自体骨髓间质干细胞移植治疗急性心肌梗塞的实验研究

1、自体骨髓间质干细胞移植治疗急性心肌梗塞的实验研究    摘要 目的 将大体动物自体骨髓间质干细胞（MSCs）移植至心肌梗塞后的心肌疤痕组织中观察细胞在梗塞区的存活以及对心功能的改善情况。方法 选择21只中国小型家猪，应用闭胸经股动脉介入的方法制作动物心肌梗塞模型。10余天后实验组将培养的自体骨髓干细胞移植于梗死区，对照组在梗死区植入营养液。8周后，以心脏彩超及ECT观察梗死心肌的恢复及心功能的变化。最后行组织学分析. 结果 心脏彩超示实验组移植后左室射血分数（ LVEF）增加(42.07±2.06 vs 47±2.36)； 99mTc

2、-MIBI 显示实验组梗塞面积缩小(34±12 vs 21±10)；实验组微血管密度增加（8.32±1.26）0.2mm2 vs （4.61±1.32）0.2mm2（p    心肌梗塞及其他原因所致的细胞丢失和瘢痕形成，是心肌的一种不可逆性损害。药物疗法和外科手术均不能替代坏死心肌，彻底改善心肌功能，因此寻求一种替代坏死心肌，改善心功能的方法，成为心血管领域的巨大挑战之一。本研究应用大型动物制备心肌梗塞模型，将自体骨髓干细胞移植至心肌梗塞后的心肌疤痕组织中观察骨髓干细胞能否在梗塞区心肌存活并保持收缩功能以及移植细胞

3、对心功能的改善程度，为临床应用骨髓干细胞移植治疗心肌梗塞及各种原因导致的心力衰竭提供相关依据。 材料和方法 1.1研究对象：选择中国小型雄性家猪21只，3-4月龄，体重30-40Kg，随机分为实验组（n=11只）及对照组（n=10只）。 1.2心肌梗塞模型的制备：经股动脉穿刺行选择性左冠状动脉造影，经6F导管送入0.014inch导丝，导丝先端达LCX或LAD远端后，固定导丝。在连续X线透视下缓慢退出右冠导管，再沿导丝导入球囊（2.0-2.5×7-10mm）至LCX或LAD远端。以4atm扩张5分钟作缺血预适应，然后以4atm扩张5075分钟作梗塞模型，术中注意心电图改变，然后撤出球

4、囊及导丝。再行左冠状动脉造影，结扎股动脉。 1.3骨髓干细胞的分离、培养和标记：所有入选动物均行骨髓穿刺， 抽取骨髓40ml，以40 ml DMEM培养基稀释，与等量percoll液（相对密度1.077）水平离心，2200r/min 20分钟，缓慢吸取中间交界面乳白色云雾状悬浮细胞至另一试管，以DMEM充分洗涤3次；将上述所得骨髓单个核细胞按2×106cm2接种于DMEM培养液中（10胎牛血清，青霉素100mgL-1链霉素100mgL-1），在37°5co2的孵育箱中培养。3天后去除非贴壁细胞，以后每隔两三天换液一次。用倒置式相差显微镜逐日观察MSC细胞的形态学特征和生长情

5、况。至细胞生长铺满至瓶底90以上融合时，用0.25胰蛋白酶和.01依地酸消化贴壁细胞，并以5-溴脱氧尿核苷标记骨髓干细胞，悬浮备用。 1.4梗塞部位定位及骨髓干细胞移植：以心脏彩色多普勒超声心动图检测梗死心肌，并以美国超声心动学会的左室十六节段分法结合ECT作为梗死心肌定位标准。心肌梗死后10余天实验组在梗死区中心经微导管注入2ml骨髓干细胞悬液（1×107个细胞）对照组同法注入培养液。 1.5结果判定骨髓干细胞移植术前及术后8周，行UCG及ECT检查观察心肌收缩力，心功能等指标。动物据以上定位获取移植部位心肌标本，进行光镜检查以观察心肌细胞形态及微血管密度计数微血管密度计数采用We

6、inder1推荐的方法，即随机取5个视野，计数梗死区微血管密度，血管密度用“个0.2mm2”表示。    2 结果 2.1一般情况：试验动物21只，2只行心肌梗塞模型制备时分别死于室颤和急性心包填塞，1只行干细胞移植麻醉时死于心力衰竭，1只经心脏彩超和ECT证实未形成心肌梗塞模型，故最终获得有效数据17例（实验组9例，对照组8例）。 2.2MSCs的分离培养 40ml骨髓经percoll液梯度离心及培养后，约10天MSC扩增至107数量级（表1，图1） 表1一般资料和移植MSCs数量 项 目     试验组

7、0;   对照组 体重（kg）    37.02±4.32    39.01±2.46 梗塞相关血管（支） LAD     4     5 LCX     5     3 MSCs(107)    2.89±1.12   

8、0; 0     骨髓液微生物学检查         移植时心梗发病时间（w） 2.03±0.26    2.16±0.48 2.3图像分析 两组动物细胞移植前后心脏彩超各项测值见表2。与对照组相比，实验组左室收缩末期直径，左室收缩末期容积缩小，左室射血分数增加；99mTc-MIBI 显示实验组梗塞面积缩小34±12 vs 21±10（图2）。 表2两组动物细胞移植前后心功能的比较 &#

9、160;  实验组（n=9）    对照组（n=8）     移植前    移植后    移植前    移植后 LVSd（mm） 11.06±1.49    9.53±1.46*# 11.28±1.42 12.08±2.35 SYSvol（ml） 39.08±11.05 36.20

10、7;10.60*# 39.06±10.25 40.10±11.20 IWT（mm） 4.89±3.58    5.96±0.32*#    4.92±2.31 4.84±3.25 LVEF（） 42.07±2.06    47.00±2.36*# 42.86±3.56 43.00±2.50 注：*与对照组相比，P    目前冠心病心肌梗塞

11、已成为危害人们健康的主要疾病之一药物、手术治疗虽可挽救濒死的心肌但不能解决有效细胞数目减少这一根本问题。近年来，自体干细胞移植使心肌再生的可行性和有效性已引起了人们的广泛专注。    本研究中我们探讨了自体MSCs移植治疗心肌梗塞的安全性，有效性和可行性。更重要的是，我们观察了急性心肌梗塞后，进行自体MSCs移植对心肌的血管新生作用。    本研究发现，MSCs植入心梗区后，可明显改变心梗后梗死心肌局部和整体心脏功能：与对照组相比，心梗局部室壁厚度增加，梗死区室壁运动速度增加，左室收缩末期直径缩小，左室射血分数提高

12、。ECT示梗塞面积较前缩小，与Orlic等结果一致2。可能的机制为移植的骨髓细胞在移植局部得以存活，且可能在心肌局部微环境的诱导下分化为具有心肌特性的细胞，替代了部分疤痕组织，减少了梗塞区面积，降低了纤维组织和膠原纤维的增生，进而减少了心肌重构并与宿主细胞同步收缩从而改善心功能3。    再生的心肌细胞同样需要营养才能存活，因此维持大血管和微血管的血液供应是心肌再生的一个关键。本研究显示实验组梗塞区血管密度较对照组增加，证实移植细胞有促进微血管再生的作用。可能移植细胞分泌细胞因子，促进血管再生，即内源性血管新生4。但有些研究并未发现新生血管，可能与细胞移

13、植时间有关。本研究是于心肌梗塞后2周左右进行干细胞的移植，在急性心梗早期由于炎性浸润和大量炎性介质包括趋化因子的释放梗死区及其周边毛细血管通透性明显增加有利于干细胞在损伤区的归巢并帮助受损组织的重建。自体MSCs植入后，心肌这些局部微环境上调许多种血管生成相关基因，有利于血管新生5。    本研究结果显示，在急性心肌梗塞早期植入自体骨髓间质干细胞，可在心肌梗塞区增殖分化为心肌样细胞，增加有功能的心肌细胞数量，减轻心肌重塑，改善心肌收缩功能。自体MSCs取自自身，不存在伦理道德上的争议，且取材方便，移植后亦不存在排斥性反应，自体骨髓间质干细胞作为治疗心肌梗塞的替代细胞具有广泛的应用前景。    参考文献 1.Weider N.Current pathologic methods for measuring intratumoral microvessel density with breast carcinoma and other solid tumorsJ.Breast Cancer Res Treat.1