璃片等固相表面，以荧光标记的DNA探针，借助碱基互补杂交原理，进行大量的基因表达及监测等方面研究的最新革命性技术基因芯片基因芯片（Gene chip）Types of DNA ChipsE x p re s s io n C h ip s G e n o m ic C h ip s S e q u e n c in g C h ip sD N A C h ip s 是利用是利用DNADNA分子可

52、以变性、杂交的特性，通过分子可以变性、杂交的特性，通过DNADNA芯芯片上固定的探针或样品片上固定的探针或样品DNADNA与游离的样品与游离的样品DNADNA或探针杂交或探针杂交来推断未知的靶分子，杂交发生与否可采用荧光标记技来推断未知的靶分子，杂交发生与否可采用荧光标记技术检测。术检测。 DNADNA芯片技术比其他芯片技术更为成熟，应用广泛，芯片技术比其他芯片技术更为成熟，应用广泛，是生物芯片中极有潜力的一种芯片。是生物芯片中极有潜力的一种芯片。DNA芯片芯片基因芯片芯片实验室 是一种微型化、无污染、全功能的是一种微型化、无污染、全功能的“实实验室验室”，包含了运算电路、显示器、检测以，包含

53、了运算电路、显示器、检测以及控制系统，在及控制系统，在“随身听随身听”大小的一间实验大小的一间实验室里可一次完成芯片制备、样品处理、靶分室里可一次完成芯片制备、样品处理、靶分子和探针分子杂交亲和，以及信号检测、分子和探针分子杂交亲和，以及信号检测、分析。析。 芯片实验室芯片实验室将传统的生物（化学）的样品制将传统的生物（化学）的样品制备、生化反应、数据检测的三个步骤集成于一体，备、生化反应、数据检测的三个步骤集成于一体，缩小构成芯片上的实验室，目前国外已成功地将缩小构成芯片上的实验室，目前国外已成功地将样品分离、样品分离、DNADNA提取、提取、PCRPCR反应、反应、 DNADNA杂交测序检

54、杂交测序检测这几个步骤在一个或几个芯片构成的密闭系统测这几个步骤在一个或几个芯片构成的密闭系统中一气完成。中一气完成。 具有防污染、自动化，体积小、便于携带的具有防污染、自动化，体积小、便于携带的特点，可大大提高分析速度和多样品分析能力。特点，可大大提高分析速度和多样品分析能力。芯片实验室芯片实验室生物芯片的研究进展与应用 与集成电路芯片相比（分析对象是电与集成电路芯片相比（分析对象是电信号，使用是永久性的），生物芯片分析信号，使用是永久性的），生物芯片分析的对象是生物分子，使用是的对象是生物分子，使用是一次性一次性的。的。 生物芯片的使用非常广泛，包括，基因测序，疾生物芯片的使用非常广泛，包

55、括，基因测序，疾病诊断和预防，中药有效成分的鉴定、筛选及药理作病诊断和预防，中药有效成分的鉴定、筛选及药理作用，环境与食品卫生检测，司法鉴定等。用，环境与食品卫生检测，司法鉴定等。 用于高通量药物筛选，利用生物芯片可比较正常用于高通量药物筛选，利用生物芯片可比较正常组织和病变组织大量相关基因表达的变化，从而发现组织和病变组织大量相关基因表达的变化，从而发现一组疾病相关基因作为药物筛选靶标。一组疾病相关基因作为药物筛选靶标。DNA芯片芯片遗传作图遗传作图基因分型基因分型重测序重测序新基因寻找新基因寻找药物筛选药物筛选疾病诊断疾病诊断.基因表达谱基因表达谱基因突变基因突变Agricultural

56、biotechLivestock diagnosticsor gradingHuman diagnosticsEnvironmental testingFood testingBasic ResearchIdentity testingPersonalized medicinemDNADNA芯片技术是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者芯片技术是指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直接将大量直接将大量DNADNA探针以显微打印的方式有序的固定化于支探针以显微打印的方式有序的固定化于支持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号的检测分析，即可得

57、出样品的遗传信息（基因序列及表达检测分析，即可得出样品的遗传信息（基因序列及表达的信息）。的信息）。m19951995年年stanford大学的大学的M.Schena和和P.O.Brown等发表第一等发表第一篇基因为矩阵论文，用于基因表达谱研究。篇基因为矩阵论文，用于基因表达谱研究。 DNA芯片技术的概念m用原位合成或者探针打印制备的用原位合成或者探针打印制备的DNADNA芯片，其固定的探针可以是芯片，其固定的探针可以是cDNAcDNA、寡核苷酸、或来自基因组的基因片断，且这些探针固定化于芯片上寡核苷酸、或来自基因组的基因片断，且这些探针固定化于芯片上形成基因探针阵列。形成基因探针阵列。m因此

58、，因此，DNADNA芯片又被称为：芯片又被称为：m 基因芯片基因芯片（gene chips）m DNA DNA阵列阵列（DNA array）m cDNA cDNA芯片（芯片（cDNA chips）m 寡核苷酸阵列（寡核苷酸阵列（oligonucleotide array）等。等。m DNADNA芯片在基因表达谱（芯片在基因表达谱（gene expression profile）、功能基因组、疾病基因能诊断等基）、功能基因组、疾病基因能诊断等基础研究及临床应用中已经显示出其重要的理论础研究及临床应用中已经显示出其重要的理论意义和广泛的应用前景意义和广泛的应用前景DNA芯片的主要类型mDNA芯片根

59、据其制备方式分为两大类：m 原位合成芯片原位合成芯片( (synthetic genechip) )m DNA DNA微集阵列微集阵列 ( (DNA microarray) )原位合成芯片m采用显微光蚀刻技术等在芯片的特定部位原位合成寡核采用显微光蚀刻技术等在芯片的特定部位原位合成寡核苷酸而制成的芯片。苷酸而制成的芯片。m这种芯片的集成度高，可达这种芯片的集成度高，可达10105 5-4-4* *10105 5点阵点阵/cm/cm2 2。m但是合成的寡核苷酸探针长度短，一般为但是合成的寡核苷酸探针长度短，一般为8-208-20 ntnt，最长，最长为为5050 ntnt。因此需用多个相互重叠的

60、探针片断进行检测，。因此需用多个相互重叠的探针片断进行检测，才能对基因进行准确的鉴定。才能对基因进行准确的鉴定。DNA微集阵列芯片m将预先制备的将预先制备的DNADNA片断以显微打印的方式有序的固化于支片断以显微打印的方式有序的固化于支持物的表面而制成的芯片。持物的表面而制成的芯片。m这类芯片的集成度相对较低，可达这类芯片的集成度相对较低，可达10104 4-10-105 5点阵点阵/cm/cm2 2。m使用的探针组的来源比较灵活，可以使合成的寡核苷酸使用的探针组的来源比较灵活，可以使合成的寡核苷酸片断，也可以是来自基因组的较长的片断；可以使双链，片断，也可以是来自基因组的较长的片断；可以使双链，也可