学习手册-细胞干重法

1、天津现代职业技术学院学习手册情境：细胞干重法引导文-单元设计-实训指导书18子情境：引导文细胞干重法阅读材料材料一、浊度法浊度法：可用来测量菌浓度其原理是发酵罐中的发酵液按照一定的流速进 入流通式比色皿中，用500-600nm的波长检测发酵液的光密度然后发酵液再流 回发酵罐中所测的OD值与细胞浓度成正比。浊度法：可用来测量菌浓度.其原理是发酵罐中的发酵液按照一定的流速进 入流通式比色皿中，用500-600nm的波长检测发酵液的光密度.然后发酵液再流 回发酵罐中.所测的ODfi与细胞浓度成正比.也常用于免疫测定，基本原理是：抗原抗体在特殊缓冲液中快速形成抗原抗 体复合物，使反应液出现浊度。当反应

2、液中保持抗体过量时，形成的复合物随抗 原量增加而增加，反应液的浊度亦随之增加，与一系列的标准品对照，即可计算 出受检物的含量。免疫浊度测定法按照仪器设计的不同可以分为两种，即比浊仪测定 (turbidimetermeasure )和散射比浊仪测定(nephelomitermeasure )。比浊仪 测定是测量由于反射、吸收或散射引起的入射光衰减，其读数以吸光度A表示。A什反映了入射光与透射光的比率(A=2log10T, T代表浊度百分比)。散射比 浊仪测定是测量入射光遇到质点(复合物)后呈一定角度散射的光量，该散射光 经放大后以散射值表示。最心 完成以下信息！浊度法的原理是材料二、微生物群体生

3、长规律微生物细胞数量的增加称为微生物群体生长 。由于微生物个体微小的特殊 性，难以针对单个微生物细胞或个体的生长繁殖的研究进行， 故除特定的研究目 的外，一般所言的微生物生长是指群体生长。如将少量细菌纯培养物接种入新鲜的液体培养基，在适宜的条件下培养，定 期取样测定单位体积培养基中的菌体（细胞）数，可发现开始时群体生长缓慢， 后逐渐加快，进入一个生长速率相对稳定的高速生长阶段， 随着培养时间的延长， 生长达到一定阶段后，生长速率又表现为逐渐降低的趋势， 随后出现一个细胞数 目相对稳定的阶段，最后转入细胞衰老死亡期。如用坐标法作图，以培养时间为 横坐标，以计数获得的细胞数的对数为纵坐标， 可得到

4、一条定量描述液体培养基 中微生物生长规律的实验曲线，该曲线则称为细菌的生长曲线（growth curve , 见图3-1 ）。坨并对佃1 / h< a 硅图物. a 指c 走电. o覆亡期，图3-1细菌生长曲线从图3-1可见，细菌生长曲线可划分为四个时期，即： 延迟期， 对数生长期， 稳定期； 衰亡期。生长曲线表现了细菌细胞及其群体在新的 适宜的理化环境中，生长繁殖直至衰老死亡的动力学变化过程。 生长曲线各个时 期的特点，反映了所培养的细菌细胞与其所处环境间进行物质与能量交流，以及细胞与环境间相互作用与制约的动态变化。深入研究各种单细胞微生物生长曲线 各个时期的特点与内在机制，在微生物学

5、理论与应用实践上都有着十分重大的意 义。材料三、生长与繁殖与细胞生长量测量意义微生物在适宜的环境条件下，不断地吸收营养物质，并按照自己的代谢方式 进行代谢活动，如果同化作用大于异化作用，则细胞质的量不断增加，体积得以 加大，于是表现为生长。简单地说，生长就是有机体的细胞组分与结构在量方面 的增加。单细胞微生物如细菌，生长往往伴随着细胞数目的增加。当细胞增长到一定 程度时，就以二分裂方式，形成两个基本相似的子细胞，子细胞又重复以上过程。 在单细胞微生物中，由于细胞分裂而引起的个体数目的增加， 称为繁殖。在一般 情况下，当环境条件适合，生长与繁殖始终是交替进行的。 从生长到繁殖是一个 由质变到量变

6、的过程，这个过程就是发育。微生物处于一定的物理、化学条件下，生长发育正常，繁殖速率也高；如果 某一或某些环境条件发生改变，并超出了生物可以适应的范围时，就会对机体产 生抑制乃至杀灭作用。细菌纯培养的群体生长规律：大多数细菌的繁殖速度都很快，大肠杆菌在适 宜条件下，每20分钟左右便可分裂一次，如果始终保持这样的繁殖速度，一个 细菌在48小时内，其子代群体将达到无法想象的数量。？然而，实际情况并非如 此。将少量单细胞纯培养接种到一包定容积的新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养，定时取样测定其细菌含量，可以看到以下现象：开始有一短暂时间，细 菌数量并不增加，随之细菌数目增加很快，既而细菌数又趋稳定，

7、最后逐渐下降。 如果以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速度为纵坐标作图， 可以得 到一条曲线，称为繁殖曲线，通常又称为生长曲线。生长曲线代表了细菌在新的 适宜的环境中生长繁殖直至衰老死亡全过程的动态变化。根据微生物的生长曲线可以明确微生物的生长规律， 对生产实践具有重大的 指导意义。故根据对数期的生长规律可以得到培养菌种时缩短工期的方法 ：接种 对数期的菌种，采用最适菌龄，加大接种量，用与培养菌种相同组成的培养基。有如，根据稳定期的生长规律，可知稳定期是产物的最佳收获期， 也是最佳测定 期，通过对稳定期到来原因的研究还促进了连续培养原理的提出和工艺技术的创 建。材料四、微生物生长量的测

8、定微生物特别是单细胞微生物，体积很小，个体生长很难测定，意义也不大。 通常测定微生物的生长是测群体的生长，而测定繁殖则都要建立在计数这一基础 上。1测生长量测定生长量的方法有许多种，适用于一切微生物。1.1 直接法1.1.1 测体积它是一种较为粗放的方法，通常用于初步比较用。例如将待测培养液放在刻 度离心管中作自然沉降或进行一定时间的离心，然后观察沉降物的体积。1.1.2 称干重采用离心法或过滤法测定，一般干重为湿重的10%-20%如用离心法，将待测培养液离心，再用清水洗涤离心 1-5次后干燥，可用105C、100c或红外线 烘干，也可在较低的温度（80c或40C）下进行真空干燥，然后称干重。

9、如细 菌一个细胞一般重1012-10-13g。如为丝状真菌可用滤纸过滤，细菌可用醋酸纤维 膜等滤膜进行过滤。过滤后，细胞可用少量水洗涤，再真空干燥（40c以下），称干重。以乳酸菌为例，在液体培养基中，细胞的浓度大约为2X108个/ml。100 ml培养物可得10-70mg干重的细胞。1.2 间接法1.2.1 生理指标法与生长量相平行的生理指标很多，它们均可用作生长测定的相对值。1）测定细胞总含氮量来确定细菌浓度大多数细菌的含氮量为干重的12.5%,酵母菌为7.5%,霉菌为6.0%。总氮量与细胞粗蛋白的含量（因其中包括了杂环 氮和氧化型氮）的关系可用下式计算：粗蛋白总量=含氮量><

10、6.25含氮量的测定方法有很多，常用凯氏定氮法。此法适用于细胞浓度较高的样 品，同时操作过程也较麻烦，主要用于科学研究中。2）含碳量的测定 微生物新陈代谢的结果，必然要消耗或产生一定量的物质， 以表示微生物的生长量。一般生长旺盛时消耗的物质就多，或者积累的某种代谢 产物也多。将少量生物材料混入 1ml水或无机缓冲液中，用2ml 2%重铭酸钾溶 液在100c下加热30分钟，冷却后，加水稀释至5ml,在580nm波长下测定光密 度值（用试剂作空白对照，并用标准样品作标准曲线），即可推算出生长量。3）其它 磷、DNA RNA ATP和N -乙酰胞壁酸等的含量，以及产酸、产气、 产CO （用标记葡萄糖

11、作基质）、耗氧、粘度和产热等指标，均可用于生长量的 测定。1.2 .2 比浊法微生物在液体培养基中生长，由于原生质含量的增加，引起培养物混浊度的 增高。最古老的比浊法是采用 McFarland比浊管，用不同浓度的BaCb与稀HSO 配制成的10支试管，其中形成的BaSO有10个梯度，表示10个相对的细菌浓 度（预先用相应的细菌测定）。某一未知浓度的菌液在透射光下用肉眼与某一比 浊管进行比较，如果两者的浊度相当，即可目测出该菌液的大致浓度。精确的测定，要用分光光度计进行。在可见光的450650nmK长内均可测定。2计数法计数法即是计算微生物繁殖出的个体数目， 此法适宜于单细胞状态的微生物 或丝状

12、微生物所产生的抱子。2.1 直接法直接法即是在显微镜下直接观察细胞并进行计数的方法，其计数结果是包括 死细胞在内的总菌数。2.1.1 比例计数法是一种粗放的计数方法。将已知颗粒（例如霉菌的抱子或红细胞等）浓度的 液体与待测细胞浓度的菌液按一定比例均匀混合， 然后镜检各自的数目，求出未 知菌液中的细胞浓度。2.1.2 血球计数板法计数一定容积中的细胞总数的常用方法，此法对细胞较大的酵母菌较为适用。详细方法见实验指导书。2.2 间接法是一种活菌计数法，其原理是活菌在液体培养基中生长繁殖使液体混浊，在固体培养基表面形成菌落，然后计数活菌的方法。2.2.1 平板菌落计数法是一种常用的食品中细菌总数的计

13、数法，有标准方法将待测样品稀释，然后取适宜的稀释度样品与固体培养基混匀，凝固后培养，然后计数平板上出现的菌落数乘以样品的稀释度，即可计算出样品的含菌数。也可用涂布法将稀释样品接 种在凝固的平板培养基上，后续方法同前。此法的优点是检测的结果较为精确， 缺点是方法烦琐，获得检测结果的时间长。2.2.2 液体稀释法对未知牛¥品作10倍系列稀释。选适宜的3个连续的10倍稀释液各取5ml, 接种到3组共15支液体培养基试管中，每管接入1ml,培养一定的时间后，计 录每个稀释度出现生长的试管数，然后查MPN（most probable number, 最近似数）表，根据样品的稀释倍数可计算出其中

14、的活菌含量。例如：某一细菌在稀释计数法中的生长情况如下:稀释度.c 31010 410 5.c 61010 7.810重复数555555出现生长的管教555410根据上述结果，其数量指标为“ 541”，查统计表（表7-2）得近似值为17。然后乘 以第一位数的稀释倍数（10 5） o那么原液中的活菌数二17义100000=1.7X 10 6 0根据重复次数不同，可将统计表分为3次、4次和5 次重复测数统计表（又称5管最大或然数表）。表3-2 5次重复测数统计表数量指标近似值数量指标近似值10 °10110 210 °10 110 20100.185002.31000.2050

15、13.11100.405103.30000.455114.60010.685204.90100.685217.00200.935229.53000.785307.93011.153111.03101.153214.03201.454013.04001.354117.04011.754222.04101.754328.04112.155024.04202.255135.04212.655254.04302.755392.04554160.0在实践中，通常以5管重复为一个组，故这里仅列出5次重复测数统计表。只要知道了数量指标，就可查知近似值方法应用直 接法涂片染色法血球计数板法比浊法可同时计数/、

16、同类型的 微生物数量，常用于牛奶、土壤中的细菌计数可用于不同类型微生物的计数微生物学分析，肉汤培养物或水悬浮液中的细菌数估计问接法平皿菌落计数 法液体稀释法 薄膜过滤计数 法食品、水、土壤、医学、卫生以及培养物中的名田菌计数 因某种原闲而不能用琼脂平皿活菌计数时被采用，如牛奶等 适用于量大而且含菌数很低的材料，如空气、水等定氮法测DNA测定法主要用于代谢研究，适于细胞浓度高的样品细胞测定细胞干重同上物质法用于调查研究，适用于细胞浓度高的材料量生理指标测定微生物学分析研究法从上表中可以看出，每种方法都各有优点和局限性。只有在考虑了这些因素同需要着手解决的问题之间的关系以后， 才能对具体的方法进行

17、选择。正如前面 说过的，平皿菌落计数法是微生物学中应用最多的常规方法， 掌握这一方法的原 理和实际操作，很有必要。此法在理论上能反映活菌数。另外当用两种不同的方 法测量细菌的生长量时，其结果不一致是完全可能的。测定微生物的生长量，在理论和实践上都十分重要。当我们要对细菌在不同 培养基中或不同条件下的生长情况进行评价或解释时，就必须用数量来表示它的 生长。例如可以通过细菌生长的快慢来判断某一条件是否适合。生长快的细胞， 最终的总收获量可能没有另一些条件下的收获量大。在另一些条件下，生长速率 虽然较低，但它却可在一段时间内不断增加。因此，只有具备了有关生长的定量 知识，才能在实际应用中作出正确的选

18、择，以利于科研和生产活动的进一步开展。随着科学技术的发展，出现了一些快速测定的方法，其形式有小型纸片 （1-10cm2），圆形或长方形等。原理是在滤纸上有适宜的培养基和活菌指示剂 2,3, 5-氯化三苯基四氮口坐（triphenyl tetrazolium chloride, TTC,无色）。用 刻度吸管取一定的样品液于滤纸上或浸取样品液，置于密封包装袋中，经短期培 养，在滤纸上就会出现一定密度的玫瑰红色微小菌落。计数小红点可计算出样品的含菌量。此外还有DNA旨纹技术和PCRT增等快速测定方法。材料五、干重法测定冬虫夏草菌体量 一、菌体分离与处理方法在工业生产中，菌体分离的常用方法有离心分离、

19、过滤和膜分离等。（一）离心分离法离心分离法包括离心沉降、离心过滤和超离心三种形式（二）常规过滤法（三）膜分离法二、菌体的干燥和称量干燥的方法：主要包括烘干法、冷冻干燥法等称量：采用分析天平称量在冬虫夏草生物量的测定过程中常采用离心分离法，操作步骤如下：将滤纸放入烘箱烘干至包重待用，称量，记录重量取250mL摇瓶发酵液，倒入布氏漏斗过滤，抽干，用蒸储水洗菌体，至滤液不在带有发酵液颜色为止，弃滤液。将菌体连滤纸一起放入恒温烘箱中，60c烘干至 包重，放入干燥器中冷却到常温，称量，记录总重量，计算菌体重量。1 .为什么要测定生物生长量？2 .菌体分离的方法主要包括哪些？3 .设想一下，如果想获得菌体

20、细胞，用哪种干燥方法更好?微生物生长量的测定一一细胞干重法学习情境设计方案学习领域课程名称食品应用微生物基础总学时72学习情境名称细胞干重法使用学时2学习目标：1 .知识目标掌握干重法测定菌体生长量的原理 了解菌体生长量测定的一般方法 掌握恒温干燥的基本原理2 .能力目标(1) 专业能力能够熟练利用一般实验室的仪器 能够熟练掌握电子天平的一般操作能够熟练操作抽滤机进行抽滤能够利用恒温干燥箱进行菌体烘干(2)方法能力阅读操作标准的能力动手实施能力创新能力自主学习新技术、新知识的能力分析问题、解决问题的能力(3)社会能力沟通能力团队合作能力组织能力3 .素质目标培养规范意识培养吃苦耐劳、爱岗敬业的

21、精神加强安全意识教学内容教学方法1 .菌体生长量测定的一般方法2 .小型离心机的一般操作3 .抽滤机及布氏漏斗的操作4 .恒温干燥箱进行菌体烘干操作5 .结果分析引导文教学法任务组织（5分钟）分配任务（发放生产指令），发放 引导文；组织几个学习小组；每组各选出一 名组长。讲述法、头脑风暴、引导问题法任务策划（10分钟）根据各自学习，通过讨论等方式， 确定干重法测定菌体生长量的方 案。确定使用的设备和仪器讨论法、可视化报告法、立动交流教学法操作过程（55分钟）根据其制定的干重法测定菌体生长量的方案，教师参与实施其具体的操作过程；在控制方案中要理论知识和实际操作相结合这个过程中师生共同分析、解决操

22、 作过程中常见的问题。示范法、小组合作任务评审（10分钟）各组成员对其制定方案的的操作 进行评价；各班组成员对任务的组织、策划、 产物的观测等过程进行自评互评； 教师就各组成员在/、同阶段的个 方面的表现情况进行评价；交互评价法、旋转交换讨论法、教师归纳法教师根据操作过程中情况提出问 题，学生通过讨论方式尝试给出解 释方法，教师总结归纳解决方法。教学环境与资源教师知识与能力要求学生知识与能力准备1 .仪器分析实 训室2 .微生物基础 实验室3 .国家级精品 课网站资源1 .能熟练使用电子天平2 .能熟练进行恒温干燥箱操作3能熟练操作抽滤机4 .具备处理实验过程中的常见问题的能力5 .具备观察力和课堂的控制能力具备f的微生物知识和 发酵工艺和基础化学实验 的基础知识具有f的自学能力考