大鼠原位肾移植技术的改进及急性排斥反应观察

1、大鼠原位肾移植技术的改进及急性排斥反应观察                               作者：王龙信，王禾，杨晓剑，秦卫军，张更，于磊，袁建林【关键词】  大鼠    Improved techniques and observation of

2、 acute allograft rejection of orthotopic renal transplantation in rats       【Abstract】 AIM: To modify the techniques of orthotopic renal transplantation in rats and to observe the acute allograft rejection of renal transplantation in Wistar rats. METHODS: Orthotopic re

3、nal transplantation in 46 Wistar rats which had received SD renal grafts was performed by using techniques improved in vascular anastomoses and the procurement of donor grafts. The 36 rats which survived more than 7 d after transplantation were randomly divided into the control group (n=18) and the

4、therapy group (n=18). FK506 0.1 mg/(kgd) was subcutaneously injected in therapy group daily for 1 week after operation. The acute allograft rejection of all renal transplanted rats was observed. RESULTS:  In the 46 operations, 36 (78.3%) rats survived more than 7 d after transplantation and 10

5、rats died. The operation time was 2-2.5 h, including the warm ischemia time (5-10 min), the cold ischemia time (15-30 min), the time of vascular endside anastomosis for inferior vena cava (5.0-10.5 min), the endside arota anastomosis time (8.5-12.0 min). The control group all died 7-14 d after trans

6、plantation and the histopathologic examinations showed  acute allograft rejection. But the FK506 therapy group survived more than 14 d. CONCLUSION:  The improved techniques can increase the survival rate of renal transplanted rats. The acute allograft rejection frequently occurs in the 2 w

7、eeks after operation. FK506 therapy can effectively enhance the allograft survival rate after transplantation.    【Keywords】 kidney transplantation;  graft rejection; rats    【摘要】 目的：对大鼠原位肾移植模型进行技术改进,并观察异基因肾移植大鼠急性排斥发生的规律. 方法：从供体的切取及血管吻合等方面进行技术改进,供肾取自SD大鼠，受体为Wistar大

8、鼠，共进行肾移植手术46例,将手术成功病例随机分为FK506FK506, 0.1 mg/(kgd),术后第1日至第7日皮下注射治疗组（18例）和对照组(18例),观察移植术后急性排斥发生情况. 结果：共进行手术46次，36只动物存活时间超过7 d，10只死亡，手术成功率为78.3%，手术时间22.5 h,其中热缺血时间510 min，冷缺血时间1530min，静脉吻合时间为5.010.5min,动脉吻合时间为8.512.0min,对照组大鼠术后714 d全部死亡,组织病理学检查提示有急性排斥反应发生,而FK506治疗组生存良好(存活时间大于14 d). 结论：对大鼠肾移植技术进行改良后可明显提

9、高移植大鼠的生存率,术后2 wk是大鼠急性排斥反应高发时期，运用免疫抑制治疗可诱导大鼠移植物的长期存活.    【关键词】 肾移植;移植物排斥;大鼠    0引言    为研究肾移植后的免疫变化和药物对肾移植的影响,我们参考文献1-3,对大鼠原位肾移植技术进行了改进，建立了一种稳定可靠实用的大鼠原位异体肾移植的模型,并对异基因移植后急性排斥反应的发生规律进行了探索，为研究移植排斥、耐受等方面提供了可靠的基础.    1材料和方法    1.1材料

10、供体为SD大鼠,体质量250300 g,受体为Wistar大鼠,体质量300350 g，均为雄性,由第四军医大学实验动物中心提供. 显微外科手术器具1套（上海医疗器械集团有限公司）, 双极电凝器1台（上海医疗器械集团有限公司），常规手术器具若干,医用无损伤缝合线(90, 80, 70，上海医用缝合线厂),10 g/L戊巴比妥钠、肝素、等渗盐水、冰林格氏液、阿托品、抗生素.    1.2方法    1.2.1供体手术供受体术前均禁食12 h，不禁水，麻醉用10 g/L戊巴比妥钠40mg/kg腹腔注射，并注射阿托品0.1 mg,腹部消毒，

11、清洁手术. 取剑突至耻骨联合正中切口，两侧延长至双侧肋缘下，大鼠尾静脉注射含25×103 U/L的肝素盐水2 mL,依次进腹，充分显露左侧肾脏及肾蒂. 电凝结扎肾上腺动静脉和精索静脉，游离左输尿管，上至左肾下极，下至入膀胱处，注意保留输尿管周围血供. 将膀胱完全游离后，湿盐水纱布覆盖，回复原位，暂不切取输尿管及膀胱组织. 从髂血管分叉处开始游离下腔静脉及主动脉，30丝线仔细结扎主动脉及腔静脉的分支，主动脉向上分离至肠系膜上动脉，腔静脉分离至右肾静脉下. 钝性加锐性分离左肾动、静脉之间的脂肪及结缔组织，注意避免损伤肾蒂. 70线分别结扎左肾动、静脉下的主动脉和腔静脉. 用静脉夹阻断右肾

12、静脉下的腔静脉，结扎肠系膜上动脉, 夹闭其上方腹主动脉，从左肾动脉下方约1 cm的腹主动脉中插入4号针头，以4林格氏液(含肝素25×103 U/L)进行原位灌注，灌注开始时即将右肾静脉下方1 cm处腔静脉用显微外科剪剪一喇叭型缺口作为静脉流出道，直至左侧肾脏颜色变白，腔静脉流出液清亮时停止. 将与肾动脉相连的腹主动脉段从正中剪开1 cm左右，用显微剪修剪以左肾动脉为中心的腹主动脉瓣呈椭圆形，长宽约2 mm，下腔静脉流出道处用两根90无损伤丝线分别从缺口上下角穿过，然后再用两根90线分别在其中点穿过，剪断此处腔静脉，四线均不打结，插入一直径为1.5 mm的硬膜外导管支撑静脉管壁. 修剪

13、膀胱为5 mm左右的膀胱瓣，放入4的林格氏液中待用.百事通     1.2.2肾移植手术进腹后，肠管用湿盐水纱布包盖并向上推向右侧. 电凝左肾上腺动静脉及左精索静脉，充分游离左肾蒂上下方的腹主动脉、下腔静脉，分离出左肾动脉及左肾静脉， 30丝线双重结扎切断左肾动脉，阻断左肾静脉上下的腔静脉的血流，用显微外科剪在腔静脉上纵行剪开静脉管壁，略长于肾静脉的直径，剪断肾静脉，用4，25×103 U/L肝素生理盐水冲洗静脉管腔，结扎切断左输尿管，整块切除左肾. 将移植肾从冰林格氏液中取出，表面以冰晶纱布包裹放入原肾脏位置. 在裸眼直视下进行血管吻合. 先吻合静脉,

14、再吻合动脉. 静脉吻合:将原来留于供体肾静脉上下角的90线分别与腔静脉开口处的上下角缝合，抽去支撑的硬膜外导管，将位于供体肾静脉两角中点处两根90线分别与腔静脉开口的中点缝合，依次连续缝合静脉背、腹侧,共810针，在缝合最后2针时,于肾静脉内注入4， 25×103 U/L肝素生理盐水以排出空气. 动脉吻合4: Lee氏夹阻断肾动脉上下的腹主动脉血流,在原肾动脉处作一纵行切口,长度与供肾动脉腹主动脉瓣长径相符,用肝素盐水冲洗管腔后,用90线将带有腹主动脉瓣的肾动脉与腹主动脉进行端-侧吻合, 先缝合主动脉上下角，然后间断吻合血管后、前壁，共1012针，在吻合最后一针前,肝素盐水冲洗血管腔

15、. 开放血流:检查动静脉吻合口无异常后,去除供肾表面包裹的冰晶纱布，先松开肾静脉上的静脉夹,然后开放腹主动脉上下两个Lee氏夹,并用80左右等渗盐水在供肾上复温,一般数秒内可见移植肾实质变鲜红,如吻合口有渗血，用干明胶海绵轻压血管吻合口12 min，观察移植肾灌注及尿液流出情况.当输尿管出现尿液后,开始输尿管膀胱瓣和受体膀胱端侧吻合,在膀胱底部剪一直径与输尿管膀胱瓣直径一致的切口,用70线全层连续套式缝合输尿管膀胱瓣-膀胱，固定移植肾. 关腹前，腹腔中倒入10 mL温生理盐水(内含氨苄青霉素50 mg)术后动物单笼饲养，40 W电灯照射24 h.    2结果&#

16、160;   在进行的46次手术中，36只动物存活时间超过7 d，10只死亡，其中4只术中即呼吸心跳停止，6只术后48 h内死亡，手术成功率为78.3%，平均手术时间22.5 h,其中热缺血时间510 min，冷缺血时间1530 min，腔静脉吻合时间为5.010.5 min,动脉吻合时间为8.512.0 min,动物若能平稳渡过48 h，一般均能长期存活. 4只术中死亡原因为2只麻醉过深，2只失血性休克，6只术后数小时内死亡主要原因吻合口血栓形成、吻合口瘘、尿漏. 组织病理学检查示移植肾组织缺血性梗死，尚无排斥反应发生. 将手术成功的肾移植大鼠随机分为2组,对照组:18只

17、,不进行抗排斥治疗;治疗组:18只,术后第17日每日皮下注射FK506 0.1 mg/kg.  对照组术后3 d后动物表现为精神萎靡，行动迟缓，进食差，尿量减少，均于术后2 wk内死亡，组织病理检查示典型的急性细胞性排斥反应，并伴有毛细血管内微血栓形成,治疗组未出现急性排斥反应现象，排斥反应判断采用国际统一的“Banff Schema”5移植肾病理诊断标准.    3讨论    大鼠原位肾移植模型已广泛应用于移植免疫、组织病理和器官保存等方面的实验研究. 有关大鼠肾移植模型建立方法国内外报道较多，但各有利弊，目前有几种大鼠的

18、肾移植模型6大致分：动脉Fisher方法或Fabre的方法缝合；静脉Fabre法缝合、Kamada J法套扎法；输尿管有输尿、输尿管端-端吻合或套管，输尿管带瓣膀胱端-侧吻及输尿管皮肤造瘘术. 近年来，不断有人在供体切取、血管吻合、输尿管吻合等各方面进行了不同术式的探索与改进，在器官切取方面，Grau等7对受体进行双肾脏移植，节约了供体资源，尚攀峰等8用动脉套叠吻合技术进行动脉吻合，缩短了动脉吻合时间，Pietsch等9和Gu等3在输尿管吻合进行应用支架管进行输尿管-输尿管吻合，Schumacher等1和Pahlavan等2对大鼠肾移植手术的各种手术方式进行了评价，认为在血管吻合方面，应用显微

19、外科技术进行端-端吻合或端-侧吻合虽比应用袖套管吻合难度大，费时也较长，但对血流动力学影响小，比较符合正常生理情况，而在输尿管吻合方面并不推荐应用输尿管支架管进行输尿管-输尿管吻合，认为增加了技术难度，但效果并不优于带膀胱瓣的输尿管-输尿管吻合.我们的研究在综合现有各种肾移植模型特点后，并结合自身的操作实践，对大鼠原位肾移植模型的供体切取及血管吻合等方面进行了改进,不借助外科显微镜，在裸眼直视下进行手术，手术操作简单，且更为直观快捷. 其技术要点包括:原位肾切除，供肾动、静脉与受体腹主动脉、下腔静脉端-侧吻合,供体输尿管膀胱瓣与受体膀胱吻合. 其特点主要有:首次采用四线定位法进行肾静脉吻合.

20、我们认为，在大鼠肾移植手术中，静脉吻合是血管吻合的难点，因为静脉切取后，静脉塌陷造成静脉壁相互粘贴，而且静脉回缩与肾蒂中间的脂肪及结缔组织辨认困难，缝合难度大，很容易缝至对侧壁，传统的静脉吻合方法即使在显微镜下吻合也较为困难，技术不易掌握，且需时长，而利用Cuff管吻合虽然简化了静脉吻合操作，但不符合血流动力学要求，易形成涡流及静脉血栓，因此我们在实践中对肾静脉吻合的方法进行了改进，首次采用四线定位的方法，即在切取肾静脉时先用4根90丝线分别于静脉上下角及中点穿过作牵引，中间用一直径1.5 mm的硬膜外导管作支撑，从而防止静脉塌陷后静脉回缩导致的辨认不清或辨别困难，在进行静脉吻合时定位明确，方

21、法简便易行,大大缩短了静脉吻合时间，这在国内外文献中还未见相关报道. 对于动脉吻合，我们在切取血管时即按手术吻合要求取所需血管瓣的大小，稍加修整即可，缩短了在冰浴中进行血管修整的时间，大大缩短了供肾体外的冷缺血时间，血管吻合采用标准的显微外科技术，采用间断吻合动脉3，避免了因吻合因素导致的血管狭窄. 取供体左侧肾脏时，并不常规切除右肾，节省了手术时间，且进行移植时对受体也保留右侧健康肾脏,延长大鼠存活期.对于急性排斥反应，我们观察异基因肾移植大鼠的急性排斥反应主要发生在术后2 wk内，皮下注射免疫抑制剂1 wk即可诱导动物长期存活，这与临床实际还存在差别，具体机制尚需进一步深入研究. 

22、;   【参考文献】1 Schumacher M，Van Vliet BN，Ferrari PKidney transplantation inrats： an appraisal of surgical techniques and outcomeJ. Microsurgery，2003,23(4):387-394.2 Pahlavan PS, Mehrabi A, Kashfi A, et al. Guidelines for prevention and management of complications following kidney transplantation in rats J. Transplant Proc, 2005,37(5):2333-2337.3 Gu YL, Dahmen U, Dirsch O, et al. Improved renaltransplantation in the rat with a non