动态比浊法对注射用辅酶A细菌内毒素检查的研究

1、    动态比浊法对注射用辅酶A细菌内毒素检查的研究        摘要采用动态比浊定量法检测注射用辅酶A细菌内毒素含量，减少由于供试品本身含有细菌 内毒素对检查法研究的影响。结果表明，供试品浓度为0.125iu/ml时可排除干扰因素，以标示灵敏度为0.125Eu/ml的鲎试剂可用于本品细菌内毒素检测，与部颁标准热原检查结果一致。关键词注射用辅酶A动态比浊法细菌内毒素检查法干扰实验辅酶A为体内乙酰反应的辅酶，对糖、脂肪及蛋白质代谢起重要作用。注射用辅酶A(Coenzym e

2、A)为部颁标准1所载品种，热原检查采用家兔法。本文应用中国药典(95版)二 部 2细菌内毒素检查法，探讨辅酶A细菌内毒素检查可行性；采用动态比浊定量法预 先检测供试品内毒素含量可以提高结果的可靠性。1实验材料1.1细菌内毒素工作标准品，规格10Eu/支，批号9606，中国药品生物制品检定所制。1.2鲎试剂，灵敏度0.5Eu/ml，批号990729；灵敏度0.25Eu/ml，批号990414，灵 敏度0 .125Eu/ml，批号990402；灵敏度0.06Eu/ml，批号980318；均为湛江海洋生物制品厂生产 ，使用同厂生产的细菌内毒素检查用水。1.3注射用辅酶A，批号990504，开封双汇生

3、化制药厂。1.4细菌内毒素测定仪BET-16，天津大学无线电厂。1.5电热恒温水浴箱19A，德国Julabo。旋涡混合器MSI(德国)。实验所用器皿经250干 烤1h除去外源性内毒素。2方法与结果2.1细菌内毒素限值(L)的确定文献记载3 药品细菌内毒素限值 L= K/M, 式中K值国际规定静脉注射为5.0 Eu/ kg。部颁 标准规定本品热原检查配成浓度为5iu/ml，剂量1ml/kg静脉给药，即M值为5iu/kg，因此本 品L值为1Eu/iu。2.2供试品的最大有效稀释倍数和供试品浓度供试品的最大有效稀释倍数(MVD)按下式计算：MVD=CL/其中C=5iu/ml,L=1Eu/iu。当采用

4、为0.5、0.25、0.125、0.06Eu/ml的鲎试剂，MVD分 别为10、20、40、80，其相应的供试品浓度为0.5、0.25、0.125、0.06iu/ml。2.3鲎试剂灵敏度复核按中国药典(95版)二部附录细菌内毒素检查法进行复核，结果显 示，实验所用鲎试剂灵敏度均符合规定。结果见干扰实验。2.4供试品内毒素含量测定2.4.1标准曲线的制备采用动态浊度定量法，用细菌内毒素测定仪检测一系列连续浓度的细菌内毒素标准品稀释液 ，并以细菌内毒素检查用水做阴性对照，制备标准曲线(检测时间：8400秒)。1(=0.125 Eu/ml)。1动态-浊度定量法标准曲线(T50归一化法)2.4.2供试

5、品内毒素的含量用细菌内毒素测定仪定量检测一系列浓度的供试品溶液(检测时间：8400秒)。根据标准曲线 结果表明供试品各溶液含细菌内毒素均<0.01Eu/iu。很微量的细菌内毒素对实验结果不产生 影响。2.5干扰试验2.5.1供试品干扰试验根据所用鲎试剂的标示灵敏度(b)配制供试品的相应浓度，用各个浓度的供试品溶液将细 菌内毒素标准品制成不同浓度细菌内毒素溶液。按鲎试剂灵敏度复核方法检测，并用细菌内 毒素检查用水做阴性对照，当Et值在0.52.0Es时，则认为供试品在该浓度时对鲎试验不存 在干扰作用3。结果见表1。从表1看出，供试品的浓度为0.5iu/ml(MVD=10)和0.25iu/m

6、l(MVD=20)时有干扰作用。最高 无抑制浓度为0.125iu/ml，最大有效稀释倍数为40。2.6注射用辅酶A细菌内毒素检查法与家兔法比较对3个厂家27批样品分别用细菌内毒素检查用水稀释成0.125iu/ml，用灵敏度0.125Eu/ml 的鲎试剂进行细菌内毒素检查，结果均为阴性，与家兔法结果一致。表1注射用辅酶A干扰试验结果(n=30)标示b Eu/ml供试品浓度细菌内毒素浓度(Eu/ml)阴性对照 EsEt10.50.250.1250.060.030.0150.5无热原水+- -0.2510(0.5iu/ml)+-+-0.210.25无热原水+- -0.12520(0.25iu/ml)

7、+-0.060.125无热原水+- -0.12540(0.125iu/ml)+- -0.070.06无热原水+- -0.08780(0.06iu/ml)+- -0.053讨论3.1本文采用动态浊度定量法检测注射用辅酶A的细菌内毒素，可以减少供试品本身含有 细菌内毒素对实验结果的影响。3.2本品对细菌内毒素检查有一定干扰作用，但供试品浓度为0.125iu/ml时可排除干扰 因素。以标示灵敏度为0.125Eu/ml或更高灵敏度的鲎试剂可用于样品的细菌内毒素检测。 3.3本法经多个厂家产品检测均与家兔法结果一致，但较家兔法简便、经济、快速和灵敏 度高。许惠英（广东省人民医院广州 510180）刘伟祥（广东省人民医院广