HGFc-met与肾脏纤维化的动物模型研究

1、HGF/c-met与肾脏纤维化的动物模型研究【关键词】 动物模型基金项目：国家自然科学基金资助项目(编号：20060785)近年来，研究了许多抑制ECM积聚的细胞因子，其中肝细胞生长因子( hepatocyte growth factor，HGF) 作为一种抗纤维化的因子得到了越来越多的研究。它不但能加速急性肾衰中肾小管上皮细胞的再生,而且能减缓慢性肾衰的进程。在体实验发现,加入HGF可以改善肾纤维化的程度,而加入HGF的特异性抗体则加速肾纤维化的进展，显示出良好的治疗前景。多项研究表明,急性肾衰竭(acute renal failure，ARF) 患者血清HGF 的水平呈显著增加, 并在一定

2、程度上有助于ARF 患者肾功能恢复1-3 。本文就近年来对HGF和其受体c-met的研究，以及其在肾脏纤维化动物模型中的研究作一综述。1 HGF/c-met的一般生物学特性1.1 HGF的起源 肝细胞生长因子(HGF) 又名Scatter 因子( scatter factor，SF) ，因其与血液凝固级连反应的酶具有结构同源性,而成为纤溶酶原相关生长因子( the plasminogen related growth factors family，PRGFs) 家族的成员之一。它最初是从部分肝切除的大鼠血浆中分离纯化获得的，因能刺激原代培养的肝细胞生长而得名。1987年日本的中村敏一从3000

3、只大鼠的血小板中将HGF纯化成单一的蛋白质，1989年根据HGF N末端氨基酸序列成功地克隆了HGF的cDNA并得出了其全氨基酸序列，并用基因重组的方法人工合成了HGF。1.2 HGF/c-met 的结构和作用机理 HGF是由由分子量69kD 的重链(链,465 个氨基酸) 和34kD 的轻链(链,234 个氨基酸) 以二硫键连接而成的异二聚体糖蛋白。重链N 末端的31 个氨基酸为信号序列，其后由1 个发夹域和4个卷曲域组成花瓣式构造，轻链含有丝氨酸蛋白酶样结构。HGF的单链前体无生物活性，双链的成熟HGF才是其具有生物活性的分子。HGF的受体是c-met原癌基因编码的一种跨膜酪氨酸激酶4，是

4、目前已知的HGF的唯一受体，在肾脏表达相当广泛，主要分布于近曲小管、髓袢厚段、薄段以及集合管。c-met是由分子量50kD的链和145kD的链组成的异二聚体跨膜蛋白，链在膜外，链横跨细胞膜。链的胞外端富含与HGF结合有关的丙氨酸，而胞内端则富含酪氨酸激酶构域。其中c末端的MDS可与信号传递分子发生特异性结合。HGF与受体结合后使酪氨酸激酶活化，导致c末端酪氨酸残基磷酸化，从而发挥HGF的多种生物学功能。HGF/c-Met信号传导途径对于胚胎发育过程中肾的器官发生，正常结构的维持和患病肾的修复和再生都起着重要作用。 HGF通常由间质来源的细胞产生，如肾小球系膜细胞、内皮细胞、间质成纤维细胞和巨噬

5、细胞等。在肾小球区主要由内皮细胞及系膜细胞产生，在肾小管间质区主要由间质细胞和巨噬细胞产生。HGF与受体结合引起酪氨酸激酶活化，激活细胞内多个信号级联反应,包括三磷酸肌醇激酶( PI-3K)，Grb / sos/Ras复合物， Gab-1，Shp-2，磷脂酶C， Ras-GTP 酶活性蛋白和c-Scr 等。因此HGF是一种多效性的生长因子，对多种细胞具有多种生物学活性，包括细胞生存，增殖，移动，和分化等（5，6，7，8）。炎症介质( IL-1，INF-，TNF-，TGF-等) 、去甲肾上腺素均可诱导HGF的表达，值得一提的是HGF可以诱导自身及受体表达的提高。而TGF-，糖皮质激素，1，25二

6、羟基维生素D3和维甲酸等则抑制其表达 9 。HGF通过内分泌、自分泌及旁分泌方式发挥作用7-10 。2 HGF与各种动物模型肾纤维化的关系 在慢性损伤后，大多数CKD动物模型中内源性HGF的表达被短暂地诱导11-12 。两组研究群体独立地证明/论证了用中和性的抗体阻断/封闭HGF信号显著地促进了组织纤维化和肾功能异常的出现和进展11-13，暗示了在慢性肾脏病中诱导HGF 的表达对于保护正常肾脏结构和功能是有益的。研究发现，HGF不仅阻止了慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）的发生和发展也显示了它在组织已经受损时的治疗有效性。同时还发现HGF能协同其它治疗物质如肾素

7、-血管紧张素系统抑制剂来抑制肾间质纤维化。2.1 HGF与慢性肾小球肾炎 在一种ICR品系衍生的肾小球肾炎的基因小鼠（ICR strain-derived glomerulonephritis mice，ICGN mice）的早期阶段，应用中和性的抗HGF抗体，中和内源性HGF加速了ECM的积聚，增加了转化生长因子(transforming growth factor-，TGF-1)的表达，和肾小管的细胞凋亡，导致了进行性肾纤维化和肾功能不全13。 相反，给ICGN小鼠提供外源性HGF蛋白抑制了TGF-1的表达并阻止了肾纤维化和慢性肾功能不全13-14 。Mori等15用anti-Thy-1.

8、1抗体制备的实验性系膜增生性肾小球肾炎大鼠模型进行研究，于模型制备完成的第2至第9天连续给予腹腔内注射重组的人HGF0.8mg/(kgd)，此后连续观察8周，发现HGF干预组的大鼠肾脏肾小球的恢复加快，表现为毛细血管内皮细胞增生和毛细血管的再生。2.2 HGF与残余肾 Liu和Rajur等11应用5/6肾切除的大鼠残余肾模型，在给予了中和性的HGF抗体后，拥有残余肾的大鼠经历了肾小球滤过率的迅速下降和血浆肌酐水平的上升，伴随肾纤维化损伤的加重，从而证明了内源性的HGF保护了残余肾进行性发展的肾纤维化和慢性肾功能不全。Dworkin等在5/6肾切除大鼠模型中加入HGF蛋白或它的基因也可以抑制残余

9、肾的肾纤维化损伤并减轻肾功能不全。2.3 HGF与梗阻性肾病 一些实验证实了给予外源性HGF减弱了通过单侧输尿管接扎造成的小鼠和大鼠梗阻性肾病模型的肾间质纤维化。Gao等制备了单侧输尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）的大鼠模型，将外源性HGF基因导入大鼠骨骼肌细胞后，病肾的内源性HGF和c-met上调。在术后第14天与第28天，基因治疗后病肾的纤维形成，巨噬细胞浸润和小管萎缩的现象明显弱于对照组。Mizuno等分别给予UUO小鼠HGF的中和性抗体和外源性的重组人HGF，发现前者加速了病肾小管间质纤维化的进程并伴有TGF-表达的增高，而后者则作用完

10、全相反。Yang和Liu证实了在UUO小鼠模型中，术后3天，梗阻侧的肾脏呈现出典型间质纤维化损伤，以肌成纤维细胞活化，纤维粘连蛋白过渡表达，间质基质沉积和TGF-1上调为表现。从这一时间点开始，连续11天给予小鼠外源性HGF，发现治疗组-平滑肌肌动蛋白（-smooth muscle actin，-SMA）水平较对照组减少大于70%，ECM和TGF-1以及其I型受体显著的减少，抑制了肾间质纤维化的进展。 一种联合应用HGF基因和肾素-血管紧张素系统抑制剂的治疗方法已经证实能产生协同效应而减弱肾小管间质纤维化。此项联合治疗法应用了人HGF基因和一种血管紧张素II的I型受体抑制剂氯沙坦，保护了UUO

11、大鼠梗阻侧肾脏的总体形态和结构，几乎完全消除了-SMA，抑制了ECM的积聚和肾脏的TGF-1及其I型受体的表达，减轻了肾间质纤维化。2.4 HGF与糖尿病肾病 一些实验已经证实了外源性HGF可以显著改善小鼠和大鼠的糖尿病肾病。Dai等在链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）诱导的单肾切除后的糖尿病小鼠体内注入外源性的HGF基因，发现治疗组小鼠肾脏TGF-1的表达被抑制，纤维粘连蛋白和I型胶原沉积减少，间质肌成纤维细胞活性被抑制，改善了糖尿病肾病的肾脏病理改变。Mizuno和Nakamura12应用STZ制备的糖尿病小鼠进行研究，在小鼠出现高血糖症后的第4至第6周给予抗HGF的IgG

12、抗体，发现肾小球的病变显著的加重了。而在STZ诱导后的第6至第10周期间给予重组的HGF后，发现尽管高血糖的水平没有改变，但肾小球系膜细胞内TGF-1的含量减少了，进行性发展的肾小球肥大和硬化也几乎完全被抑制了。Kagawa等应用一种遗传性糖尿病小鼠模型-db/db小鼠进行研究，在实验小鼠出生后12周龄时，在它们后肢肌肉处注射腺病毒编码的人HGF基因，到达24周龄时进行糖尿病肾病的评估。结果发现基因治疗组小鼠肾小球和肾小管的纤维化明显少于对照组，肾小球内皮细胞和小管上皮细胞的凋亡也显著降低，并且肾脏的TGF-1的表达也显著减少，db/db小鼠的生存期也明显延长。Cruzado等在STZ诱导的糖

13、尿病大鼠的早期和进展期糖尿病肾病阶段分别应用人HGF基因治疗，发现进展期糖尿病肾病大鼠的肾脏TGF-1和系膜结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）的上调被抑制，同时也抑制了肾脏的金属蛋白酶组织抑制剂-I（tissueinhibitoe of metalloproteinase-I，TIMP-1）的表达，减少了肾脏间质肌成纤维细胞的数量，减轻了肾纤维化。2.5 HGF在其它肾病模型中的作用 Azuma等发现每天注射外源性HGF4周能够阻止大鼠慢性同种异体移植物肾病的进展。 Kuroiwa等在（C57BL/6 DBA/2）F1（BDF1）小鼠体

14、内注射DBA/2小鼠的脾细胞后诱导了小鼠慢性移植物抗宿主病，并出现系统性红斑狼疮的组织病理学改变。在造模后12周内，每两周重复转染HGF基因一次，发现通过HGF基因转染有效的减少了治疗组小鼠狼疮肾炎的蛋白尿量和组织病理学改变。 另外， HGF与碘麝香草酚酸肾病和环孢霉素A肾病的动物模型中的有效性也已经被报道15。3 结论 研究表明，HGF作为一种内源性因子，它可以减轻慢性损伤后肾脏组织的纤维化损伤。它的抗纤维化效应主要是通过它抵抗TGF-1的促纤维化活性来介导的。由于TGF-1已经被广泛的认同是在各种类型的损伤后肾纤维化的发病原因，越来越多的实验证据显示，HGF是主要的抗纤维化因子可以对抗TG

15、F-1的活性。根据本文，我们可以发现给与外源性HGF或诱导内源性HGF的表达很可能提供一种有效的方法来治疗慢性肾脏纤维化。但是离临床应用还有一定的距离，比如给药的途径，剂量，频率等，尽管目前有较多的动物试验的证据支持，但尚需要大量的临床的试验来进一步证明。【参考文献】 1 Schieppati A, Remuzzi G. Chronic renal disease as a public health problem: Epidemiology, social, and economic implicationJ. Kidney Int, 2005, 68(Suppl 1): S7-S102

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