肺炎链球菌表面蛋白在细菌体外粘附中的介导作用

1、    肺炎链球菌表面蛋白在细菌 体外粘附中的介导作用        【 摘要 】目的在体外研究肺炎链球菌表面蛋白对细菌粘附于宿主细胞的介导作用。 方法用FITC荧光标记肺炎链球菌(S、S)，用蛋白质合成抑制剂，RNA合成抑制剂和神经氨酸酶分别处理肺炎链球菌和小鼠腹腔巨噬细胞后，在体外观察这些因素对细菌与巨噬细胞粘附率的影响；另外观察细菌细胞壁提取物对上述粘附率的影响。 结果证实了粘附过程存在剂量依赖和时间依赖的关系，是特异的粘附过程。用多因素分别处理肺炎链球菌和巨

2、噬细胞后，其粘附率的改变与肺炎链球菌合成RNA和蛋白质有关，需要肺炎链球菌识别巨噬细胞表面糖蛋白结构的受体。肺炎链球菌可溶性细胞壁成分能与完整肺炎链球菌同样有对巨噬细胞的粘附，去蛋白细胞壁成分则无此作用。 结论提示细菌表面蛋白介导了这一粘附过程。【 主题词 】链球菌，肺炎巨噬细胞细菌粘附细胞壁膜糖蛋白类 The mediatory effects of pneumococcal surface proteins on the adherence of bacteria to host cell in vitroHuang Bin, Yin Yibing, Kang Gefei.Departme

3、nt of Clinical Biochemistry,Faculty of Laboratory Medicine,Chongqing University of Medical Sciences, Chongqing 400046【 Abstract 】ObjectiveThe Gram-positive bacterium Streptococcus pneumoniae is a major pathogen of pneumonia,sepsis and meningitis. To gain access to tissue within the human host, Strep

4、tococcus pnumoniae must initially attach to the surface of host cell. The recent research reported that the cell wall could mediate Streptococcus pneumoniae attachment to human endothelial cells. Although the factors of pneumococcal adhesions are still currently unknown,the surface proteins of S. pn

5、eumoniae are thought to be the potential candidates. MethodsIn this study,S. pneumoniae(S,S) were labelled by FITC, then the bacteria and mice macrophages were pretreated with the RNA,protein synthetic inhibitors and purified pneumococcal cell wall components,respectively. The effects on the adheren

6、ce between the bacteria and macrophages were studied. ResultsConclusionsThese results suggest that pneumococcal cell wall proteins mediate the interaction. 【 Subject words 】Streptococcus pneumoniaeMacrophagesBacterial adhersionCell wall protein肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)是一种能引起肺炎、脑膜炎和菌血症等疾病的重要的病原

7、菌1。目前，对S.pn粘附和致病的机理还不十分清楚。传统认为S.pn的毒力因子主要是抗吞噬作用的荚膜，最近的研究表明荚膜对于S.pn早期粘附到宿主细胞并无影响，细胞壁(cellwall,CW)介导S.pn对血管内皮细胞的粘附，但不清楚是CW中何种成分发挥作用2。某些细菌细胞表面的蛋白质能介导细菌粘附3，但S.pn表面蛋白质是否作为毒力因子介导了粘附过程尚未见报道。并且，目前S.pn的荚膜多糖疫苗的免疫保护作用有局限性，特别是对两岁以内的幼儿保护作用较差4。因此，研究S.pn与宿主细胞的粘附机制有重要意义。巨噬细胞是S.pn感染后宿主防御系统的第一道防线，我们通过在体外研究S.pn与小鼠巨噬细胞

8、(macrophages)粘附的机理，探讨了参与粘附的病原菌和宿主方面的因素，为进一步研究S.pn的致病机理和抗菌药物提供参考。材料与方法1. 实验菌株及荧光标记：肺炎链球菌S、S标准菌株由中国医科院提供，主要遗传特性经鉴定合格。将S.pn在C+Y半合成培养基中37恒温水浴静止培养5，在对数生长中、后期取菌液约3ml (A 620= 0.5)离心，PBS洗涤细菌3次后重新悬浮使浓度达到108 CFU/ml，然后与溶解于0.05mol/L Na2 CO3 和 0.1mol/L NaCl缓冲液中的FITC(1mg/ml)混合，4标记1小时后用PBS洗涤细菌3次，重新用PBS悬浮使S.pn浓度达到1

9、08CFU/ml2。2. 小鼠腹腔巨噬细胞的分离培养:取雄性812周龄BALB/c小鼠，腹腔注射1甲基纤维素1ml，72小时后用RPMI 1640冲洗腹腔收获巨噬细胞。收获的细胞经PBS洗涤后，用含10FCS和青霉素、链霉素各100U/ml的RPMI 1640配成5×105/ml，接种于直径为4cm的小培养皿，37 5CO2条件下培养90分钟，去除未贴壁细胞6。3. 肺炎链球菌对巨噬细胞的粘附实验: 将贴壁生长的巨噬细胞(5×105/ml)用PBS洗涤后，加入有血清无抗生素的RPMI 1640培养基，再加入FITC标记的S.pn菌液(5×107CFU/ml)，加入

10、S.pn与巨噬细胞数之比为201。混合后培养皿放37 5CO2孵箱孵育6小时，取出后用PBS洗至少5次，去掉未粘附细菌。在荧光显微镜下观察粘附细菌，用IF DM-510激发滤光片，在明视场下计数巨噬细胞数，暗视场下计数巨噬细胞上粘附的S.pn数，粘附以100个巨噬细胞中粘附的S.pn数表示。每个实验做两次，每个标本平行3孔，最后结果以±s表示2。4. 肺炎链球菌细胞壁的提取:将在C+Y半合成培养基中生长到对数生长中、后期的S.pn(A620=0.5)约10ml离心，无菌PBS洗涤细菌3次后加入0.5ml含 25g/ml 变溶菌素的原生质缓冲液 (含20%蔗糖、 0.0025mol/L

11、 MgSO475. 各种处理因素对肺炎链球菌粘附巨噬细胞的影响:在进行粘附实验前分别用氯霉素(蛋白质合成抑制剂)、庆大霉素(蛋白质合成抑制剂)、利福平(RNA合成抑制剂)、萘定酮酸(DNA合成抑制剂)处理S.pn，37 15分钟，胰酶(蛋白水解酶)处理S.pn，37 10分钟，神经氨酸酶(水解糖蛋白、糖脂上的唾液酸)、CW提取物及去蛋白CW提取物处理巨噬细胞，37 30分钟，过碘酸(糖基氧化剂)、胰酶处理巨噬细胞，37 10分钟。再用同样的方法做粘附实验，观察这些因素对S.pn粘附巨噬细胞的影响。结果1. 肺炎链球菌对小鼠巨噬细胞的粘附动力学:结果表明(见1、2)，S.pn粘附小鼠巨噬细胞的过

12、程存在时间依赖和剂量依赖的关系，提示粘附作用的发生是特异的。通过双倒数作法我们求出S粘附巨噬细胞的H50(粘附为50%最大粘附时所需的时间)为1.9小时，最大粘附Amax为40个S.pn/100个巨噬细胞，S粘附巨噬细胞的H50为1.5小时，Amax为200个S.pn/100个巨噬细胞。S粘附巨噬细胞的A50(粘附为50%最大粘附时相应的S.pn浓度)为3.2×105CFU/ml，S的A50为5×105CFU/ml，结果表明S更易粘附于巨噬细胞。1肺炎链球菌粘附巨噬细胞的时间进程曲线Fig 1. Time course for adherence of S.pneumoni

13、ae to macrophages Macrophages were incubated with 5×107 CFU of S.pneumoniae per ml.Adherence is expressed as the number of attached bacteria per 100 macrophages.A:S,B:S2肺炎链球菌粘附巨噬细胞的剂量依赖曲线Fig 2. Dose-response curve for adherence of S.pneumoniae to macrophagesMacrophages were incubated with incre

14、asing concentrations of S.pneumoniae for 6h.Adherence is expressed as the number of attached pneumococci per 100 macrophages.A.S ,B: 2. 各种处理因素对肺炎链球菌粘附小鼠巨噬细胞的影响(见表1)：结果表明，用氯霉素、庆大霉素、利福平、胰酶分别处理S.pn后，S.pn对巨噬细胞的粘附都降低，提示粘附过程需要S.pn合成蛋白质和RNA，S.pn细胞表面蛋白质介导了粘附过程。用萘定酮酸处理S.pn后，并不降低粘附，表明粘附过程可能与DNA合成无关。表2结果表明，用神经

15、氨酸酶、过碘酸、胰酶分别处理巨噬细胞后粘附都大大降低，用神经氨酸酶和胰酶共同处理巨噬细胞后粘附降低尤为明显，提示S.pn粘附于巨噬细胞需要识别巨噬细胞表面糖蛋白性质的结构。表1各种因素分别处理S后对粘附的影响Table 1. Effect of different pretreatments of S on S adherence of macrophagesPretreatmentAdherence()P valueControl165.7±10.4Chloramphenicol(30.0g/ml)141.7± 8.7<0.05Gentamicin(40.0g/ml

16、) 133.5± 6.3<0.05Rifampin(32.0g/ml)138.3±10.8<0.05Nalidixic acid(20.0g/ml)161.3± 8.6>0.05Trypsin(0.025) 92.6± 6.5<0.01表2各种因素分别处理巨噬细胞后对粘附的影响Table 2. Effect of different pretreatments of macrophages on S adherence of macrophagesPretreatmentAdherence()P valueControl165.7

17、±10.4Neuraminidase(1U/ml)23.5±4.1<0.01Periodic acid(4.0mmol/L)47.8±3.6<0.01Trypsin(0.025)34.2±4.8<0.01Neuraminidase & trypsin10.4±2.5<0.013. 肺炎链球菌细胞壁提取物在粘附中的作用:从3中可以看出，S.pn CW提取物降低了完整S.pn对巨噬细胞的粘附，这种作用与CW提取物的量存在剂量依赖关系。通过双对数作法求出I50值(抑制率为50最大抑制率时相应的CW提取物浓度)为22.3

18、8g/ml。去蛋白质CW作用于巨噬细胞30分钟后，完整S.pn对巨噬细胞的粘附为160.5±8.3，与对照(未用CW处理巨噬细胞)的粘附结果165.7±10.4相比，P>0.05，无统计学意义，未提示去蛋白CW提取物对完整S.pn粘附巨噬细胞有影响(3)。 讨论我们通过一系列粘附实验发现，S.pn粘附于小鼠巨噬细胞这个过程存在剂量依赖和时间依赖的关系，且是特异的，是宿主细胞和S.pn共同参与的过程。这个过程与S.pn合成RNA和蛋白质有关，可能与合成DNA无关，并且需要巨噬细胞表面糖蛋白性质的结构参与。Geelen2曾报道，无荚膜的S.pn并不降低对宿主细胞的粘附，有

19、无荚膜对粘附并无影响。因此我们的这个结果对于揭示S.pn的早期粘附机制具有重要意义。已有资料表明，在炎症激活的宿主细胞表面，S.pn的受体为PAF受体，所含糖基结构为GlcNAc8，而在静息期宿主细胞表面受体为糖脂或糖蛋白，糖基结构为GalNAc1-3Gal、GalNAc 1-4Gal、GlcNAc 1-3Gal9。3肺炎链球菌细胞壁对完整细菌粘附巨噬细胞的影响曲线Fig 3. Inhibition of adherence of S.pneumoniae to macrophages by pneumococcal cell wall(CW)Macrophages were incubate

20、d with increasing concentrations of CW for 30 min prior to addition of intact pneummococci(5×107 CFU/ml).Results were normalized to adherence of S.pneumoniae to control macrophages unincubated with CW,which was set at 100% 我们用变溶菌素作用S.pn，37 1小时后，可得到CW提取物。在处理过程中，S.pn细胞表面自溶酶同时发挥作用，自溶酶识别S.pn细胞壁多糖磷酸

21、胆碱残基，通过水解丙氨酸和N-乙酰胞壁酸之间的共价连接将肽聚糖水解为肽链和聚糖骨架10，而变溶菌素破坏S.pn CW肽聚糖骨架上N-乙酰葡糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的-1,4糖苷键分子连接，因此使S.pn CW肽聚糖骨架水解而保留CW上的蛋白质。将用这种方法得到的S.pn CW提取物(含蛋白质、聚糖骨架片段、脂多糖等)先与巨噬细胞作用30分钟后，再加入完整S.pn观察其对巨噬细胞的粘附，发现S.pn CW提取物与完整S.pn对巨噬细胞具有同样的粘附作用，而去蛋白CW成分则无此作用，提示S.pn粘附于巨噬细胞需要S.pn CW表面蛋白质的介导，它通过识别小鼠巨噬细胞表面糖蛋白结构的受体，在S.pn

22、 CW和巨噬细胞之间形成架桥，从而通过直接或间接的作用(直接作为粘附素或调节粘附素的表达或介导LTA与宿主细胞受体连接)介导S.pn粘附于小鼠巨噬细胞。这为进一步研究S.pn的致病机理，鉴定S.pn CW表面参与粘附的特异蛋白质及其生物学性质、功能，以及发展新一代抗菌药物奠定了一定基础。作者单位：400046 重庆医科大学医学检验系参考文献1Burman LA,Norrby R,Trollfors. Invasive pneumococcal infections: incidence,prepdisposing factors, and prognosis. Rev Infect Dis,1

23、985,7133-142.2Geelen S,Bhallacharyya C,Tuomanen E, et al.The cell wall mediates pneumococcal attachment to and cytopathology in human endothelial cells. Infect Immun,1993,61(4)1538-1543.3Westerlund B, Korhonen TK. Bacterial protein binding to the mammalian extracellular matrix. Mol Microbiol,1993,9687-694.4Alonso De Velasco E,Verheul AFM,Verhoef J,et al. Streptococcus pneumoniae virulence factors, pathogenesis, and vaccines. Rev Microbiol, 1995,59(4)591-603.5Lacks S, Hotchkizz RD. A study