第六章薄层色谱和柱色谱分离制备

1、有机物的分离与剖析有机物的分离与剖析石化学院石化学院第四章第四章 薄层色谱和柱色谱分离制备薄层色谱和柱色谱分离制备4.1 概述概述一一.色谱法色谱法利用不同的物质在两相（一是固定不动的固定相，另一个是流动着的移动相）中不同的平衡分配或吸附系数来进行的一种分离方法。 1906年俄国植物学家年俄国植物学家Tswtt创立色谱法创立色谱法（chromatography）实质：分离实质：分离 目的：定量分析目的：定量分析基本原理：基本原理： 利用混合物中各组分在利用混合物中各组分在某一物质某一物质中的吸附或中的吸附或溶解性能（即分配）的不同，或其他亲和作用的差溶解性能（即分配）的不同，或其他亲和作用的差

2、异，使混合物的异，使混合物的溶液溶液流经该种物质，进行反复的吸流经该种物质，进行反复的吸附或分配等作用，从而将各组分分开。附或分配等作用，从而将各组分分开。流动相固定相根据操作条件分类：根据操作条件分类： 柱色谱柱色谱 纸色谱纸色谱薄层色谱薄层色谱 气相色谱气相色谱 液相色谱液相色谱 按分离原理分类：按分离原理分类：1.吸附色谱：利用吸附剂表面对不同组份吸附能力的差异达到分离纯化的目的（硅胶、氧化铝、聚乙酰胺等吸附剂）。2.分配色谱：利用不同组份在流动相和固定相之间的分配系数不同而分离的方法（分配层析；支持剂：硅胶、硅藻土、纤维素等；固定相：水和油等不同极性的材料）。3.离子交换色谱：利用不同

3、组份离子交换剂亲和力不同进行的分离（离子交换树脂：强酸型磺酸型；强碱型季胺型；弱酸型羧酸型；若碱型三级胺型）。4.凝胶色谱、亲和色谱等。历历 史史 发发 展展薄层色谱、纸色谱薄层色谱、纸色谱电泳和吸附分离，获诺贝尔奖电泳和吸附分离，获诺贝尔奖气相色谱（分配色谱），获诺贝尔奖气相色谱（分配色谱），获诺贝尔奖毛细管色谱毛细管色谱气相色谱质谱联用气相色谱质谱联用高效液相色谱高效液相色谱高效液相色谱质谱联用高效液相色谱质谱联用4.2 薄层色谱分离制备薄层色谱分离制备一一 薄层色谱法薄层色谱法Thin layer chromatographyThin layer chromatography （TLCT

4、LC）将固定相均匀地铺在光洁玻璃板、塑料板或金属薄将固定相均匀地铺在光洁玻璃板、塑料板或金属薄膜表面上制备成薄层板。膜表面上制备成薄层板。依据比移值依据比移值R Rf f定性；依据斑点大小定量。定性；依据斑点大小定量。通常建议用通常建议用R R定性。定性。1）适用于挥发性较小或在较高温度易发生变化而）适用于挥发性较小或在较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物质不能用气相色谱分析的物质2）是柱色谱的先导）是柱色谱的先导3）分类：吸附型（）分类：吸附型（Al2O3、硅胶、硅胶G等作吸附剂）等作吸附剂） 分配型（硅藻土、纤维素等作支持剂分配型（硅藻土、纤维素等作支持剂4）操作方法：）操作方法：

5、在洗涤干净的玻板（在洗涤干净的玻板（153cm）上均匀地涂上一层）上均匀地涂上一层吸附剂或支持剂，待干燥、活化后将样品溶液用管吸附剂或支持剂，待干燥、活化后将样品溶液用管口平整的毛细管滴加于离薄层板一端约口平整的毛细管滴加于离薄层板一端约1cm处的起处的起点线上，晾干或吹干后，置薄层板于盛有展开剂的点线上，晾干或吹干后，置薄层板于盛有展开剂的展开槽内，浸入深度为展开槽内，浸入深度为0.5cm。待展开剂前沿离顶。待展开剂前沿离顶端约端约1cm附近时，将板取出，干燥后喷以显色剂或附近时，将板取出，干燥后喷以显色剂或在紫外灯下显色或直接观察。在紫外灯下显色或直接观察。比移值比移值Rf=溶质的最高浓度

6、中心至原点中心的距离溶剂前沿至原点中心的距离ab=abTLC的特点及类型：的特点及类型：价廉、设备简单、操作容易；展开时间短，检测结果快速；比纸层析的灵敏度高（高10100倍）分离情况受温度影响小；显色剂可供选择的范围大；比纸层析负载的样品量大得多。软板：将吸附剂直接在板上制成。硬板：在吸附剂中加入黏合剂或溶剂，调制后涂布于板上。二二.吸附剂的选择：吸附剂的选择：1.常用的吸附剂有：硅胶、氧化铝、硅藻土、聚酰胺、纤维素等。氧化铝、硅胶：吸附性能良好，适用于各类化合物的分离，应用最广。氧化铝：呈微碱性，适用于碱性物质和中性物质的分离，特别是生物碱的分离应用最多。硅胶：带微酸性，适用于酸性物质或中

7、性物质的分离。选择依据：化合物的固有性质。2.几种常见的吸附剂类型：几种常见的吸附剂类型：硅胶 G (Type 60)：粘合剂为石膏，T60表示硅胶的孔径为6nm。硅胶 H ：不含石膏及其它有机粘合剂，适用于分离对石膏有作用的化合物（与硅胶 G 相比）。硅胶 G254 ：同硅胶 G 一样，但含有一种无机荧光剂，在=254nm紫外灯下呈现荧光。硅胶 60HR ：不含粘合剂的纯产品，适用于需要特别纯的薄层，用于分离的物质需要定量。氧化铝 G ：同上。碱性氧化铝 H ：同上。三三.薄层的制备：薄层的制备：1.软板的制备：软板的制备：吸附剂：氧化铝和硅胶（常用）方法：选用一根直径为约11.2cm的玻璃

8、管依据薄层所需的厚度在玻璃管两端绕几圈胶布（厚度0.41mm），把干的吸附剂倒在玻璃板上，玻璃板一端固定，将比例管压在玻璃板上，吸附剂顺一个方向推动而成薄板。2.硬板的制备：硬板的制备：制板：将适量调制好的吸附剂倒在玻璃板上，用玻璃涂匀，轻敲玻璃板，使表面光滑，然后放置于水平台上，空气干燥后，进行加热活化。（硅胶板：100120加热活化12h；氧化铝：150200加热活化45h）硅胶薄层：称取市售硅胶 G 30g，加蒸馏水80mL，在研钵内调成均匀的糊状，直至调制成无气泡出现为止（必要时可加12滴乙醇），然后制板，室温干燥后置烘箱100120活化1h左右。氧化铝薄层：取氧化铝 G 25g，加蒸

9、馏水50mL在研钵中调成均匀糊状物，操作同上，干燥后于烘箱活化（活性II级的薄层：200220活化4h；IIIV级薄层：150160活化4h）。其他：5g聚酰胺 + 甲醇3份 + 氯仿2份（或苯2份）45mL纤维素1份 + 5份丙酮四四.TLC操作方法：操作方法：（点样、展开、显色、计算比较）1.点样：点样：浓度0.011%（极性与展开剂极性相近且有高挥发度的溶剂）于1cm处。2.展开：展开：展开的溶剂：低沸点的有机溶剂。苯苯乙酸乙酯（乙酸乙酯（50 50 V/V）氯仿）氯仿乙醚（乙醚（60 40）环己烷环己烷乙酸乙酯（乙酸乙酯（20 50）乙酸丁酯）乙酸丁酯氯仿氯仿甲醇（甲醇（95 5）氯仿

10、）氯仿丙酮（丙酮（70 30）苯苯乙酸乙酯（乙酸乙酯（30 70）乙酸丁酯）乙酸丁酯甲醇（甲醇（99 1）苯苯乙醚（乙醚（10 90）乙醚乙醚）乙醚乙醚甲醇（甲醇（99 1）乙醚乙醚二甲基甲酰胺（二甲基甲酰胺（99 1）乙酸乙酯）乙酸乙酯乙酸乙酯乙酸乙酯甲醇（甲醇（99 1）苯）苯丙酮（丙酮（50 50）氯仿氯仿甲醇（甲醇（90 10）二氧六环丙酮甲醇）二氧六环丙酮甲醇二氧六环二氧六环水（水（90 10）3.显色：显色：喷雾法：碘蒸气法：常用显色剂：常用显色剂：有机物有机物 显色剂显色剂生物碱生物碱 碘化铋钾试剂、碘蒸气碘化铋钾试剂、碘蒸气黄酮黄酮 紫外线氨熏、紫外线氨熏、AlCl3乙醇液乙醇

11、液蒽醌类蒽醌类 乙酸镁甲醇溶液、乙酸镁甲醇溶液、5%NaOH糖糖 邻苯二甲酸苯胺邻苯二甲酸苯胺强心苷强心苷 氯胺氯胺丁丁三氯乙酸、三氯乙酸、Kedde试剂试剂甾苷甾苷 茴香醛硫酸液、磷钼酸液茴香醛硫酸液、磷钼酸液萜类萜类 磷钼酸液磷钼酸液酸类酸类 FeCl3液液比移值比移值Rf=溶质的最高浓度中心至原点中心的距离溶剂前沿至原点中心的距离ab=ab4.样品显色后计算样品显色后计算Rf（比移值）：（比移值）：5.高效薄层色谱和制备薄层色谱高效薄层色谱和制备薄层色谱特点：以薄层色谱为基础，采用颗粒度更小及粒度分布范围更窄的吸附剂（57m）结合特殊高强度的粘合剂（聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚甲基丙烯胺、聚乙

12、烯吡咯烷酮及这类单体的共聚物）。表面平整光滑，分布均匀，点样量小，展开时间短，斑点集中和分辨率高。制备性薄层色谱(PTLC)与TLC的不同点：样品溶液的浓度一般为样品溶液的浓度一般为510%；板的厚度增加到板的厚度增加到0.51cm（根据样品数量的大小而（根据样品数量的大小而定）；定）；一般分离样品量在一般分离样品量在1015mg；可点成直线或虚线；可点成直线或虚线；色带的确定用物理方法。色带的确定用物理方法。4.2 柱色谱分离制备柱色谱分离制备一一 柱色谱的基本原理：柱色谱的基本原理：1.吸附原理：利用有机物中各组份对同一吸附剂吸附能力的差异，并在流动相作用下不断进行吸附和解附最终达到分离的

13、目的（硅胶、氧化铝）。2.离子交换原理：利用有机物组份和固定相树脂进行可逆的化学反应，不断地离子交换（离子交换树脂）。3.分配原理：利用有机物混合物中各组份在固定相和流动相间溶解度差异而不断地进行分配，由于各成份在两相间的分配系数不同而达到分离的目的（甘油、硅油、长链碳原子烃）。4.分子筛原理：利用有机物分子的大小差异，让不同的有机物分子通过孔径大小不同的固体相（凝胶色谱柱）。硅胶柱色谱：硅胶柱色谱：1.吸附剂：SiO2xH2O2.适用范围：非极性混合物和极性混合物（芳香油、萜类、甾体、生物碱、强心苷、蒽醌、酚类有机物、磷脂类、脂肪酸和氨基酸等）。3.装柱：湿法装柱：将硅胶混悬于装柱溶剂中，不

14、断搅拌，待空气泡除净后，连同溶剂一起倾入层析柱中，层析柱中硅胶段直径与长度之比为1 （2030）。（若硅胶较细，粒度分布窄，则可采用短柱，直径与长度之比为1 5）干法装柱：将所需硅胶一次倾入柱中，然后敲柱至硅胶高度不改变（也可用通N2压紧或在柱玻璃管下口减压使柱内硅胶紧密）。硅胶的再生：可用甲醇或乙醇洗涤，除去溶剂，烘干活化处理后可用（必要时用0.5%NaOH水溶液浸泡，用水冲洗至中性，再用5%10%HCl浸泡洗涤，最后用蒸馏水洗至中性，110活化过筛即可）。三三.氧化铝柱色谱氧化铝柱色谱(Al2O3)：1.类型：中性氧化铝：适用于分离醛、酮、萜类以及对酸碱不稳定的酯和内酯有机物。酸性氧化铝：

15、适用于分离有机酸、酸性氨基酸和酚类物质。碱性氧化铝：分离植物中碱性成份（生物碱）或萜类、甾体、强心苷等。2.装柱操作：装柱操作：氧化铝柱色谱操作方法和硅胶柱色谱操作方法相似。四四.离子交换柱色谱：离子交换柱色谱： 利用离子交换剂与溶液中的离子发生交换作用而使离子分离的方法，称为离子交换分离法。 采用有机离子交换剂离子交换树脂，基本上克服了无机离子交换剂的缺点，因此离子交换分离法在生产和科研各方面得到了广泛的应用。离子交换树脂的结构和性质离子交换树脂的结构和性质 （一）结构 离子交换树脂是具有网状结构的复杂的有机高分子聚合物。网状结构的骨架部分一段很稳定，不溶于酸、碱和一般溶剂。在网状结构的骨架

16、上有许多可被交换的活性基团。根据活性基团的不同、离子交换树脂可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂两大类。 1. 阳离子交换树脂 阳离子交换树脂具有酸性基团，如应用最广泛的强酸性磺酸型聚苯乙烯树脂，它是以苯乙烯和二乙烯苯聚合，经浓硫酸磺化而制得的聚合物。 这种树脂的化学性质很稳定，具有耐强酸、强碱、氧化剂和还原剂的性质，因此应用非常广泛。 各种阳离子交换树脂含有不同的活性基因、常见的有磺酸基(-SO3H)、羧基(-COOH)和酚基(-OH)等。根据活性基团离解出H+能力的大小不同，阳离子交换树脂分为强酸性和弱酸性两种。例如含-SO3的为强酸性阳离子交换树脂，常用R-SO3H表示(R表示树脂的骨架

17、)，合-COOH和-OH的弱酸性阳离子交换树脂，分别用R-COOH和R-OH表示。 强酸性阳离子交换树脂应用较广泛，弱酸性阳离子交换树脂的H+不易电离，所以在酸性溶液中不能应用，但它的选择性较高而且易于洗脱。 2. 阴离子交换树脂阴离子交换树脂 阴离子交换树脂与阳离子交换树脂具有同样的有机骨架，只是所联的活性基团为碱性基团。如含季胺(-N(CH3)3)的树脂的H+不易电离，称为强碱性阴离子交换树脂，含伯胺基(-NH2)、仲胺基(-NHCH3)和叔胺基(-N(CH3)2)的树脂为弱碱性阴离子交换树脂。这些树脂水化后分别形成R-NH3OH、R-NH2CH3OH、R-NH(CH3)2OH 和R-N(

18、CH3)3OH等氢氧型阴离子交换树脂，所联的OH-可被阴离子交换和洗脱。 阴离子交换树脂的化学稳定性及耐热性能都不如阳离子交换树脂稳定。 (二二)性质性质 1交联度交联度 离子交换树脂的骨架是由各种有机原料聚合而成的网状结构，例如强酸性阳离子交换树脂的合成过程，是先由苯乙烯聚合而成为长的链状分子，再由二乙烯苯把各链状分子联成立体型的网状体。这里二乙烯苯称为交联剂，树脂中所合交联剂的百分率称为重量交联度。如二乙烯苯在原料总量中占10%。则称该树脂的交联度为10。 树脂的交联度越大，则网眼越小，交换时体积大的离子进入树脂便受到限制。但提高了交换的选择性：另外，交联度大时，形成的树脂结构紧密，机械强

19、度高。但是如果交联度过大则对水的膨胀性能差(一般要求1克干树脂在水中能膨胀至1.5-2cm3为宜)，交换反应的速度慢，因此要求树脂的交联度一般为4-14。 2. 交换容量交换容量 离子交换树脂交换能力的大小，可用交换容量表示。理论上的交换容量是指每克干树脂所含活性基团的物质的量，而实际交换容量是指在实验条件下，每克干树脂能交换离子的物质的量。显然交换容量的大小取决于网状结构内所含活性基团的数目，交换容量可通过实验测得。例如强酸性阳离子交换树脂交换容量的测定手续如下。 称取于树脂1克，置于250mL锥形瓶中、准确加入0.1mol/LNaOH标准溶液100mL,振荡后放置过夜，用移浓管吸取上层清液

20、25mL，加酚酞指示剂1滴，用0.1mol/L标准HCl溶被滴定至红色消失，设用去标准HCl溶液14mL，树脂的交换容量可以计算为5.6 mmol/g。 二、离子交换亲和力二、离子交换亲和力 离子交换反应和其他化学反应一样，完全服从质量作用定律。 树脂对离子亲合力的大小，与离子的水合离子半径大小和带电荷的多少有关。经实验证明，在低浓度、常温下，离子交换树脂对不同离子的亲合力顺序有下列规律。 (一一)强酸性阳离子交换树脂强酸性阳离子交换树脂 1. 不同价态的离子，电荷越高亲合力越大 Th4+A1+Ca2+Na+ 2. 相同价态离子的亲合力顺序 Ag+Cs+Rb+K+NH4+Na+H+Li+ Ba

21、2+Pb2+Sr2+Ca2+Ni2+ Cd2+Cu2+Co2+Zn2+Mg2+UO22+ La3+Ce3+Pr3+Eu3+Y3+Se3+A13+ (二二)弱酸性阳离子交换树脂弱酸性阳离子交换树脂 与强酸性阳离子交换树脂相同，只是对于H+亲合力大于其他阳离子。 (三三)强碱性阴离子交换树脂强碱性阴离子交换树脂 Cr2O72-SO42-I-NO3-CrO42-Br-CN-C1-OH-F-Ac- (四四)弱碱性阴离子交换树脂弱碱性阴离子交换树脂 OH-SO42-CrO42-NO3-AsO43-PO43-Ac-I-Br-C1-F-三、离子交换色谱法三、离子交换色谱法 以强酸性阳离子交换树脂分离K+和N

22、a+为例。当混合溶液从柱上方加入时，水相中的K+和Na+就与树脂活性集团中的H+发生交换，从而进入树脂相。交换过程可表示为： R- H+ + K+ = R- K+ + H+R- H+ + Na+ = R- Na+ + H+ 如再向交换柱上方加入稀盐酸溶液，此时树脂相中的K+和Na+又将与溶液中的H+发生交换，重新进入溶液。这一过程称为洗脱。洗脱过程可表示为： R- K+ H+=R- H+ + K+ R- Na+ + H+ =R- H+ + Na+ 离子交换树脂选择离子交换树脂选择样品溶液的性质：离子的组成，离子的总浓度，选择性条件，抗衡离子淋洗液条件：流速，温度，树脂层高再生条件：浓度，流速，

23、温度四、离子交换分离的操作方法四、离子交换分离的操作方法 在分析工作中，为了分离或富集某种离子。一般采用动态交换。这种交换方法在交换柱中进行，其操作过程如下。 (一一)树脂的选择和处理树脂的选择和处理 在化学分析中应用最多的为强酸性阳离子交换树脂和强碱性阴离子交换树脂。生产上出厂的交换树脂颗粒大小往往不够均匀，故使用时应当先过筛以除去太大和太小的颗拉，也可以用水泡胀后用筛在水中选取大小一定的颗粒备用。 一般商品树脂韧含有一定量的杂质，所以在使用前必须进行净化处理。对强碱性和强酸性阴阳离子交换树脂，通常用4mol/LHCl溶液浸泡1-2天，以溶解各种杂质，然后用蒸馏水洗涤至中性。这样就得到在活性

24、基团上含有可被交换的H+或Cl-的氢型阳离子交换树脂或氯型阴离子交换树脂。如果需要钠型阳离子交换树脂，则用NaCl处理氢型阳离子交换树脂。 (二二)装柱装柱 进行离子交换通常在离子交换柱中进行。离子交换柱一般用玻璃制成，装置交换柱时，先在交换柱的下端铺上一层玻璃丝，灌入少量水，然后倾入带水的树脂，树脂就下沉而形成交换层。装柱时应防止树脂层中存留气泡，以免交换时试液与树脂无法充分接触。树脂高度一般约为柱高的90%。为防止加试液时树脂被冲起，在柱的上端亦应铺一层玻璃纤维。交换枝装好后，再用蒸馏水洗涤，关上活塞，以备使用。应当注意不能使树脂露出水面，因为树脂露于空气中，当加入溶液时，树脂间隙中会产生

25、气抱，而使交换不完全。 交换柱也可以用滴定管代替。 (三三)交换交换 将试液加到交换柱上，用活塞控制一定的流速进行交换。经过一段时间之后，上层树脂全部被交换、下层未被交换，中间则部分被交换，这一段称为“交界层”。随着交换的进行，交界层逐渐下移，至流出液中开始出现交换离子时，称为始漏点(亦称泄漏点或突破点)，此时交换柱上被交换离子的物质的量数称为始漏量。在到达始漏点时，交界层的下端刚到达交换柱的底部，而交换层中尚有未被交换的树脂存在，所以始漏量总是小于总交换量。 (四四)洗脱洗脱 当交换完毕之后，一般用蒸馏水洗去残存溶液，然后用适当的洗脱液进行洗脱。在洗脱过程中、上层被交换的离子先被洗脱下来，经

26、过下层未被交换的树脂时，又可以再度被交换。因此最初洗脱液中被交换离子的浓度等于零，随着洗脱的进行，洗出液离子浓度逐渐增大，达到最大值之后又逐渐减小，至完全洗脱，被洗出之离子浓度又等于零。 对于阳离子交换树脂常采用HCl溶液作为洗脱液，经过洗脱之后树脂转为氢型；阴离子交换树脂常采用NaCl或NaOH溶液作为洗脱液，经过洗脱之后，树脂转为氯型或氢氧型。因此洗脱之后的树脂已得到再生，用蒸馏水洗涤干净即可再次使用。四、离子交换法的应用四、离子交换法的应用 (一一)纯水的制备纯水的制备 天然水中常含一些无机盐类，为了除去这些无机盐类以便将水净化，可将水通过氢型强酸性阳离子交换树脂，除去各种阳离子。如以C

27、aCl2代表水中的杂质，则交换反应为： 2R-SO3H+Ca2+(R-SO3)2Ca+2H+ 再通过氢氧型强碱性阴离子交换树脂，除去各种阴离子。 RN(CH3)3OH+C1-RN(CH3)3Cl+OH- 交换下来的H+和OH-结合成H2O，这样就可以得到相当纯净的所谓“去离子水”，可以代替蒸馏水使用。 (二二)干扰离子的分离干扰离子的分离 1. 阴阳离子的分离阴阳离子的分离 在分析测定过程中，其他离子的存在常有干扰。对不同电荷的离子，用离子交换分离的方法排除干扰最为方便。例如用BaSO4重量沉淀法测定黄铁矿中硫的含量时，由于大量Fe3+、Ca2+的存在，造成BaSO4沉淀的不纯，因此可先将试液

28、通过氢型强酸性阳离子交换树脂除去干扰离子，然后再将流出液中的SO42-沉淀为BaSO4进行硫的测定，这样便可以大大提高测定的准确度。 2. 同性电荷离子的分离同性电荷离子的分离 如果要使几种阳离子或几种阳离子分离开，可以根据各种离子对树脂的亲和力不同，将它们彼此分离。例如欲分离Li+、Na+、K+三种离子，将试液通过阳离子树脂交换柱，则三种离子均被交换在树脂上,然后用稀HCl洗脱，交换能力最小的Li+先流出柱外，其次是Na+而交换能力最大的K+最后流出来。 (三三)微量组分的富集微量组分的富集 以测定矿石中的铂、钯为例来说明。由于铂、钯在矿石中的含量一般为10-5-10-6，即使称取10克试样

29、进行分析，也只含铂、钯0.1微克左右。因此，必须经过富集之后才能进行测定。富集的方法是：称取10-20克试样，在700灼烧之后用王水溶解，加浓HCl蒸发，铂、钯形成PtCl62-和PdCl42-络阴离子。稀释之后，通过强碱性阴离子交换，即可将铂富集在交换柱上。用稀HCl将树脂洗净之，取出树脂移入瓷钳锅中，在700灰化，用王水溶解残渣，加盐酸蒸发。然后在8mol/LHCl介质中，钯(II)与双十二烷基二硫代乙二酰胺(DDO)生成黄色络合物，用石油醚-三氯甲烷混合溶剂萃取，用比色法测定钯。铂(IV)用二氯化锡还原为铂(II)，与DDO生成樱红色螯合物可进行比色法测定。 （1）分离对象）分离对象：酚

30、、醌、硝基化合：酚、醌、硝基化合物物2 2聚酰胺柱色谱聚酰胺柱色谱键吸附键吸附 吸 附 洗 脱 剂 解 吸 附 HO+HOCH3OOOCNHOH2CCH2H2CCH2H2CCONHHCH3HOCH3OCNHH2CCH2H2CCH2H2CCONHHOOO五凝胶柱色谱五凝胶柱色谱凝胶色谱法固定相：凝胶，多空隙网状结构固体，具有分子筛性质。分离原理：凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。优点：a. 条件温和 b.操作简便 c. 损失少回收率高 d. 层析柱可反复使用凝胶的类型：亲水性和疏水性, 成型商品如下：Sephade

31、x: 交联葡聚糖 Sepharose：琼脂糖凝胶 Bio-Gel ABio-Gel P：聚丙烯酰胺凝胶分子筛Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝胶G-10G-15G-25G-50G-75G-100G-150G-200吸水量（g/g干凝胶）1.01.52.55.07.510.015.020.0工作范围（肽与蛋白）D70015000.15的情况下，在 10-15分钟可快速得到分离。该法首先由 still于 1978年详细介绍，1981年获专利保护。 一、实验条件一、实验条件 1、吸附剂硅胶：选用 60埃，粒度为 40-63um (230-400目)。过大、过小都会使分离度减少

32、。2、流动相 A 、通常以 TLC层析条件为依据，对被分离成分，要求 Rf值在 0.35左右 B、选择在 TLC板上对混合成分有良好的分离。要求Rf0.15 Rf值=0.1时，上样量小时也能分离。 C、流速：由实验证实，使用硅胶 60 （4063um）作为固定相，流速为 2in/min时，可得到昀好的分辨率3、干法装柱：硅胶高度 5-6in15cm左右装柱法与普通法相同溶剂加入后，加压，排除空气，并使硅胶溶剂化。 4、上样、洗脱与收集采用 40-63um硅胶为吸附剂时，柱的大小、硅较用量、加样量、每次收集的体积见表压力泵一般要求 0.4-0.3Kg/cm2 即可。约 2bar/30psi.(每

33、平方英吋磅)，可通过控制流速 2in/min 来实现。与层析柱上端相接的塞子是一个压力控制伐，可调节压力而调节流速如图所示。减压液相柱色谱（VLC）Vacuum Liquid Chromatography是近几年来国外实验室迅速发展起来的新技术，它是利用柱后减压使洗脱剂迅速通过固定相从而很好的分离样品的色谱技术。 VLC具有快速，简易，高效，价廉等优点，目前已成功的应用于有机制备以及天然产物如萜类，类酯，双萜及多种生物样品的分离。VLC特点特点 VLC不同于常压柱层析和快速柱层析 Fcc，因为后两者洗脱剂是连续的，在操作中不会间断；而 VLC进行溶剂洗脱时，在加洗脱剂后，在柱后减压下全部抽出，

34、每一次洗脱收集一次，抽干后，再更换溶剂，并再进行下一个流分的收集，FCC采用柱前加压，而 VLC采用柱后减压.VLC可分离样品量达几十克，而 FCC只能分离几克。 VLC吸附剂经处理后可反复使用。实验条件实验条件 1.固定相；常采用 TLC用硅胶、Al2O3,（粒度：10um40um硅胶 60H或 60G）聚酰胺等 2. 装柱：干法装柱法。将吸附剂装入漏斗或短柱中，轻轻拍紧或减压拍打或从顶端挤压，直至吸附剂紧密，昀后变得坚硬。吸附剂的高度一般不超过 5cm。 3，吸附剂用量：（1）对于微量分离，样品100mg,可采用直径为 0.51cm色谱柱或漏斗，吸附剂高度为 5cm，一般固定相用量为 1015：1倍，可在小试管中收集流分。（2）对于 0.51.0g样品，柱中装有 2.54cm高度的吸附剂较合适。（3）对于 110g样品的分离，可在柱中装入 55cm的吸附剂。（4）较大样品分离，昀好采用 250ml砂芯漏斗中进行。吸附剂的高度为 5cm。可用三角烧瓶收集之。加大吸附剂与样品比例，可提高