动物及其制品中细菌耐药性的测定not;—纸片扩散法编制说明

1、 动物及其制品中细菌耐药性的测定纸片扩散法 编制说明一、任务来源本标准是根据国家质检总局下达的 2011 年度行业标准修订计划项目，项目编号为：2011B522r。由上海出入境检验检疫局进行修订。二、修订意义抗菌药物是目前人类和兽医临床使用最广泛的抗感染药物，在治疗与控制人畜传染病方 面起着重要的作用。在畜禽养殖过程中也常常使用抗生素来提高动物的抗病能力，促进生长。 但随着抗生素的不断应用，细菌对抗生素的耐药性逐年上升，耐药菌的产生日趋增多，传播 日渐迅速，其严重性已不容忽视。动物源性细菌的耐药性不但和畜牧业生产有着十分密切的 联系，更直接关系人类的健康。控制动物源性细菌的耐药性的产生及传播是

2、解决人类日趋严 重的耐药性问题中的重要环节，也是目前国际社会的共识。现行的 SN/T 1944-2007 动物及其制品中细菌耐药性的测定纸片扩散法于 2007-08-06 发布， 2008-03-01 实施，由上海出入境检验检疫局负责起草，标准主要参考了美 国临床和实验室标准协会(Clinicaland Laboratory Standards Institute, CLSI)的抗菌药物敏感性试验执行标准第十六版补充说明M100-S16( 2006 )和抗菌药物敏感性试验纸片扩散法操作标准 M02-A9( 2006)的相关内容。为符合和适应抗菌药物临床应用和研究进展，CLSI对解释标准M100

3、每年进行更新，操作标准M02每3年进行更新。到2013年为止，M100已更新至第23版(M100-S23, 2013), M02更 新至第11版(M02-A11, 2012)。而CLSI针对兽用药临床的动物来源细菌的抗菌药物敏感 性试验扩散法和稀释法执行标准 现更新至第 3版( M31-A3， 2008)。随着近年来抗菌药物耐药性的发展，新耐药机制的出现和用药方式的改变，以及法律法 规层面对抗生素使用的新规定， 从 2007 年至今， CLSI 系列标准的技术内容较原先行业标准参 考的内容已有不少的改变。为适应出入境检验检疫工作与时俱进的需要，按照国家认监委关 于出入境检验检疫行业标准复审修订

4、计划项目 的批复意见， 参考 CLSI 标准最新版本内容， 按 GB/T1.1 、GB/T1.2 要求，对该标准进行文本格式及内容的修订。三、修订依据1. GB/T 1.1-2009 标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则2. CLSI M100-S23 抗菌药物敏感性试验执行标准 -第二十三版及补充说明3. CLSI M02-A11 抗菌药物敏感性试验纸片扩散法操作标准 -第十一版4. CLSI M31-A3 抗菌药物敏感性试验纸片扩散法操作标准 -第三版5.SN/T 1944-2007 动物及其制品中细菌耐药性的测定纸片扩散法四、修订内容本标准针对 CLSI M100-S23和CL

5、SI M02-A11与原CLSI M100-S16和CLSI M02-A9之间的更新点 进行了修订，增加了 CLSI M31-A2的规定要求和技术内容，并按照 GB/T 1.1-2009规范了文本格 式。本标准对SN/T 1944-2007主要修订如下：按照GB/T 1.1-2009标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写，规范了文本格 式。检测方法部分按美国临床和实验室标准协会最新标准CLSIM100-S23（ 2013）抗菌药物敏感性试验执行标准和CLSI M02-A11（ 2012）抗菌药物敏感性试验纸片扩散法操作标准进行了修订。具体内容见表1。附录部分按美国临床和实验室标准协会最新标

6、准CLSIM100-S23（ 2013）抗菌药物敏感性试验执行标准和CLSI M31-A3（ 2008）动物源性细菌抗菌药物敏感性试验执行标准进行了修订。考虑到标准的适用范围为动物源性细菌，对原附录中与动物源性细菌耐药性无 关的部分进行删减，动物源性细菌耐药性特有的部分及特定耐药机制的测定进行了增补。具 体内容见表1。表1.标准内容区别区别SN/T 1944-2007本标准规范性引用文件SN 0170出口食品沙门氏菌 属（包括亚利桑那菌）检验方 法GB4789.4食品微生物学检验沙门氏菌检验术语和定义中介：被测细菌对常规剂量的 抗生素的反应率较敏感菌株 低，其生长繁殖可被咼于常规 剂量的抗生素

7、浓度抑制。中介：常规剂量的抗菌药物对细菌的 疗效低于敏感菌株，药物在生理浓集 部位有效或可使用高于正常剂量得 药物进行治疗。耐药：被测细菌的生长繁殖不 能被常规剂量的抗生素所抑 制。耐药：细菌不能被常规剂量抗菌药物 达到的浓度所抑制， 和（或）证明抑 菌环直径落在某些特定的细菌耐药 机制范围内。无非敏感 Unsusceptible（US）:用在仅有敏感解释，无中介或耐药解释的细 菌。受试菌株抑菌环直径低于敏感解 释折点时称为不敏感。设备和材料在5测定方法中的5.3仪器和 设备4设备和材料培养基与试剂在5测定方法中的5.2试剂和 材料5培养基与试剂 列出了培养基名称样品米集第4节第6节测定方法第

8、5节第7节5.5沙门氏菌的增菌培养、分 离和鉴定：按 SN0170进行。7.2沙门氏菌的增菌培养、分离和鉴定：按 GB 4789.3进行。5.6.1实验室自制抗生素纸片 方法见7.3.1，删除多片加药法。5.6.2商品化的抗生素药物纸 片见7.3.2，增加使用注意事项。5.7.1制备菌液：推荐顺序为 培养法、振摇法、悬浮法。7.4.1推荐顺序为悬浮法、培养法、 振摇法。5.7.3贴药物纸片7.4.3贴药物纸片中增加细化要求：一般直径150mm勺琼脂平板应放置 不超过12个纸片，或直径100mm勺平 板放置不超过5个纸片。5.7.4结果观察7.4.4结果解释中增加解释：在抑菌 圈边缘的只能在放大

9、镜下观察到的 微小菌落的生长可忽略不计。结果及判断67.5结果及判断：增加了非敏感(US 报告要求。增加了特定耐药机制的判 定要求。培养基和试剂附录A附录A:增加了 A.2缓冲蛋白胨水(BPW)细菌的抑菌环直径解释标准附录B附录B:删除了羧苄西林、美洛西林、 氨苄西林/克拉维酸、哌拉西林/它唑 巴坦、头孢克洛、头孢尼西、头孢呋 辛钠、头孢美唑、头孢哌酮、头孢唑 肟、头孢地尼、拉氧头孢、碳氯头孢、 头孢丙烯、头孢布烯、奈替米星、地 红霉素、多四环素、 米诺环素、加替 沙星、吉米沙星、洛美沙星、依诺沙 星、格帕沙星、斯帕沙星、萘啶酸、 西诺沙星、氟洛沙星、甲氧苄氨嘧啶、 呋喃妥因、磷霉素和替拉考丁

10、的解释 标准；修改了哌拉西林、头孢唑林、 头孢呋辛、头孢噻肟、头孢唑肟、头孢曲松、头孢他啶、多利培南、氨曲 南、泰利霉素、四环素和环丙沙星的 解释标准；增加了青霉素/新生霉素、 头孢洛林、厄他培南、莫西沙星、吡 利霉素和氯苯尼考的解释标准。细菌耐药性检测的质里控制附录C附录C:质控菌株的抑菌环直径允许 范围根据抑菌环直径解释标准的更 新而作相应更新，并增加了氨苄西林 和哌拉西林的大肠杆菌 ATCC35218 允许范围推荐的抗生素分组附录D附录D动物源性细菌耐药性检测中 推荐挑选的抗菌药物分组：增加了动 物专用的常规报告试验药物分组；将匍萄球菌属改为金黄色匍萄球菌。常规试验的药物改为通用人类临床

11、标准的常规报告 试验药物；金黄色葡萄球菌增加阿 奇霉素/克拉霉素/红霉素、克林霉 素、甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲恶唑；肠 杆菌科删除头孢唑啉；沙门氏菌喹诺 酮类限定为环丙沙星或左氧沙星。选择试验的药物改为通用人类临床标准的选择报告 试验药物；肠杆菌科删除氨苄西林/克拉维酸、哌拉西林/它唑巴坦、部 分头孢类抗生素，增加头孢噻吩、四 环素、磺胺和亚胺培南；沙门氏菌删 除头孢他啶、头孢哌酮和头孢唑肟； 金黄色葡萄球菌删除泰利霉素、阿奇 霉素/克拉霉素/红霉素、克林霉素和 甲氧苄氨嘧啶/磺胺甲恶唑，增加氨 苄西林、庆大霉素、头孢噻吩、磺胺、 四环素和利福平。补充试验的药物改为选择性报告的补充试验药物；肠 杆

12、菌科仅保留氨曲南、头孢他啶和氯 霉素；金黄色葡萄球菌删除呋喃妥 因、洛美沙星、诺氟沙星、磺胺异恶唑，增加泰利霉素特定耐药机制的测定与判定附录E产超广谱B -内酰胺酶 的大肠杆菌和耐甲氧西林的金 黄色葡萄球菌的测定与判定附录E特定耐药机制的测定与判定： 增加了 E.2产碳青霉烯酶的肠杆菌 的测疋；E.3耐甲氧西林/本唑西林 的金黄色葡萄球菌 （MRSA的测定中 删除本唑西林，增加头孢洛林，更新 头孢西丁的判断标准和质控要求附录表注删除“本表内容摘自美国临床和实验 室标准研究所（CLSI）抗菌药物敏 感性试验纸片扩散法操作标准和美国临床和实验室标准研究所（CLSI） 抗菌药物敏感性试验执行标准。五

13、、验证测试1室内验证以标准菌株及38株禽源性大肠杆菌对 6种抗生药物的耐药性检测比较扩散法和稀释法之 间的符合程度。结果见表 2和表3。表2:标准菌株对6种抗菌药物的耐药测定:抗菌药物大肠杆菌ATCC 25922金黄色葡萄球菌 ATCC 25923纸片扩散法微量稀释法纸片扩散法微量稀释法抑菌环直径判疋MIC判疋抑菌环直径判定MIC判疋氨卞西林21mms4.0g/mLs33mms<0.25g/mLs头孢西丁26mms<8g/mLs30mms<8g/mLs头孢噻肟32mms<8g/mLs30mms<8g/mLs庆大霉素20mms0.5g/mLs21mms0.5 g/m

14、Ls环丙沙星32mms<0.25 卩g/mLs25mms0.5 g/mLs甲氧卞氨嘧 啶/磺胺甲恶 唑26mms<2/38 卩g/mLs26mm敏感<2/38g/mLss:敏感表3: 38株禽源性大肠杆菌对 3种抗菌药物的耐药性测定:抗菌药物方法试验结果耐药（R）菌株数/%符合率%中介（1 ） 菌株数/%符合率%敏感（S）菌株数/%符合率%氨卞西林纸片扩散法32/84.21001/2.6/5/13.183.3微量稀释法32/84.20/06/15.7头孢噻肟纸片扩散法2/5.21000/0/36/94.7100微量稀释法2/5.20/036/94.7环丙沙星纸片扩散法17/4

15、4.71001/2.6/20/52.695.3微量稀释法17/44.70/021/55.2纸片扩散法与药物敏感性试验参考方法稀释法之间有很好的一致性，耐药率的符合率达到100%氨苄西林和环丙沙星各有一株大肠杆菌的结果为“中介（ I）”，而用微量稀释法测 定结果均为“敏感（S）”，符合CLSI关于“中介”的解释标准。2、室间验证江苏出入境检验检疫局技术中心、浙江出入境检验检疫局技术中心、国家食品质量监督检验中心（上海）和上海市食品药品检验所应邀对本修订标准的部分技术内容进行了验证测试。内容包括标准质控菌株的纸片扩散法和微量稀释法比对，结果汇总见表4;随机编号的3株大肠杆菌未知菌株和 3株金黄色葡萄球菌未知菌株同时采用纸片扩散法和微量稀释法比对 检测，其中有1株耐甲氧西林/苯唑西林的金黄色葡萄球菌（ MRSA和1株产超广谱B内酰胺 酶的大肠杆菌（ESBL，结果汇总见表 5。表4标准菌株对抗菌药物的耐药测定验证单位大肠杆菌的符合率%金黄色葡萄球菌的符合率 %1100%100%2100%10