实验性变应性鼻炎与血清元素锌铜钙及细胞因子的相关性研究

1、毕业论文：实验性变应性鼻炎与血清元素锌铜钙及细胞因子的相关性研究(1)【摘要】 目的通过建立肺气虚变应性鼻炎(AR)病证复合动物模型，分别检测动物体内血清元素及细胞因子水平，观察细胞因子网络Th1/Th2失衡对于AR及肺气虚证的影响，及血清元素在体内的含量变化与细胞因子的相关性。方法采用烟熏法及TDI鼻腔激发法，建立豚鼠肺气虚变应性鼻炎病证结合模型，运用原子吸收分光光度法检测致敏豚鼠血清Zn，Cu，Ca含量，运用双抗体夹心ELISA法检测致敏豚鼠血清IFN-r，IL-4水平，并对元素值和细胞因子水平之间进行相关分析。结果肺气虚变应性鼻炎豚鼠血清IL-4升高，IFN-r下降，IFN-r/IL-4

2、比值降低，与正常对照组比较，差异显著（P0.01），并见血清Zn值升高（P0.05）。相关分析示Zn与IL-4呈正相关，与IFN-r/IL-4比值呈负相关，Ca与IL-4呈负相关，与IFN-r/IL-4比值呈正相关。结论AR疾病及肺气虚证均与Th1/Th2失衡有关，认为变应性鼻炎（AR）是以鼻腔黏膜Th2免疫反应为主的变应性炎症反应，肺气虚证是细胞因子网络自稳态动态平衡破坏的结果；在AR疾病中，Zn，Ca元素参与影响Th1/Th2平衡调节机制，提示可通过血清元素的补损，达到治疗AR的目的。 【关键词】 变应性鼻炎 微量元素 肺气虚证 动物模型 细胞因子Abstract:ObjectiveAni

3、mal model with allergic rhinitis induced on the basis of Lung Qi deficiency (LQD) pattern established earlier was prepared in gunia pigs in the way of combination with disease and pattern. Then, their serum levels of trace elements and cytokines were determined in order to investigate the influence

4、of imbalanced Th1/Th2 cytokine network on the pathological process of experimental allergic rhinitis (EAR) in the pattern of LQD and the association of their contents and levels changes with the development of this lesion.MethodsIn the experimental studies, the animal model with allergic rhinitis in

5、duced on the basis of LQD pattern was established in guinea pigs in a way of combining a disease inducing and a pattern preparation, by using the procedures of smoke inhalation and TDI nose dropping. Then, AAS was taken to detect the serum contents of trace elements Zn, Cu and Ca and double antibody

6、 sandwitch ELISA technologies were used to measure the serum levels of IFN and IL4 in them. At last, a correlation analysis of trace element contents with cytokine levels was carried out to evaluate their implications in the pathogenesis of PAR.ResultsAs shown in experimental studies, the modeled an

7、imals with EAR induced on the basis of LQD pattern significantly elevated serum level of IL4, reduced serum level of IFN and declined ratio of IFN/ IL4, with very significant differences in these values, when compared with those of healthy controls (P0.01). Meanwhile, the content of Zn was significa

8、ntly increseaed in serum of the modeled animals (P5分表示造模成功。记分方法如下： 鼻痒 轻搔鼻13次为1分，剧烈搔抓鼻四周记为2分。 喷嚏 13个为1分，410个为2分，11个以上为3分。 清涕 流至鼻孔为1分，流出前鼻孔记2分，涕流满面记3分。于末次鼻腔局部致敏后30 min，将3组豚鼠以10%水合氯醛3.5 ml/kg体重腹腔内注射麻醉，心脏采血后处死，暴露鼻中隔，用小棉签取鼻中隔表面分泌物涂片， 95%酒精固定，行苏木素-伊红染色（HE染色）。剥离双侧鼻中隔黏膜并分别固定于10%甲醛液中，石蜡包埋，每标本切片2张，分别作HE和甲苯胺蓝染

9、色，光镜下观察并行相关细胞计数：目镜上配计数格，在低倍镜下选取5个阳性细胞数较多的区域，再在高倍镜下作细胞数计数，以5个高倍镜视野下的细胞总数求均数和标准差。血清标本的获取 豚鼠麻醉后，行心腔穿刺采血。抽取3 ml血液，室温下凝固2 h，2 000 r/min离心20 min，-20冰箱保存。其中1 ml血液用于血清微量元素检测，2 ml血液用于细胞因子IL-4和IFN-检测。 血清元素检测 离心血清，取上清液，用火焰原子吸收分光光度法（AAS）检测Zn，Cu，Ca值。仪器为WYX-402型原子吸收分光光度计（沈阳分析仪器厂）。 血清细胞因子检测 采用双抗体夹心ELISA法进行检测。豚鼠血清I

10、L-4和IFN-检测试剂盒由郑州新天地医疗器械有限公司提供，按试剂盒说明操作。仪器为DG3022A型酶标仪（华东电子管厂）。1.4 统计学处理2 结果与分析2.1 肺气虚证型造模后的全身症状表现烟熏8 10 d后，A组豚鼠普遍出现咳嗽、气短喘促、口鼻分泌物增多、蜷伏少动、精神萎靡、反应迟钝、毛发零乱脱落枯槁无光泽等表现。至第10天和第12天，先后死亡2只，均有喘憋、气不足以呼吸等现象。至第15天，A组剩余8只动物均出现典型的肺气虚证表现。2.2 AR造模后的鼻部症状表现从第1次鼻腔滴药开始，致敏豚鼠均于10 min内不同程度地出现痒和喷嚏症状，但无明显清涕。上述症状随给药次数增多而逐渐加重，并

11、出现清涕。A组于用药第5天开始鼻部症状积分超过5分，B组于用药第7天开始得分超过5分，C组偶有抓鼻、喷嚏等表现，无其他症状。造模第6天时，A组死亡1只；第9天和第11天，B组，C组先后各死亡1只。A，B组动物死亡时有鼻流血及偏瘫现象。AR造模成功后，各组症状积分分别为A组（7.230.98）（6.460.75）（0.600.58）分。2.3 鼻腔分泌物涂片脱落细胞学检查结果A组和B组致敏豚鼠鼻腔分泌物涂片中可见大量嗜酸性粒细胞，间杂有中性粒细胞和淋巴细胞；C组鼻腔分泌物涂片中未见嗜酸性粒细胞。见图1。2.4 鼻腔黏膜病理组织学观察A，B两组致敏豚鼠鼻腔黏膜HE染色均显示不同程度的水肿、血管扩张

12、，固有层内可见散在或灶性以嗜酸性粒细胞为主的炎性细胞浸润。1%甲苯胺蓝染色可见多量肥大细胞，并沿血管壁成簇分布，表现为脱颗粒相。C组豚鼠鼻腔黏膜未见明显嗜酸性粒细胞浸润，肥大细胞散在分布。见图23。细胞计数结果，A组鼻腔黏膜中嗜酸性粒细胞（EC）为（8.931.05），B组为（8.761.25），C组鼻腔黏膜中未见EC；A组鼻腔黏膜中肥大细胞（MC）为（6.211.89），B组为（6.751.48），C组为（0.520.30）。A、B组动物鼻腔黏膜中EC、MC细胞数均显著高于C组（P0.01）。2.5 血清细胞因子检测结果见表1。表1 实验组、模型组与健康组动物血清IL-4和IFN-水平比较(

13、略)2.6 血清元素检测 结果见表2。表2 实验组、模型组与健康组动物血清Zn，Cu，Ca水平比较(略)2.7 实验动物血清细胞因子与元素的相关性分析 结果见表34。表3 肺气虚证AR组动物血清细胞因子与元素的相关性分析（略）表4 模型组动物血清细胞因子与元素的相关性分析（略）本篇论文由网友投稿，3COME文档只给大家提供一个交流平台，请大家参考，如有版权问题请联系我们尽快处理。3 讨 论3.1 关于AR病证结合造模研究中医学认为肺气虚所致卫表不固，外邪（变应原）侵袭是鼻鼽发病的基本环节，即肺气虚是鼻鼽发病的根本内因。建立“肺气虚-变应性鼻炎”病证结合的动物模型，成为AR中医病机研究的重要条件

14、，也是深入研究血清元素及细胞因子与AR病因病机关系的重要保证。目前，国内制作肺气虚证动物模型多用烟熏法，先造成动物咳喘之证，进而发展成肺气虚证候3。中医学认为，久病咳喘，可以耗伤肺气，从而导致肺气虚，故烟熏造模法符合中医理论要求。本实验应用特制烟熏箱及烟熏艾条造模， 10 d后实验动物均出现咳嗽喘促，口鼻周围有白色分泌物，蜷伏少动，精神萎靡，毛发脱落枯槁无光泽等改变，具备了肺气虚证的主要特征。AR疾病造模采用了TDI鼻腔黏膜激发法，因为考虑到呼吸道吸入变应原的方式更符合人类变应性鼻炎发病过程，也是基于临床所见变应性鼻炎患者，都可以找到一个较为明确的吸入性致敏因素，包括空气污染、抗原刺激等这样的

15、基本事实。肺气虚证造模完成后，A组与B组豚鼠同时开始致敏。A组豚鼠在致敏第5天时，鼻部症状积分超过5分；B组豚鼠在致敏第7天时，鼻部症状积分超过5分。同时伴有肺气虚病理基础的A组豚鼠AR模型成功时间较体质正常的B组豚鼠提前，说明肺气虚证状态更易于诱发变应性鼻炎。EC、MC为AR发病的重要效应细胞和基本病理特征。A组和B组动物鼻分泌物涂片中，均可见大量EC聚集，而C组则无。致敏豚鼠鼻黏膜还出现急性炎症表现，病理组织学观察见黏膜增厚，固有层血管扩张，腺体增生，黏膜下血管周围大量嗜酸性粒细胞及少量中性粒细胞浸润，MC增多并处于脱颗粒相。C组动物鼻黏膜未见这类改变。总之，行为学和病理组织学观察均说明，

16、本实验致敏豚鼠出现了AR疾病的典型改变。烟熏法结合TDI鼻腔激发法制作的肺气虚型AR病证结合动物模型基本成功，可供进一步实验研究之用。3.2 细胞因子与AR病证的关系AR是IgE介导的I型变态反应，呈T细胞依赖性，由肥大细胞启动，表现为鼻腔黏膜以嗜酸性粒细胞浸润为特征的炎症过程。近年来，发现多种细胞因子参与I型超敏反应的发病过程。从IgE合成到各种炎性介质导致的炎症反应过程都受到细胞因子的调控。在变应性炎症反应中发挥核心作用的是CD4+T细胞，通过释放一系列细胞因子而调节急性和慢性变应性炎症反应。根据所分泌细胞因子的不同，CD4+辅助T细胞又可分为两个亚型，即Th1(type 1 helper

17、 T cells)和Th2 (type 2 helper T cells)细胞。Th1细胞分泌IL-2、IFN-、TNF-等Th1类细胞因子，主要介导细胞免疫反应；Th2细胞分泌IL-4、IL-5、IL-6等Th2类细胞因子，主要介导体液免疫反应。该二类细胞及各自分泌的相关细胞因子形成复杂的网络体系，共同调节机体的免疫应答过程，并具有相互抑制、相互调节效应，以维持动态平衡，参与保证机体的正常功能。变应性鼻炎是一系列细胞间异常相互作用的结果，Th1/Th2功能失衡可能是中心病理环节。故本实验以具有代表性的Th1和Th2类细胞因子IFN- (interferon-)和IL-4（interlukin

18、-4）为指标，观察AR发病过程中IFN-/IL-4的变化状态和相互关系。结果显示，与C组比较时，A组和B组均见不同程度的IL-4水平升高，IFN-水平下降，IFN-/IL-4比值降低，但B组IL-4升高和IFN-下降幅度无统计学意义，仅IFN-/IL-4比值降低较为明显（P0.05）。而在A组动物，该3项指标的变化幅度均有显著性统计学意义（P0.01）。IL-4是Th2细胞释放的关键性细胞因子，对Th2细胞极化有重要的诱导作用4，并可抑制Th1细胞的增殖。IL-4是激活B淋巴细胞使之表达IgE的重要因子之一，又称为IgE增强因子，也是肥大细胞生长因子，能促进多量IgE分子与肥大细胞表面的IgE

19、受体结合，激发肥大细胞脱颗粒，释放一系列与炎症有关的介质，引起黏膜水肿，黏液分泌亢进，气道痉挛。还可通过上调血管细胞黏附分子VCAM-1在内皮细胞的表达，以及上调嗜酸性粒细胞趋化因子的产生而促进EC在局部聚集，促进炎症发展5，续发变应性炎症的各种病理改变。本研究中所见致敏豚鼠IL-4水平的升高，即提示AR疾病中存在着Th2细胞占优势的免疫反应，可能在变应性鼻炎病理过程中扮演关键性因子的作用。而致敏豚鼠IFN-水平的下降，则可能进一步加剧了Th2细胞的优势免疫反应，促进了AR病情的发展。IFN-为Th1类细胞的标志性细胞因子，可抑制Th2细胞的增殖活化，减少IL-4的产生，并拮抗IL-4的各种生

20、物学效应，阻止IgE的合成。IFN-和IL-4均为B细胞合成IgE的调节因子，Th1/ Th2细胞功能失衡与IgE的合成速率有密切关系。致敏豚鼠出现的IL-4水平升高和IFN-含量下降，均为有利于IgE合成增高的促成因素，可以加速实验性AR的发生。相关分析发现IFN-与IL-4呈负相关（r= -0.774, P=0.04），进一步提示IL-4和IFN-在AR发病过程中可以发挥相互制约的作用，是一对拮抗性因子，共同调节IgE的合成与释放，维持IgE的体内水平。Th1和Th2平衡消长是机体免疫调节反应的基本方式，Th1/ Th2细胞因子网络失调是变应性鼻炎发生的基本机制之一6。本实验结果还提示，肺

21、气虚条件下致敏，其所诱发的变态反应病情更为严重，Th1/Th2失衡更加显著。 肺气虚证是指肺的功能活动减弱所表现的症候。研究结果表明，肺气虚证与机体免疫功能低下或紊乱有关。如有人用分段支气管肺灌洗术研究表明，肺气虚证患者细胞免疫功能受到抑制，免疫调节功能紊乱7。检测慢阻肺患者的免疫功能，发现肺气虚证患者体液免疫和细胞免疫均不同程度低下8。Th1/Th2平衡是机体细胞免疫和体液免疫维持正常状态的重要机制之一，Th1/Th2失衡与肺气虚病机的关系值得深入探讨。本实验中，肺气虚证致敏豚鼠表现IL-4分泌亢进，IFN-水平下降，及IFN-/IL-4比值降低。与健康组比较，差异显著。结果提示，肺气虚证与

22、Th1/Th2功能失衡有关。通过临床观察，有人发现肺气虚患者血清IFN明显低于正常人9，提示肺气虚证可出现Th1类细胞因子表达抑制。本实验结果与之相符。还有作者检测了肺气虚型肺气肿大鼠血中细胞因子水平，发现IL-6，IL-8，TNF-升高，认为是肺气虚证发生发展的重要原因之一10。总之，虽然细胞因子水平与肺气虚证病机的关系研究才刚刚起步，有待深入探讨和验证，但已有人提出，中医“证”（主要是虚证）的本质是诱发基因表达的细胞因子的综合性生物学效应，其发生的分子机制，是由于细胞因子网络自稳态动态平衡破坏的结果11。这一观点，也是对本实验结果的有利解释，即肺气虚证也是细胞因子网络的失衡状态。3.3 A

23、R病理中血清元素与细胞因子的相关性有临床研究证实，血清元素与AR病理、免疫功能状态及中医证型关系密切12。致敏豚鼠血清Zn，Cu，Ca水平检测结果显示，肺气虚证AR组豚鼠出现Zn代谢紊乱，与健康对照组相比，Zn值显著升高（P0.05）；血清Zn值与IL-4水平呈正相关，与IFN-/IL-4比值呈负相关，且Zn/Cu比值与IL-4水平呈正相关。结果提示，Zn值的变化，与AR疾病中Th1/Th2功能失衡关系密切。有人发现，感染线虫的Zn缺乏鼠，其T细胞分泌IFN-和IL-4、IL-5的能力下降13。还有人证实，缺Zn可使IL-4分泌减少14。这都与本实验所见Zn与IL-4呈正相关的结果相符。有作者

24、用豚鼠制作过敏性哮喘模型，于哮喘激发后14 h，豚鼠Zn值明显升高，认为Zn参与的是迟发相变态反应15。本研究还发现，AR组豚鼠Ca含量与IL-4水平呈负相关，与IFN-/IL-4比值呈正相关，提示Ca也可能参与了Th1/Th2失衡状态的形成，从而影响AR病理的发生发展。正常水平的Ca可维持细胞膜的稳定性，减少组织细胞的损伤，阻止肥大细胞脱颗粒，减轻变态反应。在AR发病时，钙通道开放，大量Ca向细胞内流，参与相关介质的释放，如MC组胺释放有Ca2+子参加，从而引发变应性炎症。PAR患者血浆及鼻分泌物中Ca2+含量测定结果提示，Ca2+参与了变应性鼻炎的病理过程16。从本质上讲，变应性鼻炎就是鼻

25、黏膜对变应原的一种超敏反应，但变应原本身并不能直接引起鼻黏膜的任何变化，它所携带的相关信息，必须通过翻译成细胞所能识别的“语言”逐级向细胞内传递，这种“语言”传递过程主要通过信使分子来实现。细胞因子、激素为第一信使，Ca2+为主要的第二信使物质。Ca2+具有细胞凋亡诱导和抑制双重效应。胞内游离Ca浓度的改变是细胞功能调节的关键环节之一17。凋亡是由基因控制的自主有序性细胞死亡，涉及许多重要的生理过程。研究发现，缺Zn可诱导淋巴细胞的凋亡。在凋亡后期，Zn通过Ca/Zn平衡状态调节核酸内切酶的活性而实现其对细胞凋亡的调控作用18。Zn，Ca对细胞凋亡的影响是其免疫功能效应的一个重要组成部分。此外

26、，本组资料还表明，Zn含量与IL-4水平呈正相关，与IFN-/IL-4比值呈负相关，而Ca含量与IL-4水平呈负相关，与IFN-/IL-4水平呈正相关。这就说明，Zn，Ca以反相效应模式参与Th1/Th2的平衡调节，但其具体机制还需进一步研究探讨。 综上所述，在AR病理中，血清元素与细胞因子效应密切相关，相辅相成，互相影响。两者不同效应在体内的代数和，是AR疾病及中医“证”发生发展的极其重要的相关调控因素。【参考文献】 1陈小野.实用中医证候动物模型学M. 北京：北京医科大学中国协和医科大学联合出版社，1993:110.2赵秀杰，董震，杨占泉，等.鼻超敏反应实验模型的建立J.中华耳鼻咽喉科杂志，1993，28（1）:11.3熊大经，李平. 肺气虚慢性鼻炎模型的建立J.中国中西医结合耳鼻咽喉科杂志，1999，7（1）:14.4张明，赵利敏 . Th2细胞的极化J.山东大学基础医学院学报，2003，17(6):369.5余少卿 .变应性鼻炎相关基因的研究进展J.