TT病毒的检测及部分核苷酸序列比较

1、    TT病毒的检测及部分核苷酸序列比较        摘要：目的为阐明TT病毒(TTV)流行病学特征和基因组异质性以及为血清学诊断试剂的研制提供资料。方法从健康查体者的血清中提取DNA，设计一套引物，采用套式聚合酶链反应（nested-PCR），检测TTV，对其中7例阳性标本进行了克隆测序，并与2株日本株TTV的核苷酸序列作了比较。结果111例正常人中TTV的感染率为12.6%。7株中国株TTV间的核苷酸同源性为90.6%95.4%，与日本株TX011（O）的核苷酸同源性

2、93.0%95.0%，而与日本株TA278同源性则在72.9%74.7%之间。所推测的7株中国株TTV间氨基酸同源性为81.9%99.4%，与日本株TX011（O）氨基酸同源性为85.5%88.6%，而与日本株TA278氨基酸的同源性仅为68.1%71.7%。结论正常人群中TTV的携带率比较高。7株中国株TTV变异相对较小，同源性比较高，与日本株TX011（O）属于同一基因型。氨基酸的变异大于核苷酸变异。主题词：聚合酶链反应； TT病毒； 基因异质性； 核苷酸序列Detection of TT virus and partial sequence comparisonYANG Jun（Depa

3、rtment of Hepatitis, National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products, Beijing 100050, P.R.China）WANG Youchun（Department of Hepatitis, National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products, Beijing 100050, P.R.China）ZHANG Huayuan, et al（Department o

4、f Hepatitis, National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products, Beijing 100050, P.R.China）Abstract：ObjectiveTo collect data for elucidating the epidemiological characteristics and genetic heterogeneity of TTV and preparing for serologic tests. MethodsWe designed a set of p

5、rimers to detect 111 cases of normal population by nested-PCR and cloned and sequenced 7 PCR products which were 543 bases long and compared with 2 Japanese TTV isolates. Results TTV infection rate in normal population was 12.6%. The nucleotide sequence homology among the 7 Chinese TTV isolates were

6、 90.6%-95.4%. The homology between Japanese TTV isolates TX0119(O), TA278 and the 7 Chinese TTV isolates were 93.0%-95.0% and 72.9%-74.7%, respectively. The putative amino acid homology among the 7 Chinese TTV isolates were 81.9%-99.4 %. The amino acid homology between the TX011(O) isolate and the 7

7、 Chinese TTV isolates were 85.5%-86.6%, while the homology of the TA278 isolate and the 7 Chinese isolates were only 68.1%-71.7%. ConclusionsTTV infection rate in normal population was 12.6%. The nucleotide sequence of the 7 Chinese TTV isolates were more conserved and the variation of them were les

8、s than that of the Japanese TTV isolates. The 7 Chinese TTV isolates and the Japanese isolate TX011(O) may belong to the same genotype. The amino acid variation was greater than the nucleotide sequence variation.Key words：Polymerase chain reaction ；TTV ；Genetic heterogeneity; Nucleotid sequence1989年

9、Choo及1990年Reyes等分别得到HCV和HEV的克隆，从而揭开了非甲非乙型肝炎（NANBH）的面纱，1994年报道了己型肝炎病毒（HFV）1在急性输血后和急性散发性非甲非乙型肝炎中可能起一定作用，但HFV的分离测序未获成功。尽管有这么些进展，临床上仍有许多肝炎病例病原不明，大量暴发性肝炎病人中检测不出AE肝炎病毒2,3。1995年Linnen 及Leary等从非甲戊型输血后肝炎病人中发现GBV-C/HGV4，5，但尚未发现HGV在肝脏中复制的证据，其致病性让人怀疑。因此，很有可能存在其它尚未发现的致肝炎因子。1997年底Nishizawa等6应用RDA(representational

10、 difference analysis)技术从一名非甲庚型输血后肝炎病人克隆出一种新病毒，即TT病毒(TTV)。TTV是一种单链DNA病毒, 序列全长3 739nt，无包膜，两个开放读码框架（ORF），ORF1位于5892898nt，编码770个氨基酸，ORF2位于107712nt，编码202个氨基酸,尚不知TTV属于何科病毒7。本工作为了研究国内TTV的流行情况，设计了一套PCR引物，用于检测部分正常人中TTV的分布情况，并对部分序列进行了比较。材料与方法1.血清样本：从北京血站收集于查体者，-20冻存。2.PCR引物设计：将GenBank中8株TTV序列（序列号分别是AB011494，A

11、B011493，AB011491，AB011490，AB011489，AB011488，AB011487，AB011486）进行同源性比较，选择ORF1中比较保守的序列，并用Oligo软件分析设计引物。外引物：正义链 GCAACCGCAGCGGATATGCAATA，反义链 TACTTAGCCAGTCTATCCACAGCA；内引物：正义链 GTTAACTTCCAAGTTCTGCAATCC，反义链 GTTGCCTTCTCCTCTGTCTG。3.DNA提取和PCR：按华美公司DNA提取试剂盒操作说明书提取DNA，取5l DNA提取液，加5l 10×buffer，4l MgCl2（25mmo

12、l/L），1l dNTP（10mmol/l），25pmol外引物，2.5U Taq DNA聚合酶（以上试剂均购自Promega公司），加去离子水至50l反应体积。94 1 min，55 1 min，72 1 min，30循环，最后72延伸10 min。取第一轮PCR产物5l，内引物25pmol，其它试剂量同上。94 30 s，55 30 s，72 1 min，30循环，最后72延伸10 min。4.PCR产物的克隆及测序：用琼脂糖凝胶（GIBCO产品）作电泳,切下凝胶，用玻璃奶方法（原平公司产品）纯化PCR产物，将之克隆到pGEM-T easy载体上，转化到E.coli.Eco6细胞（本实验室

13、保存），筛选出阳性克隆，用Wizard Plus Minpreps DNA纯化系统提取质粒进行测序。测序反应试剂盒购自Perkin-Elmer公司，用ABI PRISM 310测序仪测序，得到了7株TTV的部分序列，序列长度为543bp，并分别命名为Y23-6，Y126-3，Y1-5，Y7-5，Y9-1，Y19-1， Y4-1。5.序列比较：将GenBank中9株日本株TTV序列G88801，TX011（O），G105001，TY96117，G102001，G104901，G103301，G97801，TA278作同源性比较发现，与中国株TTV核苷酸序列相对应的部分变异比较大，其同源性在73.

14、5%95.0%，按该部分的变异程度似可分为两个基因型，从中选出了两个代表株TX011(O)、TA278与7株中国TTV的DNA序列及推测的相应氨基酸序列通过Multalin version 5.3.38进行同源性比较（去除引物部分），见1和2。19株TTV部分核苷酸同源性比较Fig 1. Partial nucleotide sequence comparison of 9 TTV strains29株TTV部分氨基酸同源性比较Fig 2. Partial amino acid sequence comparison of 9 TTV strains结果1.TTV在正常人群中的分布：在111名

15、查体者中检测出14例阳性携带者，阳性率为12.6%。2. 7株中国株TTV序列比较：在去除了两端引物序列后（124nt，524543nt），7株中国株TTV间的同源性为90.6%95.4% ，核苷酸变异属于点突变，未有缺失和插入。在这些点突变中，密码子中第一位核苷酸突变比较多，比较有规律的突变是GA、CA突变。在7株中国株TTV间，所推测的氨基酸同源性为81.9%99.4%，其中Y9-1和Y19-1同源性最高，为99.4%，除此以外，氨基酸同源性则在81.9%91.0%间。因此可以看出7株中国株TTV氨基酸的变异，大多数反而高于核苷酸的变异，这种情况还是比较少见的。3.中国株TTV与日本株TT

16、V的比较：从表1可以看出，日本株TX011（O）与7株中国株TTV的核苷酸同源性为93.0%95.0%，远远高于日本株TA278与中国株的核苷酸同源性（72.9%74.7%）。TX011（O）与7株中国株TTV的氨基酸同源性为85.5%88.6%，也高于TA278与中国株TTV的氨基酸同源性（68.1%71.7%）。表19株TTV部分核苷酸及推测的氨基酸同源性百分比Table 1. Percentages homology of 9 TTV strainsTTVY23-6Y7-5Y1-5TX011(O)Y9-1Y126-3Y4-1Y19-1TA278Amino acidY23-689.289.

17、287.384.383.784.383.769.3Y7-593.891.088.686.186.186.185.571.7Y1-593.495.488.685.586.186.184.971.1TX011(O)94.095.094.886.185.586.185.571.1Y9-193.095.094.294.282.583.799.468.7Y126-391.093.293.293.492.883.781.968.7Y4-191.893.494.093.092.891.883.169.9Y19-191.492.491.893.291.290.692.068.1TA27873.174.773.

18、574.374.573.373.772.9Nucleotide讨论 由于分子生物学技术的应用，与肝炎相关的病毒不断被发现。1997年底，Nishizawa等人应用RDA技术从一名非甲庚型输血后肝炎病人血浆中克隆出TTV，并且发现在非甲庚型的暴发性肝炎、慢性肝脏疾病，血友病、血液透析病人、静脉注射药物者中其TTV感染率高达39%68%，在供血员中为12%，因此，TTV有可能与输血后肝炎相关6。鉴于此，有必要对我国TTV的流行情况作一个调查。我们所测得的111名正常人中TTV携带率达12.6%，几乎比我国人群中HBsAg携带者都高（8%12%）其意义如何，尚须进一步研究，并有必要对阳性者作追踪调查

19、。从9株TTV序列比较情况来看，7株中国株TTV的变异相对较小，同源性比较高，而与该部分序列相对应的日本株TTV间的变异则较大，可能这2株日本株TTV属于不同的两个基因型，7株中国株TTV与日本株TX011（O）似可划为同一基因型。但由于缺少全序列的比较，尚不能下定论，须进一步研究。由于这几株TTV编码氨基酸的密码子的第一位核苷酸突变频率比较高，因而氨基酸变异率也较高。作者单位：杨军（中国药品生物制品检定所）王佑春（中国药品生物制品检定所）张华远（中国药品生物制品检定所）李河民（中国药品生物制品检定所）参考文献：1Deka N, Sharma MD, Mukerjee R. Isolation

20、 of the novel agent from human stool samples that is associated with sporadic non-A, non-B hepatitis. J Virol，1994，68：7810-7815.2Feray C，Gigou M，Samuel D，et al.Hepatitis C virus RNA and hepatitis B virus DNA in serum and liver of patients with fulminant hepatitis. Gastroenterology， 1993，104：549-555.3Wright TL.Etiology of fulminant hepatic failure：is another virus involved？Gastroenterology，1993，104：640-643.4Linnen J，Wages J，Zhang-keck ZY，et al.Molecular cloning and disease association of hepatitis G virus：a transfusion-transmissible agent.Science，1996，271：50