采用农杆菌介导转化法的泡盛曲霉表达载体的构建

1、生物匚程2009. Vol. 30. No. 01181陈波丄王熙r贺新生r张义正(1四川人学生命科学学院，四川成都 610064： 2-西南科技大学生命科学与工程学院，四川绵阳 621010)为在泡盛曲霉中农达外源基因、克服泡盛曲霉常规转化法效率低卜的瓶颈，本研究拟构建采用农杆菌介 &转化法的泡盛曲瑋农达取体。通过PCR,从椭化两基肉必)高效农达的泡盛曲祿茵株SG1基因组DNA扩增获 得glaA2.1 kb启动子片段(包含信号肽编码序列)及l.lkb终|上子片段，构建了外源基因表达盒。以根瘤农杆菌双元 较体PCAA1B1A13O2为基础，删除作必帝区段及多余限制酶位点.插入上述外源基因衣达盒

2、及來门丝状真的标记 载体PAN7-1的潮孫素抗性标记，构建采用农杆菌介导转化法的泡盛曲帝分泌幣介型农达我体pSUAA52am.转化 结果表明：采HjlJkl-：质体法的转化效率为21个转化子/10。分生抱子，而农杆菌介导法町达1106个转化子/10。分工 他了，足I生质体法的53倍。构建载体成功利用g/“A表达盒与农杆菌介导转化法的奇效特性,可为利用泡盛曲 彩高效表达外源基因奠定基础.泡盛曲霉:ghA表达盒：农杆菌介导转化法:表达载体Constniction of Arobactenum-medicd Aspergillus awamori Expression VectorCHEN Bo1

3、- WANG XP. HE Xin-sheng-. ZHANG Yizheng，(1.College of Life Science, Sichuan University、Chengdu 610064. China：2 .College of Life Science and Engineering. Southwest University of Science and Technology Mianyang 621010. China)Abstract: To uulize the high efficiency of gluA expression cassette of Asperg

4、illus awamori and Agrobuctenum-niedtcd transformation in the construction of A.awamori expression vector, a 2.1-kb gl(iA promoter fragment including signal peptide- codrng sequence and a 1 1-kb r/“A terminator fragment were amplified from the genoxmc DNA of A.awaniori strain SGI by PCR and then fuse

5、d to form a foreign gene expression cassette. The Agrobactenum tumefacieiis binary vecioi pCAMBLA1302 was used as backbone and its T-borders and necessary elements for E.coli and Agrobacteriimbmediatcd transformation were retamed whereas other regions m the vector were deleted The foreign gene expre

6、ssion cassette described above and the filamentous fungal functional hygiomycin B resistance maiker from pAN7-l were inserted mto the legion between T-borders. Finally a secretory integiatioQ Agrobacterium-mcdiatcd A.awamori expression vector pSUAA52am was constructed Transformation experiment showe

7、d that transformation efficiency of pSUAA52ani mto A. awamori with protoplast method was 21 transfbrmants/100 spores, while that with Agrobactenunt-niedLMed method reached 1106 tiansfoimants. 10 spores, 53 folds of the foimei. This indicated that the construction of this expression vector is success

8、ful.Key words： Aspergillus awamori； g/A expression cassette； Agrohdctenum-mediated transformation： expression vector 中图分类号：Q782文献标识码：A文章编号：1002-6630(2009)01-0181-05生物匚程2009. Vol. 30. No. 01#生物匚程2009. Vol. 30. No. 01183泡盛 iu(As/)eillus a anion) 曲 畑Aspegilhts niger) 变种，是微生物工业瑕币浚的椭化(glucoamvlase)生产 菌，冇

9、看强人的分泌胞外糖化酶的能力，据报道黑曲 毎址岛“J达30g/L的发酵水卩【几 木实捡空经过多次诱变收稿 H 期：2007-12-12基金项I：西南科技人学巫人科学研究项11(023113) 作者简介：陈波(1965)，男，讲师， 通讯作者：张义止(1947)男.士研究生.研究方向为微牛物分子牛物学 E-mail： chengang 1216 cn 教授，研究方向为分子生物学。E-mail： yizzhang筛选获得株泡盛曲霉罄化酶高产突变株SG1.该菌株 貝备如下特点：(1)糖化酶咸因高效表达，且分泌能力 强，在优化条件下,表达量可达5.3g/L水平，说明H糖 化9*基因glaA具有强启动产

10、及终iL /等岛效反达元件$ (2)该菌株不产胞外水解蛋白酚，便蛋白质分泌到胞外时 不被降解，适介用作宿主菌株：(3)该菌株可利用廉价的 淀粉物质，生产咸因程产物时原料成本低廉：(4)产他 能力强，生氏迅速，仃利丁菌种保藏及工业规模生产： (5)该菌株具冇仪用级安全杵，卄:常适介表达药用及伐 用蛋白；(6)与黑曲霉相比,具有不产色素、有利于产 物纯化的优点.因此,该菌株适合用于构建泡盛曲霉 高效分泌表达系统.考虑到泡盛曲寄髙效表达与分泌机 制的复杂性,本研究直接利用该菌株的糖化酶基因 g/aA的强胖动子(包括信号肽序列)及终止了元件來构建 外源基因衣达盒，在设计多克降位点MCS时考股位点 的翻

11、译及连接序列等因索，使外源基因插入时尽町能接 近天然的g/A展因的表达元件，以减少影响外源星因 高效农达的不确泄因索，便外源垄因获得比较高效的异 源表达.原生质体转化法是泡盛曲霉表达戦体的常规转化 法，但操作繁琐、效率低卜，影响了泡盛曲粵农达系 统的实际应用.Groo旧等于1998年TT先报道了根瘤农杆 (Agrobacterium luniefaciens) J 以将 Ti 质粒的 T-DNA 高 效转入丝状真ir,蘆后用农杆菌介导法转化黑曲霉零多 种丝状貞菌获得成功H讥Li等问于2005年报道利用农杆 菌介导法成功地対黄他原毛平革(Phanerochaete chrysosporium)进

12、行了遗传转化，为丝状真菌的转化方 法开辟新途径.本研究以根瘤农杆菌双元载体 PCAXIBIA13O2为骨架，采用泡盛III惓SG1岛效的g/AL盒和來n纥状真菌标记载体的PAN7-1潮需素抗牲星 因作为选择标记，构建采用农杆菌介导转化法的泡盛曲 孫分泌整介型衷达载体，以期打破泡盛曲那转化效率低 卜这一瓶颈，为外源威因在泡盛曲霜中的盛效表达奠启 基础.1材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株与质粒人肠杆菌JM109用丁常规人肠杆菌质粒扩增：根瘤 农杆菌EHA105用干根痫农杆菌质粒转化：泡盛曲得SG1 为本实验室经女次诱变筛选获得的糖化酶高产菌株， 用F提取基因俎DNA,并用作泡盛曲霉表达宿主:

13、质 粒pUC19用于PCR产物亚克隆及测序分析：根斓农杆菌 女元袋体pCAMBIA 1302用作农杆菌介导的泡盛曲程衣 达载体的构建骨架:丝状真菌标记栽体PAN7-1用于提 供潮霉素(hygromycin B)抗性标记。以上菌株及质粒均 为本实验室保存。1.1.2 培养M大肠杆菌转化采用LB、SOB及SOC培养基叫 根 瘤农杆菌转化采用YEP培养基【q泡盛曲霉培养采用Aa 培斥矗(gU (NHjSCh 6.5、柠檬酸 2.0、(NHHPO, 3.5、 MgSOu 0.2、K：HPOu 10、酵母粉 10、淀粉 50,加水 至 1000ml,自然 pHo1.13 试刑限制性内切師、T4 DNA聚

14、介酗、S1核酸爾及T4 DNA连接酶 宝生物I程(人连)仃限公诃：,DNA聚合 幽 北京赛白盛公司：卡那孫索、利福平、竣X：青霉 素、潮得素及乙酰丁香鬧(AS)匕海生I：牛物T程公司。1.2 方法1.2.1 泡盛曲霉SG1基因纽DNA捉取接种SG1斜而他子于100ml Aa培养耳中，28C振 荡培(180rmin)36h.收集葡绞体，然后参照文献刃的 方法提取。1.2.2 限制酶位点消除我体I ：潘要消除的限制桶位点先用相应限制酶完全 酶切，线性化披体平端化后自连即消除该限制酚位点- 3次出末端采用T4 DNA聚介酚切平。5次出末端 采用Pfu DNA聚合IW廷伸法补平,20 Ml补平反应体系

15、 为：傳切产物适量(V lpg)或切胶回收液适量(通常取1 Ml), 10mmol/L dNTPs 0.5yL Pfu DNA 聚合酚 1.5 U. 补加 ddH：O 至 20m1, 72*C 保温延伸 lOmin. Sp刃和 的5突出末端采用SI核酸酶平端化，以免产生新的 B$sHII 位点.1.2.3 泡盛曲需g/“A基因启动子片段克隣根据报道的黑曲霉糖化酶基因glaA5V区段序列 (GenBank Accession No.X56442)设计正向引物【】，根据 泡盛曲彳存糖化酚垄!丈lg/aA丿f列(GenBank Accession No. K02465)设计反向引物【叫正向引物：5,

16、-CGGAAGCTTCTCGAGGATTGTCTGAACATTGC-3, 反向引物：5CGGGGTACCCCGCTCTAGACCGCCGC CACCCGCGCGCTTGGAAATCACATTTGC-3,下划线处为引入的限制丽位点.正向引物末端带 HindlH位点，反向引物带Kpnl. Xbal和位点。 设计扩增的心动了片段包會glaA信乃肚编码序列(以下 简称SS),以泡盛曲寄SG1圧因组DNA为模板，采用 高保真肌 DNA聚合酶进行扩增。梯度PCR扩增条件 为：94C(lmin), 40-60rC(limn), 72*C(5min), 35 个 循环。启动子片段PgbA经7/加dlll+pn

17、l双酶切后亚克 隆至pUC 19,得到的巫组质粒pUC19-PglaA经测序确认 (由上海生工生物工程公司完成).1.2.4 泡盛曲glaA咸因终止了片段克隆根据报道的泡盛l!l霉glaA基因序列(GenBank Accession No.K02465）设计引物叫正向引物：STGGTACCrAGACAATQVkTCCATITCGCTA-y 反向引物：5-CTGAATTCATCCGGAGATCCTGATCATC-3, 正向引物帯Kpnl位点及终止密码TTAG末瑞，反 向引物带EcoRI末瑞.以泡盛曲SG1基因組DNA为 模板，采用為保1*1- Pfu DNA聚合幽扩增泡盛曲glaA 终止子.梯度

18、PCR扩增条件:94X?（lmin）, 4050*C （lmin）. 72C（3min）, 35 个循环.终止子片段 TglaA 经Kpnl+EcoRI双酗切后亚克隆至pUC19,得到的巫组 质粒pUC 19-TglaA经测序确认（rll上海生工生物丁程公 司完成）.1.2.5 外源基因表达盒的构建pUC19-PglaA用HindHI + Kpnl双酵切后,电泳切 胶分离glaA启动子片段,插入pUC 19-TglaA MCS相应 位点，获得带外源卑因衣达盒的重组质粒pUC19- PTglaAo1.2.6 pAN7-l潮孫索抗性标记的获得为能在构建的表达戟体MCS中使用常见限制M位点 Xbal

19、，首先消除pAN7-l 位于潮霉索抗性墓因衣达盒 终止f TtrpC 3 末端的Xbal位点.消除f Xhal位点 的pAN7-l用Hindlll + 8g/U完全奴酶切、电泳分离后， 切胶冋收蒂潮寄索抗性基因农达盒的4.0 kb H/jdIII-ni 大片段.1.2.7 用于农杆菌介导转化法的泡盛曲需表达载体的构建 先将pCAMBIA1302用Spel + BssHll双幽切除公mGFP5基因（SpeldssHII区段）,用S1核酸酹除去5 端突起序列后自连，获得車组质RpCAMIo该质粒用 Kpnl + P5/I双酶切，回收人片段，其3突出末端用 T4 DNA聚介酗切平后自连，以删除Kpn

20、l-Pstl MCS.获 得重组质RpCAMII- pUC19-PTglaA用Xhol完全酗切 后，再用HoRI部分闸切，分离3.2 kb外源圧因衷达盒 片段（X/sI位点位于glaA心动/ 5 末端H加dill位点Z 后），然后将该片段用换pCANIII屮的植物转化标记基肉 潮霉素抗性基因（Xhol-EcoKl区段）,得到含有外源 垒因衣达盒的重组质粒pCAMIIE址后将来自丝状真菌 标记越体pAN7-l的4.0kb HindHI-Bg/II潮彖索抗性标记片 段替换pCAMIII的H加dill-创/II区段，得到用于农杆繭 介导转化法的泡盛曲霉衣达载体pSUAA52am（图3）。1.2.8

21、泡盛曲霉农杆菌介导转化法“】pSUAA52am采用冻融法转化到根瘤农杆菌EHA 105 中。从YEP平板（含卡那得素50pg,ml、利福平50 m g.ml） 上挑取携帯衣达载体的农杆菌单菌落接种J-3inl YEP培养 液（侖卡那毎素50pg/mk利福平50pg/ml、乙酰香 酮 AS 200pmol/L）+，28C、250r/min 卜培养 Id 取 1.5ml J,液提取质粒确认农达我体已转入农杆菌用金 氏液体培养压将泡盛曲硏斜血抱洗卜并调整他J浓度 至0个/ml.取100M1已活化的农杆菌（携带表达载体） 菌液和100M泡盛曲霉分生抱产悬浮液混匀，涂布在诱 导培并丛（含200pmoLL

22、 AS的査氏培斥丿出平板上，22*C 共培斥2d,在平板上倒入10-20nil半固体选择培斥咸（含 200 pg ml潮霉索及200 pg. ml按卡百霉素的何氏培并卑）, 2 8工继续培养至潮筍素抗性菌落111现1.2.9 泡盛曲那转化方法比较pSUAA52am采用原生质体法及农杆菌介导法转化 泡盛曲霉SG1菌株,通过讨数选择培养基平板上潮霉素 抗性转化了，比较不同方法的转化效率（每106个分生他 子得到的泡盛曲霉潮霉素抗性转化f数）。2 结果与分析2.1 泡盛曲霍糖化舸星因glaA启动子片段的克降用DNA分析软件DNAman 3.0对设计引物进行分 析，选择4060t的退火温度做梯度PCR

23、.反应产物 用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果见图1。可知， 37道（退火温度为43.153SC）及10道（59.8C）均仃人 小约2.1kb的特异带产生，与预期相符。10道（59.8C） 只有一条特异带,取其PCR产物用Hindin + Kpnl双醯 切云插入pUCl 9 ,紂到的匝组质粒命名为pUC19- PglaAo3530bp一 2027bp1 1C PCR 产物.退火温度为 40 0、41.3、43.K 45.4 48.0. 50 7.53.5. 50 0. 58 1 . 59 8V： M X /EroRIHmdUI DNA Marker图1泡盛曲毎g/aA启动子梯度PCRFig.1

24、 Gradient PCR of A.awamori glaA promoter测序结果表明，克降到的glaA VI动了片段人小为 206lbp,包括編码24个氨卑艘残基的glaA信号肽序列, 序列已提交GenBank （登记号:EF428455）。该片段与 Fowler报道的黑曲窃ATCC10864菌株的glaA阜因的相 同位置片段有64%的同源性何,且该片段具有高尊真核 生物基因启动子共有序列CAAT框及TATA框,衣明 该启动具有貞孩生物启动（的典型特征。2.2 泡盛曲孫糖化酚基因g A终止了片段的克隆根据引物设计，选择4050匸退火温度做梯度生物匚程2009. Vol. 30. No.

25、 01185PCR.结果见图2。可知 19道（退火温度40.l-49.5r） 都得到了大小约l.lkb的特异带，与预期相符。氏中， 89道（48.549.5C）无非特界性带，其PCR产物用Kpnl + EcoRI双酚切后插入pUC19,筛选重组C 重组质 粒命名为pUC!9-TglaA测序结果农明，泡盛曲霉giaA终止/片段长1034Ml 2 3 456 7 S 91 9 PCR 产物.鬼火温度为 40 1. 41 9. 43.4. 44 6. 45.0、46.5、 47.4、48.5. 49.5： M X /EcoRI*/indIII DNA Marker.图2泡盛曲Sg/aA终止子梯度PC

26、RFig.2 Gradient PCR of A.awamori g/aA terminatorbp,序列已提交GenBank （登记号:EF428456）.该序 列与GenBank上报道的泡盛曲霉如基因的终止了序 列冇98%的同源性【小.2.3 外源基因表达盒的构建从 pUC 19-PglaA 切 E g/“A AJ 动 f 丿 V 段 PglaA（/7idin + Kpnl）,插入pUC19-TglaA MCS相应位点,得到含 仃外源垒因表达兪的重纽质粒pUCl 9-PTglaA。重组质 粒用/7/ndIII+ Kpnl双朋切鉴定，电泳结果与预期相符 （图略），表明Pg/A片段已经插入pU

27、C19-TglaA,外源 丛因衣达盒为 Pg/A （包括 ATG-SS）-B$sHII-XbaI-K/iI- TAG-TglaAc2.4 用于农杆菌介导转化法的泡盛曲霉表达载体 pSUAA52ain 的构理构建农杆菌介导的泡盛曲需衣达载体采用了图3所 示策略：以根卿农杆甫双兀载;体pCAMBIA1302为畔 架,保留大肠杆菌和农杆菌介导转化必潘区段:删除非 必需区段以减小构建裁体的人小：消除部分限制幽位点 以方便外源基因的克隆操作:插入外源基因表达盒：M 厉插入线状真菌潮虑素抗性标记.具体操作见“材料 与方法”。经过滋选，随机挑取f 2个巫组f经Hindm + BgM 双酶切验证，电泳结果显示

28、（图4）, 2个旅组质粒均切 F / 一条约4.0kb的特异带,表明潮霉素抗性标记已插 入pCAMIII的H加dill-创/IIZ间。该巫组质粒帯仃外源 基因表达盒（由glaA启动子、信号狀序列SS及终止于 构成,SS后带有多克隆位点）、适合丝状真菌转化的潮 霉素抗性标记、以及大肠杆菌与根瘤农杆菌转化的必需 元件，命名为pSUAA52am（图3）。2.5 表达载体的转化pCAMBlAlXC (10S49bp):夕pVSl stoCaMV35S 心功 fmGFP5H md 111P:tlU那寡索叶尸 BR322 on八pBR322 bomCaM35s VJ/A fXltol激祿索(R)_Xhol

29、 tCMV35基臨离更,No: poly-A 悠開 T-Border( 6) pVSl repKpnl Xbal K oHll 卜Hmdlll TtrPC-.ae( oR1 v 潮梅索(R)Tg、. FgpdAPghA_ JrT-Border( 6)gpSUAA52amXho f-L .1T-BorderEp(13783bp)； - .pVSl cu卡儡pBR322 bom(Ti vttGla A. KexB和NXfCS的核什酸和氮从酸序列：1 ATG TCG TTC CGA TCT CTA CTC GCC CTG AGCI Met Ser Phe Arg Ser Leu Leu Ala Le

30、u Ser31 GGC CTC GTC TGC ACA GGG TTG GCA AAT GTGII Gly Leu Vai Cys Thr Gly Leu Ala Acn VaiRyjHLLXbalKpnl61 ATTTCC AAG CGC pCGGGTGGCGGCGGTCTAGAGCGGGGTACC 21 Lie Ser Lys Ar Ala Gly Gly Gly Gly Leu Glu Arg Gly Thr图3用于农杆菌介导转化法的泡盛曲酉袈达载体pSUAA52am的构建Fig.3 Construction of Agrobacterium-mediated A. awamorlexp

31、ression vector pSUAA52am21220bpf514Sbp-426Sbp -3530bp f831bp_564bp_M. X /coRI*/iidin DNA Marker： 1*2. pCAXIIII f3. pCARini(对照图4 pCAMi II重组质粒H/ndlll 4 BgM双的切鉴定Fig.4 Identification of pCAMIII recombinants with HlndWlBg川digestion农达仮体pSUAA52am分别用原生质体法和农*|谕介 导法转化泡盛曲硏分生抱了，在儈潮硏索（终浓度200Mg/ml） 选择平板上筛选潮寄素抗性转化

32、了，结果见表1表1表明,传统的原生质体转化法转化效率仅为21表1不同转化方法的转化效军Table 1 Transformation efficiencies with different transformationmethods转化方法转化效率（转化子0袍子）倍数脈生质体转化法211农杆曲介导转化法110653个转化F/io*分生他子,转化效率低下.农杆菌介导法 直接转化分生他了达nod个转化r /io分生他c转化 效率是原生质体法的53倍，衣明高效表达截体 pSUAA52am构建成功.3 讨论本实验克降到的泡盛曲寄旃化酶髙效表达菌株SG1 的糖化酶gl（4丛因丿;动f序列* j Fowle

33、r报道的黑曲虑 ATCC10864菌株的g/“A星因5区段序列（卅动犷部 分）只有64%同源性【叫而终止子序列与GenBank上报 道的泡盛曲硏菌株glaA尿因的终止了序列冇98%的同 源性】,信号肽序列则与上述黑曲霉及泡盛曲霉菌株都 冇100%的同源性，提示不同菌株同源肚因表达水平的 高低主雯取决于基因启动了功能的强弱。泡盛曲需中内 源丛因分泌表达的高水平与外源慕因分泌衷达的低水平 形成强烈反差皿由于形响因素众多,本研究在构建表 达载体时,直接采用了泡盛曲霉高效衷达歯株SG1糖化 M甚内的强川动于、信号肽及终止子序列构建外源朕W 农达兪.便外源基冈的农达尤件尽町能与糖化幽基因天 然的高效表达

34、元件保持-致，为外源展因的高效农达创 造条件。设计MCS时考虑了 MCS核什酸序列翻译后的氮耳 酸组成和密码犷偏爱性，表达载体上的glaA信号肽、 KexB切点及MCS核什酸序列与猱H酸纽成见图3。MCS 设计T 3个限制酢位点，其中BssHU是glaA信号肚序 列自带位点,Xbal与Kp/iI之间为以后根据需熨加入新 限制酶位点预用空间（引入额外碱人EGCGG是为J捉高 Xbal. Kp“I酶切效率）,Lys和Arg为g/aA信号肽末 尾两个氨星酸，是KexB识别序列，Lys、Arg与AW Z间为KexB切割位点（图3中箭头所示）.研究表明, KexB旁侧氮堆酸种类対切割效率冇显著影响，H中

35、为 侧氨里酸为非极性小分f保氨卑酸时对KexB切割彫响较 小，尤其是旁侧氮基酸是甘氮酸（Gly）时影响最小，儿 乎町以保留90%以I.的切割效率小5。|人1此，为了尽 可能不影响KexB的切刘，设计时保田了信U肽KexB切 点后紧邻倍号肽的糖化酗女肽A的第-个氨垒酸一 丙氨酸(Ala),并在其后设计了连续4个甘氨酸甘氮 酸侧链R基为H,是最小氨基战，非极性，冇“柔 性氨垄酸” Z称，1个Ala和4个Gly形成条柔性短 肽链，连接信号肽和融介蛋门，以减少对KexB切割活 件的彩响，并使信号肽和融介蛋门两个空间结构相对独 立，以保持融介蛋I的天然活性.参考文献：1 ROBERT P. RUDOLF

36、 M. GERHARD A. et al Metabolically mdepen- dent and accurately adjustable Aspergillus zp expression systemJ). Applied and Environmental Xficrobiology 2005. 71(2)： 6*2-578.2 GOU X H. ZHANG Y Z. Characterization and traxicformation of anti- FOA ctrain of Aspergillus aw(inioriJ. Acta Microbiologies Sin

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