第五章常用生物化学检验技术

1、第五章 常用生物化学检验技术第一节 光谱分析技术教学目的：1、掌握分光光度技术的基本原理及定性和定量方法。2、熟悉分光光度计的的基本结构和操作方法。3、了解其他光谱分析技术的基本原理及在生化检验中的应用。教学重点：吸收光谱分析法的测定原理教学难点：发射光谱分析法和散射光谱分析法的原理及应用：教学方法和手段：课堂讲授为主，多媒体教学为辅，实验教学加强理解。授课时数：2学时教学内容和组织：在临床生化检验中，光谱分析是一类十分重要的技术，应用极为广泛。应用吸收光谱原理进行分析的主要有可见光及紫外光分光光度法，以及原子吸收分光光度法。红外分光光度法虽然也属于吸收光谱法，但在临床生化上应用不多。应用发射

2、光谱原理进行分析的主要有荧光分析法和火焰光度法。应用散射光谱原理进行分析的主要是比浊法，包括免疫比浊法等。1、分光光度技术的基本原理检测原理：（1）吸光度与透光度：当光线通过均匀、透明的溶液时可出现三种情况：一部分光被散射，一部份光被吸收，另有一部分光透过溶液。设入射光强度为I0，透射光强度为I，I和I0之比称为透光度，透光度的负对数称为吸光度。（2）Lambert-Beer定律是讨论溶液吸光度同溶液浓度和溶液层厚度之间关系的基本定律，该定律是分光分析的理论基础。其表达式为：A = KLC（式中A为吸光度；K为比例常数，称为吸光系数；L为溶液层厚度，称为光径；C为溶液浓度）2、分光光度计的基本

3、结构：光源、单色器、比色杯、检测器、显示器3、操作方法（见实验指导）4、分光光度技术的定性和定量方法；（1）标准曲线法：将一系列浓度不同的标准溶液按照一定操作过程显色后，分别测吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。在相同条件下处理待测物质并测定其吸光度，即可从标准曲线找出相对应的浓度。（2）对比法：将标准样品与待测样品在相同条件下显色并测定各自的吸光度。由于测定体系温度、厚度以及入射光波长是一致的，所以标准与待测样品K值及L相等，可应用下式比较计算待测样品浓度：Cx=Cs×AsAx。（3）差示法：有色溶液浓度太浓或太稀（透光度超过90%-10%）时，测定结果会产生较大误

4、差，此时可采用差示法（differential spectrophotometry)。高浓度样液差示法：用标准品制备浓度稍低于试样的参比溶液，先将仪器光门关闭，调节T%=0，再将参比溶液置于光路上，打开光门使T%=100，然后测定样品溶液的透光率即可。例如某一样品溶液原来的透光率读数为5%（10%以下），用差示法后读数为50%，这实质是把透光率标尺扩展了10倍，从而减少了测量误差。低浓度样液差示法：用标准品制备浓度稍高于试样的参比溶液，将它放在光路上，打开光门，调节透光率至0%，然后换以空白溶剂，调节刻度至100%。此后测定样品的读数即可。（4）多组分混合物的测定：当试样中有两种或两种以上的组

5、分共存，可根据各组分的吸收光谱的重叠程度，选用不同的定量方法。如果混合物各组分的吸收峰互不干扰，这时可按单组分的测定方法，选择测定波长，分别测定各组分的含量；若各组分的吸收峰相互重叠，可采用解联立方程法、等吸收点法、双波长法等解决量中的干扰问题。5、其它光谱分析技术：（1）火焰光度法基本原理和仪器组成；（2）原子吸收分光光度法的基本原理；仪器组成和特点；（3）荧光光度分析法，许多物质都是光致发光的，即它们可以吸收电磁辐射，然后又重新发射出相同或较长波长的辐射。光致发光最常见的类型是荧光（fluorescence)和磷光（phosphorescence）。利用荧光强度进行分析的方法，称为荧光法（

6、fluorimetry)。在荧光分析中，待测物质分子成为激发态时所吸收的光称为激发光，处于激发态的分子回到基态时所产生的荧光称发射光。荧光法测定的是受光激发后所发射的荧光的强弱，而不是测定激发光的强弱。凡能产生荧光的化合的，均可采用荧光分析法进行定性或定量。荧光强度的影响因素：溶剂：增大溶剂的极性，将使-跃迁的能量降低，荧光增强。在水、乙醇、环已烷等这些常用溶剂中常含有荧光杂质，影响测定，必须在使用前作净化处理。荧光物质的浓度：对于某一荧光物质的稀溶液，在一定频率和一定强度的放射光I。照射下，如果光被吸收的百分率不太大，且溶液的浓度很小，当溶液的厚度不变时，则它所发生的荧光强度F和该溶液的浓度

7、C成正比，即F=I。ECL式中为荧效率。当荧光物质浓度高时，会发生分子间碰撞，使荧光效率降低。因为温度增高后使分子间碰撞次数增加，消耗分子的内部能量。温度：大多数情况随温度升高时，荧光效率降低。因为温度增高后使分子间碰撞次数增加，消耗分子的内部能量。溶液的PH值：当荧光物质本身为弱酸或弱碱时，溶液的pH值改变对溶液荧光强度产生影响较大，因为有些物质在离子状态时无荧光，而有些则相反，也有二者均有荧光，但荧光光谱有所不同。第二节 电泳技术教学目的：1、掌握电泳的概念；电泳的基本原理；影响电泳的因素2、熟悉电泳迁移率；醋酸纤维薄膜电泳、琼脂糖电泳；聚丙烯酰胺凝胶电泳：等电聚焦电泳教学重点：电泳的概念

8、；醋酸纤维薄膜电泳；影响电泳的因素教学难点：电泳迁移率教学方法和手段：课堂讲授，实验教学授课时数：2学时教学内容和组织：1、概念： 在直流电场中，带电粒子向带符号相反的电极移动的现象称为电泳（electropho-resis）。1809年俄国物理学家Pece首先发现了电泳现象，但直到1937年瑞典的Tiselius建立了分离蛋白质的界面电泳（boundary electrophoresis）之后，电泳技术才开始应用。本世纪60-70年代，当滤纸、聚丙烯酰胺凝胶等介质相继引入电泳以来，电泳技术得以迅速发展。丰富多彩的电泳形式使其应用十分广泛。电泳技术除了用于小分子物质的分离分析外，最主要用于蛋白

9、质、核酸、酶，甚至病毒与细胞的研究。由于某些电泳法设备简单，操作方便，具有高分辨率及选择性特点，已成为医学检验中常用的技术。电泳技术：利用带电粒子在电场作用下定向移动的特性，对混合物组分进行分离、纯化和测定的一项技术。电泳基本原理：溶液中粒子必须带有净电荷才能在电场中移动，粒子在溶液中的带电状态主要由粒子表面的化学基团和溶液的pH值决定。其中电泳迁移率是物质的特征常数，混合物各组分的电泳迁移率不同时，即可在电场中彼此分离。等电点：当溶液中某物质所有粒子都电离为兼性离子时，该溶液的pH值称为该物质的等电点。按照同离子效应，粒子在溶液中的电离状态和荷电量可以通过调节溶液的pH值加以控制。影响电泳的

10、因素：（1）分子的形状和性质：蛋白质、核酸等生物大分子，在分子量接近时，球状分子比纤维状分子的移动速度快，表面电荷密度高的粒子比表面电荷密度低的粒子移动速度快；（2）电场强度：电场强度增大，电泳速度加快，但是同时电流强度也增大，产热增多，为使电泳得到满意的结果，要选择适宜的电场强度；（3）电泳缓冲液：电泳缓冲液起着决定粒子荷电性质和荷电量的作用，同时起着导电的作用，电泳时对缓冲液的化学组成、pH值和离子强度都有一定要求；（4）支持介质：支持介质对电泳的影响主要表现为吸附作用和电渗作用；（5）蒸发：水分的蒸发导致支持介质中缓冲液浓缩，离子强度加大，标本分电流减小，电泳速度减慢。由于支持介质水分的

11、蒸发，使虹吸作用加强，两边电泳槽中缓冲液沿着支持介质由两端向中间对流，使标本区带向中音集中并弯曲，导致分辨率下降。2、常用的电泳技术（1）醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素是提纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋酸酯。由该物质制成的薄膜称为醋酸纤维素薄膜。这种薄膜对蛋白质样品吸附性小，几乎能完全消除纸电泳中出现的“拖尾”现象，又因为膜的亲水性比较小，它所容纳的缓冲液也少，电泳时电流的大部分由样品传导，所以分离速度快，电泳时间短，样品用量少，5g的蛋白质可得到满意的分离效果。因此特别适合于病理情况下微量异常蛋白的检测。操作过程及原理见实验指导。（2）凝胶电泳以淀粉胶、琼脂或琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等作为支持介质的区带电泳法称为凝胶电泳。其中聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）普遍用于分离蛋白质及较小分