染色体核型分析及染色体显微分离技术研究进展_闫素丽

1、生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN 技术与方法 2008年第 4期收稿日期 :2007-01-07染 色 体 核 型 是 指 某 一 物 种 所 特 有 的 一 组 染 色 体或一套染色体 的形态特征。 核型分析 是对生物细 胞核内全部染色体的 形态 特 征 进 行 分 析 , 是 物 种 分 类的基本依 据。以核型 为 基 础 的 染 色 体 微 分 离 、 微 克 隆 技 术 是 指 在 显 微 镜 下 对 特 定 染 色 体 进 行 显 微 分离或显 微 切 割 , 随 后 进 行 PCR 扩 增 、 DNA 鉴 定 和 克隆 , 进 而 可 以 快 速 的 建 立

2、 相 应 的 DNA 文 库 、 筛 选 有用探针、 构建特 定区 域 分 子 连 锁 图 谱 等 。目 前 该 技 术 已 经 在 动 植 物 遗 传 与 进 化 研 究 中 显 示 出 了 独 特 作用。 对近年来核型 分析和染色体显微切 割技术 的方法进行了综述 , 并 简要介绍了其应用和 前景。1核型分析核 型 是 根 据 细 胞 分 裂 中 期 浓 缩 的 染 色 体 形 态结构建立的 , 核型 模式图 通 常 是 将 显 微 拍 摄 的 染 色 体照片 剪贴、 整理、 绘制而成。 不 同的物种具有不同的核型 , 因 此 核 型 是 区 别 物 种 的 基 本 遗 传 学 依 据 ,

3、 也对分子生物 学的研究具有指导意 义。1.1染色体标本的制作过程因 为根尖易培养、 不受 季节 影 响 , 且 细 胞 分 裂 旺 盛 、 集 中 、 容 易 辨 别 。 李 懋 学 1认 为 凡 能 进 行 细 胞 分 裂 的植物组 织或单个细胞都可以 作为取材的对象。 植 物分生组织的 生 长 具 有 一 定 周 期 性 , 这 就 限 制 了 取 材时间 , 一般 认 为 取 材 应 选 在 细 胞 分 裂 中 期 最 为 合 适 , 研 究 表 明 , 植 物 细 胞 分 裂 中 期 高 峰 一 般 出 现 在 上 午 8:3011:30, 但 也 有 植 物 分 裂 中 期 的 时

4、 间 段 不 只 一 个 , 如 阿 拉 伯 茶 21d 至 少 出 现 2个 分 裂 高 峰 , 因此 , 取材时要根据材料 选择合适的时间。预 处理能得到 分 裂 相 高 , 形 态 好 的 中 期 染 色 体 。实染色体核型分析及染色体显微分离技术研究进展闫素丽 1, 2安玉麟 2孙瑞芬 2李素萍 2(1内 蒙 古 农 业 大 学 , 呼 和 浩 特 010019; 2内 蒙 古 农 牧 业 科 学 院 , 呼 和 浩 特 010031摘 要 :染色体核型分析是遗传学研究的重要手段 , 也是物种分类和鉴定的基本依据。染色体显微切割技术是细胞遗传学和分子遗传学相结合的一种技术 , 应用前景

5、广阔。重点综述了染色体核型分析和单染色体显微切割技术的操作规程。关键词 :染色体 核型分析 显微切割 微克隆Research Progress of Karyotype Analysis and ChromosomeMicro-dissection TechnologyYan Suli 1, 2An Yulin 2Sun R uifen 2Li Suping 2(1Inner Mongolia Agriculture University , Huhhot 010019; 2Inner Mongolia Academy of Agriculture and Animal HusbandrySc

6、iences , Huhhot 010031Abstract :Karyotype analysis is an important method for genetic research , it is also the basis of plant classificationand appraisal. Chromosome micro-dissection and micro-clone is a combined technology of cytogenetics and molecular genetics , which have a bright prospect. The

7、major procedures of karyotype analysis and micro-dissection and micro-clone were summarized in this paper.Key words :Chromosome Karyotype analysis Micro-dissectionMicro-cloning2008年第 4期际操作中常用的方法 有物理方法和化学方 法。 物理 方 法 是 用 低 温 对 材 料 进 行 处 理 , 处 理 温 度 一 般 在 0 8 , 常 用 的 方 法 是 用 冰 水 混 合 物 4 对 材料进行处理 , 该 方

8、法 的 优 点 是 简 单 、经 济 、 安 全。化 学 方 法 预 处 理 常 用 的 试 剂 有 :秋 水 仙 素 、 对 二氯苯、 8-羟喹啉、 -溴荼 和风油精等。 根据不同 的 材 料 选 择 合 适 的 试 剂 , 秋 水 仙 素 毒 性 较 强 , 价 格 较 高 , 处理效果好 , 但处理时间 不 能 过 长 ; 对 二 氯 苯 预 处理的 效果与秋水 仙 素 相 当 , 也 具 有 较 强 的 毒 性 , 价 格 较 低 ; 8-羟 喹 啉 较 适 宜 处 理 较 大 染 色 体 的 植 物 ; -溴荼对禾 本 科 和 水 生 植 物 的 非 离 体 材 料 处 理 效 果

9、较 好 3; 风 油 精 处 理 的 特 点 是 经 济 、 安 全 , 近 年 来 在 水 稻 4、 烟 草 5、 平 邑 甜 茶 6等 植 物 上 采 用 过 , 效 果 较好 , 但未见用于其它 植物。材料解离方法有酶解 法和酸解法。 酶解法是 用 低浓度的果胶酶 (1%2% 和纤 维素酶 (1%5% 的 混合液解离 材料 , 解离时间一般 在室温下 25h 。酸 解 法 一 般 是 将 材 料 放 入 预 热 60 的 1mol/L HCl 中 解 离 , 解 离 时 间 视 不 同 的 材 料 而 定 , 一 般 为 几 分 钟 到 十几分钟或更长 8。1.2核型分析方法闫素丽等 :

10、染色体核型分析及染色体显微分离技术研究进展 71生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2008年第 4期分析研究中。2染色体微切割、 微克隆技术染 色 体 微 切 割 、 微 克 隆 技 术 最 早 是 1981年 Scalenghe 等 16创 立 的 , 它 为 遗 传 学 研 究 提 供 了 有 力 的手段 , 但 当时滞后的扩 增 技 术 限 制 了 该 技 术 的 发 展 。 随 着 1989年 PCR 技 术 与 微 分 离 、 微 克 隆 技 术 的结 合 , 该技术进入了一 个 新 阶 段 并 广 泛 应 用 于 基 因工程研究。其技 术 流 程 为 染

11、色 体 标 本 的 制 备 、 目 标 染 色 体 的 识 别 、 微 分 离 、 分 离 片 断 的 PCR 扩 增 和 鉴定等 。2.1染色体标本的制备及目标染色体的识别 用 于 显 微 分 离 的 染 色 体 标 本 制 备 方 法 与 常 规 制 片 基 本 相 同 , 只 是 固 定 液 中 酸 的 比 率 要 适 当 降 低 , 以 减 少 酸 对 DNA 的 破 坏 , 宋 文 芹 17在 制 片 中 用 70%酒精取代 了传统的固定液。为使 细胞质背景清 楚 , 崔 丽 华 等 18采 用 去 壁 低 渗 法 , 提 高 了 染 色 体 分 离的效率。但无论 用 什 么 方 法

12、 , 都 要 使 染 色 体 尽 量 散开 , 易于 识别目标染色体。目标染色 体 的 识 别 , 早 期 报 道 主 要 是 一 些 染 色 体 容 易 识 别 的 材 料 , 如 田 靫 等 19对 附 加 在 TAI-27中 的 中 间 偃 麦 草 染 色 体 进 行 了 分 离 ; 何 聪 芬 等 20成 功的分离了 携带抗病基因的单价 体。 这种方法的优 点 是 所 分 离 的 染 色 体 不 受 伤 害 , 能 够 建 立 完 整 的 DNA 文 库 , 但 其 缺 点 是 只 能 识 别 一 些 容 易 辨 认 的 染色体 , 对于 复杂、 难分辨的染色体 很难操作。 分带 技

13、术 的 出 现 及 应 用 使 得 任 意 一 条 染 色 体 或 者 染 色 体任意区段 的显微切割成为可能 。 田靫 21将 C-分带 技术运用在小麦 1D 染色 体的微切割上 , 并进行 了 微克隆。2.2目标染色体的显微切割和分离目 前 染 色 体 显 微 分 离 与 切 割 的 方 法 主 要 有 4种 , 即微细玻璃针法 、 激光显微切 割 法 、 流 式 细 胞 仪 法、 微细玻璃 针切割法 和 显 微 激 光 切 割 相 结 合 的 方 法 。722008年第 4期原 理 是 :染 色 体 能 与 特 异 的 荧 光 染 料 (Hoechst 和 Chromomycin 结 合

14、 , 并 且 由 于 各 条 染 色 体 组 分 的 不 同 以 及 染 色 体 上 DNA 碱 基 序 列 的 非 随 机 分 布 , 使 他 们 吸 收 Hoechst 和 Chromomycin 的 量 及 比 例 也 就 不同 , 激光照射后 , 染 色体呈现出 不 同 的 荧 光 带 , 将 目标染色体 发出的荧光 波 长 输 入 计 算 机 , 用 计 算 机 控 制将发出同一波长的 染 色 体 收 集 到 一 起 , 从 而 得 到要分离的目 标染色体。 这种分离方 法适用于染色 体形态差异较大的材 料 , 能 在 短 时 间 内 分 离 到 大 量 的 同 一 染 色 体 ,

15、但 是 其 设 备 昂 贵 , 在 科 学 研 究 中 难 以普 及。2.3PCR 扩增早期的克 隆 方 法 主 要 是 酶 切 直 接 克 隆 , 这 种 方 法操作精细、 所需 底物较多且工作 量 大 、 效 率 低 , 不 利 于 后 续 研 究 的 需 要 , 因 此 若 将 分 离 到 的 染 色 体 DNA 经 过 PCR 扩 增 后 再 克 隆 到 载 体 上 , 效 率 将 会 大 大 提 高 。 1989年 Ludecke 等 将 PCR 技 术 与 染 色 体显微操作技术结 合后 , 先 后 出 现 了 接 头 引 物 PCR (LA-PCR 、 简 并 引 物 PCR (

16、DOP-PCR 、 单 一 引 物 PCR (SUP-PCR 等 , 但 研 究 中 普 遍 采 用 的 是 接 头 引 物 PCR (LA-PCR 和 简 并 引 物 PCR (DOP-PCR 2种 方法。2.4扩增产物的鉴定3染色体显微切割技术的应用和展望随 着 显 微 切 割 技 术 在 构 建 染 色 体 DNA 文 库 、 研 究 染 色 体 自 身 结 构 、 基 因 绘 图 等 方 面 的 成 功 运 用 , 它必将在更深 层的 基 因 组 研 究 中 发 挥 独 特 的 作 用。 但是 , 目前此项技术还存在 许多不足 , 如良好染 色 体 标 本 的 制 备 、 目 标 染

17、色 体 的 准 确 辨 认 等 , 相 信 随着分子生物 学技术的 发 展 , 这 些 问 题 都 会 得 以 解 决 , 显 微操作技术也必将有 更广阔的前景。参 考 文 献1朱徵 . 植物染色体及染色体技术 M. 北京 :科学出版社 , 1982, 43. 2赵 振 军 . 阿 拉 伯 茶 组 织 培 养 与 核 型 分 析 硕 士 学 位 论 文 . 南 京 :南 京 农 业 大 学 , 2006.闫素丽等 :染色体核型分析及染色体显微分离技术研究进展 73生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2008年第 4期 (上接第 57页 !M icrobiology ,

18、2007, 30:239254.6Aijaz Ahmad Wani , Venkata Prasad Surakasi , et al. Research in M icrobiology , 2006, 157:928937.7K. Zepp-Falz , C Holliger , R Grosskopf , et al. Appl Environ M icrobiol , 1999, 65:24022408.8Thomas A. Auchtung , et al. Appl Environ M icrobiol , 2006, 72(7 : 50775082.9Anne-C Lehours

19、 , Corinne Bardot , et al. Appl Environ M icrobiol , 2005, 71(11 :73897400.10M elissa M errill Floyd , Jane Tang , et al. Appl Environ M icrobiol , 2005, 71(6 :28132823.11Zwart , G , BC Crump , et al. Aquat M icrob Ecol , 2002, 28:141155. 12Qinglong L Wu , Gabriel Zwart , et al. Appl Environ M icrob

20、iol , 2006, 72(8 :54785485.13Hongchen Jiang , Hailiang Dong , et al. Appl Environ M icrobiol , 2006, 72(6 :38323845.14Purificaci n L pez-Garc a , et al. Extremophiles , 2005, 9:263 274.15Yanhe M a , Weizhou Zhang , et al. Extremophiles , 2004, 8:4551. 16Shaheen B.Humayoun , Nasreen Bano , et al. App

21、l Environ M icrobiol , 2003, 69(2 :10301042.17Aaike De Wever , Koenraad M uylaert , et al. Appl Environ M icrobiol ,2005, 71(9 :50295037.18Hideyuki Tamaki , Yuji Sekiguchi , et al. Appl Environ M icrobiol , 2005, 71(10 :21622169.19AC Yannarell , 1AD Kent , et al. M icrob Ecol , 2003, 46:391405. 20M

22、arie Lefranc , et al. Appl Environ M icrobiol , 2005, 71(10 :5935 5942.21Kiyotaka Takishita , M asashi Tsuchiya , et al. Protist , 2007, 158:51 64.22Jan , David M oreira , et al. Proc R Soc B , 2005, 272:2073 2081.23C écile Lep ère , Delphine Boucher , et al. Appl Environ M icrobiol , 2006

23、, 72(4 :29712981.24Richardson TH , Tan X , Frey G , et al. J Biol Chem , 2002, 277: 2650126507.25Ravi Ranjan a , Amit Grover , et al. Biochemical and Biophysical Research Communications , 2005, 33:55765.26M i-Hwa Lee , Choong-Hwan Lee , et al. Appl Environ M icrobiol , 2006, 72(11 :74067409.27Anja K

24、nietsch , Susanne Bowien , et al. Appl Environ M icrobiol , 2003, 69(6 :30483060.28Olivier Nercessian , M arina G , et al. Appl Environ M icrobiol , 2005, 71(12 :89498953.3张 贵 友 , 等 . 普 通 遗 传 学 实 验 指 导 M. 北 京 :清 华 大 学 出 版 社 , 2003, 18.4庄 南 生 , 黎 京 度 . 植 物 学 报 , 1995, 34(4 :309310.5程 晓 蕾 , 郭 俊 成 , 李

25、洪 涛 . 烟 草 科 技 , 1998(3 :3940.6周 攀 , 董 文 轩 , 商 月 惠 . 安 徽 农 业 科 学 , 2007, 35(6 :1611. 7李 懋 学 , 张 赞 平 . 作 物 染 色 体 及 其 研 究 技 术 M. 北 京 :中 国 农 业 出 版 社 , 1996, 160.8李 国 珍 . 染 色 体 及 其 研 究 方 法 M. 北 京 :科 学 出 版 社 , 1985, 109130.9李 懋 学 , 陈 瑞 阳 . 武 汉 植 物 学 研 究 , 1985, 3(4 :297302. 10Stebbins GL.Chromesomal evolu

26、tion in higher plants.London: Edward Arnold , 1971, 85104.11沈 玉 堂 . 染 色 体 核 型 分 析 系 统 研 究 与 开 发 硕 士 学 位 论 文 . 杭 州 :浙 江 大 学 , 2003.12缪 立 丹 . 染 色 体 图 像 软 件 系 统 研 究 硕 士 学 位 论 文 . 成 都 :四 川 大 学 , 2001.13刘 泉 , 傅 祖 芸 . 计 算 机 工 程 与 应 用 , 2000, 03:7174.14姗 姗 , 梁 英 民 , 王 作 军 . 第 四 军 医 大 学 学 报 , 2000, 21(7 :86

27、0. 15乔 永 刚 , 宋 芸 . 农 业 网 络 信 息 , 2006,(10 :9798. 16Scalenghe F , et al.Chromosoma , 1981, 82:205.17宋 文 芹 , 崔 香 芹 , 许 文 胜 , 等 . 科 学 通 报 , 1996, 41(4 :361363. 18崔 丽 华 , 胡 赞 民 , 等 . 植 物 学 报 , 1997, 39(8 :697700.19田 靫 , 卢 一 凡 , 等 . 中 国 科 学 , 1999, 29(2 :174179.20何 聪 芬 , 马 有 志 , 等 . 作 物 学 报 , 1999, 25(3 :273278.21田 靫 , 刘