汉恒生物无缝克隆试剂盒使用说明(附原理)

1、HB-infusionTM无缝克隆试剂盒使用说明附原理说明一、产品简介HB-infusion TM无缝克隆试剂盒是一种新型、快速并且高效的Gibson Assembly DNA 定向克隆技术，可以在任意载体的任意位置一次插入多个目的基因片段。HB-infusion TM无缝克隆试剂盒操作极其简单，仅需在载体的克隆位点进行线性化，并在插入片段 PCR引物的5 '端引入与载体克隆位点两端完全一致的1525 bp同源序列图1,图3。将上述线性化的克隆载体和带有同源序列的PCR片段按适宜比例混合，并参加 HB-infusion TM Master mix，通过反响体系中DNA外切酶、DNA聚合

2、酶以及连接酶的在50 C反响20 min即可快速完成定向克隆，阳性率几近 100%。图1. HB-infusion TM快速克隆试剂盒原理示意图。1.线性化目的载体左上；2. PCR获取目的片段。设计的引物5 需要和线性化载体末端有 1525 bp的重叠图中蓝色和黄色片段，细节可参考图 3； 3.按照一定比例把二者混合在HB-infusion TM的2预混液内，50 C反响20 min后直接转化即可。二、HB-infusionTM试剂盒的优点1. 相比于传统的同源重组的无缝克隆方法进行，HB-infusion TM试剂盒更高效，操作更简单，只需要一次反响即可完成定向克隆；2. 对酶切位点无要求

3、，可以把目的片段插入到任意载体的任意位点;3. 连接片段之间不会引入任何其他序列;4. 可以同时克隆多个片段三、产品包装产品组成使用次数体积2 x HB-i nfusio nTM Master mix20 tests200 lPositive linearized pUC vector250 ng 5 tests25 lPositive control insert (500 ng)5 tests25 l储存条件-20 C四、使用说明汉恒生物建议2-3个片段连接时，DNA片段的使用总量为0.020.5 pmols ，46片段连接时参加的DNA总量为0.21.0 pmols。DNA拼接效率随着拼

4、接片段的数量增加或者拼接片段长度的增加逐渐降低。附：片段摩尔数量计算公式：pmols=片段质量ng 1000/碱基对数650 daltons碱基数越多，pmols越少；质量越大，pmols越多，举例如下:线性化载体5000 bp 50 ng插入片段500 bp 1025 ng注：50 ng 的 5000 bp0.015 pmols 的线性化 dsDNA 和 1025 ng0.030.075 pmols500 bp 的 PCR 产物体系PCR 产物和线性化载体的摩尔比 =2 : 15 : 1五、操作步骤1. 制备线性化载体和插入片段1.1. 载体制备-线性化处理在目标载体质粒上选取适宜的位点进行

5、单酶切或双酶切，对酶切后的载体进行割胶纯化。切开的质粒明显分开。2. 质粒单酶切容易造成载体切割不完全和自连，导致假阳性的产生。因此，必须单酶切的时候建议延长酶切时间并脱磷处理酶切2h-过夜，CIP处理20 min ，同时做好空载的对照。3. 请务必跑胶回收线性化的载体，否那么非线性化质粒会带来极高的背景。4. 一种特殊情况：如果采用双酶切彻底线性化载体，而插入片段又没有双酶切的识别位点，也可以跳过纯化步骤，只需热失活内切酶即可用于下一步拼接反响。GGCCCGACTGATGmx -CTEamH I>15 bp图2. PCR法线性化载体示意图。在插入位点两侧设计一对方向相反的引物对载体进行

6、扩增，通过跑胶回收获取线 性化载体片段。选取适宜的位点，设计正向和反向引物直接进行载体质粒的PCR扩增，一般载体长度均大于3 kb，建议采用高保真的DNA聚合酶扩增。为了防止模板质粒 DNA对后续试验的影响，建议对 PCR扩增后的线性化载体进行割胶纯 化，去除环状模板质粒，提高阳性率。1.2. 目的插入片段制备设计引物进行目的片段PCR扩增，引物设计要保证目的片段两端有 1525 bp序列与线性化载体的两端一致重叠序列的Tm 48 C,可以简单假设A-T碱基对=2 C，G-C碱基对=4 C便于拼接反响的进行。PCR引物包括5'端与载体同源的1525 bp 以及目的片段特异性序列2025

7、bp 见以下图3。PCR产物经跑胶纯化待用。Geiw ip«cifk F>15 bpEg#气. - CT-TGGCAGTCTTAATTCGAAC7TAA -图3.采用HB-infiusionTM试剂盒时PCR上下游引物设计例如。针对双酶切法线性化载体设计插入片段的PCR引物,其重叠区域为1525 bp+酶切位点，这样重组成功的质粒上会完好保存此两个酶切位点。如果是PCR法线性化载体，扩增插入片段的PCR引物5'端直接设计成与线性化载体末端1525 bp重叠即可。2. 冰上融化并且充分混匀 HB-infusion TM Master mix ，配制反响体系2-3片段4-6

8、片段阳性对照PCR产物+X lX l10 l线性化载体质粒(0.02 0.5 pmols)(0.2 1 pmols)HB-infusion MasterMix (2)10 l10 l10 l超纯H2OUp to 20lUp to 20l-3. 上述反响体系置于50 C孵育20 min 2-3个片段拼接/60 min 4-6个片段拼接。反响完成之后如不能马上 进行后续操作可将反响样品暂储存于-20 C。4. 转化感受态菌4.1. 在冰上融化一支50 l的DH5a感受态菌配合汉恒生物专门为该试剂盒研制的感受态细胞，效果更佳。4.2. 取2 l第3步中的反响样品参加融化好的感受态菌中，轻轻混匀，不能

9、震荡混匀。将该混合物置于冰上30min。4.3. 轻轻摇匀后放入42 C水浴中12 min进行热激，然后迅速放回冰中，静置 35min。4.4. 在超净工作台中向上述各管中分别参加 500 n l L培养基不含抗菌素轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37 C震荡1h，摇床转速250 rpm。4.5. 在超净工作台中取上述转化混合液 100300 n l，分别滴到含适宜抗菌素的固体LB平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀注意：玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂。37 C培养箱中培养过夜。4.6. 挑取平板上的克隆进行PCR或者酶切鉴定。Gibson Assembly 拼接DNA的原理说明dDNA fragnrienEs with oyerlappimg endg.AA+ IBFully Assembled DNADAdd fragments to Gibson Assembly Maslef Ma.ABDIncubaCe at 50 C tor 1&-60 fniniit&sGibson Assembly1. 包含重叠区域的 DNA片段均匀混在一起， Mix内的5 '外切酶 可以从5 '端消化DNA双链中一条 链A丨；2. 重叠区域的DNA形成单