用流式细胞术检测小鼠骨髓型急性放射病早期网织红细胞

1、用流式细胞术检测小鼠骨髓型急性放射病早期网织红细胞    【摘要】目的探讨流式细胞术用于检测小鼠骨髓型急性放射病早期网织红细胞的可行性。方法用流式细胞技术观察了2、4、6、8、10、12Gy60Co射线照射后早期不同时间小鼠网织红细胞百分比和荧光强度的变化。结果（1）照后6h各组动物的网织红细胞百分     作者：董波 陈肖华 张军权 王治东 饶亚岚 张燕 高荣莲 毛秉智 【摘要】 目的 探讨流式细胞术用于检测小鼠骨髓型急性放射病早期网织红细胞的可行性。方法 用流式细胞技术观察了2、4、6、8、10、12Gy 60

2、 Co射线照射后早期不同时间小鼠网织红细胞百分比和荧光强度的变化。结果 （1）照后6h各组动物的网织红细胞百分比都比照前有升高的趋势，此后进行性下降，2Gy照射组在48、72h明显高于其他剂量照射组（P<0.05）。（2）各组动物网织红细胞的荧光强度（FL）从照后12h开始持续下降，2Gy照射组在48、72h明显高于其他剂量组（P<0.05或P<0.01），且在72h开始恢复。结论 流式细胞术检测骨髓型急性放射病早期网织红细胞，快速、客观、重复性好、误差小。荧光强度对判断骨髓的损伤程度和预后比网织红细胞百分比更有意义。 关键词 流式细胞术 急性放射病 网织红细胞 荧光强度 A

3、nalysis of mouse reticulocyte from early phase bone marrow  form of acute radiation sickness using flow cytometry  Dong Bo，Chen Xiaohua，Zhang Junquan，et al.  Institute of Radiation Medicine，Academy of Military Medical Sciences，Beijing100850.  【Abstract】 Objective To investigate t

4、he feasibility of flow cytometry in a nalyzing mouse reticulocyte from early phase bone marrow from of acute radiation sickness.Methods Percentage and fluorescence intensity of mouse peripheral blood reticulocyte were observed at different time points after2，4，6，8，10and12Gy 60 Coray total body irrad

5、iation.Results （1）Percentage of reticulocyte increased6h after irradiation and decreased gradually in all dose groups，and2Gy group is higher than other dose groups48h and72h post irradiation（P<0.05）.（2）Fluorescence intensity（FL）of reticulocyte decreased gradually from12h after irridiation in all

6、dose groups，and2Gy group is higher than other dose groups48h and72h post irradiation（P<0.05or P<0.01），then resumed gradually from72h post irradiation.Conclusion Flow cytometry is fast，practical，repeatable and precision in analyzing mouse reticulocyte from early phase bone marrow form of acute

7、radiation sickness.Fluorescence intensity of reticulocyte is more practical than percentage of reticulocyte in Key words flow cytometry acute radiation sickness reticulocyte fluorescence intensity 传统的检测网织红细胞的方法均采用煌焦油蓝染液活体染色后显微镜下观察计数，主观因素多，误差大，费时费力。在流式细胞技术逐渐普及的今天，国内应用流式细胞技术检测网织红细胞的报道逐年增多 16 ，但没有检索到应用

8、在急性放射病中的文献，我们用流式细胞技术观察了C57小鼠急性骨髓型急性放射病早期网织红细胞的变化，探索流式细胞术应用于检测骨髓型急性放射病早期网织红细胞的可行性。 1 材料和方法 1.1 材料 流式细胞仪（型号FACSCalibur，美国B-D公司产品），Retic-COUNT Reagent（美国B-D公司产品），主要成分为噻唑橙（TO），血细胞稀释液（山东兰桥医学科技有限公司提供）。 1.2 实验动物及分组 我院实验动物中心繁殖的二级C57成年小鼠，实验动物质量合格证:SCXK-（军）2002-001，实验动物实验设施使用证明:SYXK-（军）2002-001。实验分为6组，照射剂量分别为

9、2、4、6、8、10、12Gy，每组10只动物，雌雄各半，分别在照前和照后6、12、24、48、72h检 基金项目:全军“十五”指令性基金资助课题（编号:01L018） 测网织红细胞。 1.3 照射条件 我所 60 Co射线照射源，根据上述分组一次全身照射，照射距离4m，照射量率为4.45×10 -2 C/kgmin（172.4R/min）。 1.4 实验方法 1.4.1 网织红细胞染色 取小鼠肝素抗凝尾静脉血2.5l，加入0.5ml Retic-COUNT Reagent中，室温避光30min，同时设血细胞稀释液的阴性对照。 1.4.2 流式细胞仪检测 用CELL Quest软件前

10、向角和侧向角均以对数方式获取RBC50000个，分辨率为256，用Retic-COUNT软件自动分析网织红细胞百分比和荧光强度（FL）（图1）。每只小鼠的网织红细胞百分比为阳性管与阴性对照管之差。 1.5 统计学分析 对实验结果采用SAS6.12软件进行多因素多水平的析因设计资料的方差分析。 2 结果 2.1 照射后各组小鼠网织红细胞百分比的变化 由表1及图2可以看出，照后6h各组动物的网织红细胞百分比都比照前有升高的趋势，但升高不显著（P>0.05），尔后开始下降，12h开始低于照前值，直到72h降到最低。2Gy照射组在48、72h明显高于其他剂量照射组（P<0.05），其他各组

11、之间差异无显著性。 2.2 照射后各组小鼠网织红细胞荧光强度（FL）的变化 由表2及图3可以看出，各组动物网织红细胞的荧光强度（FL）从照后12h开始持续下降，在照后72h，2Gy组有所恢 复，其他各组没有恢复的迹象。2Gy照射组在照射后48、72h，明显高于其他剂量组（P<0.05或P<0.01），其他各组之间差异无显著性。 表1 不同剂量照射后小鼠网织红细胞（%）的变化 略 表2 不同剂量照射后小鼠网织红细胞FL（ch）的变化 略本文来源于中华检验医学网 3 讨论 网织红细胞是晚幼红细胞脱核后到完全成熟的红细胞之间的过渡型细胞，由于其胞浆中尚存在嗜碱性的RNA物质，因而用煌焦油

12、蓝染液进行活体染色后，胞浆中可见有蓝绿色的网状结构，故名网织红细胞 7 。网织红细胞计数是判断骨髓红系造血功能的一种经典的指标。传统的网织红细胞计数方法是靠显微镜观察，主观因素多，重复性差。随着流式细胞技术的普及，尤其是流式细胞仪专用的网织红细胞计数试剂Retic-COUNT Reagent和网织红细胞自动化分析软件Retic-COUNT的出现，使网织红细胞的检测变的越来越方便、快速，并且重复性好，误差小 8，9 。流式细胞技术检测网织红细胞不但可以检测网织红细胞的百分比，并且还可同时检测网织红细胞中TO染料的荧光强度，荧光强度的强弱可间接反映出网织红细胞中RNA含量的高低，也就是能反映出网织

13、红细胞的幼稚程度。 我们用流式细胞技术检测了2、4、6、8、10、12Gy 60 Co射线照射后小鼠早期网织红细胞百分比和荧光强度的变化，这几个剂量涵盖了骨髓型急性放射病的轻度、中度、重度和极重度。从结果中看出，所有动物在照射后6h网织红细胞百分比有所升高，此后进行性下降，在照后48、72h只有2Gy照射组明显高于其他照射剂量组，直至72h未见有恢复的现象;荧光强度的变化不同于百分比的变化，所有动物都在 照射后6h开始下降，同百分比一样只有2Gy照射组在照后48、72h均高于其他照射剂量组。在这几个照射剂量中，只有2Gy照射组为轻度骨髓型急性放射病，这些变化符合骨髓型急性放射病早期造血功能的变

14、化规律。我们还发现，照后72h，2Gy照射组网织红细胞的荧光强度开始升高，表明网织红细胞中RNA含量增多，幼稚网织红细胞增加，骨髓红系造血变的开始活跃，预示着骨髓造血功能的开始恢复，但此时的网织红细胞百分比并未看到有恢复的迹象，提示我们:荧光强度的变化在判断骨髓造血功能方面比网织红细胞百分比更有意义，这些结果在用传统的镜检方法中是无法得到的。 我们尝试了将流式细胞术应用于骨髓型急性放射病早期网织红细胞的检测。证明流式细胞术检测网织红细胞快速、客观、重复性好、误差小，对判断骨髓造血功能是一种比镜检更为有效的技术，特别是网织红细胞荧光强度的变化对造血功能状态的判断比网织红细胞百分比更有意义。 本文来源于中华检验医学网 参考文献 1 孙芾，梁月桂，聂子龙，等.流式细胞仪测定网织红细胞.陕西医学检验，1995，10（1）:5-8. 2 丁建萍，王先觉，张俊芳，等.流式细胞仪检测网织红细胞观察化疗后骨髓功能变化的研究.中国实用儿科杂志，1996，11（5）:287-288. 3 崔巍，林其燧.阵发性睡眠性血红蛋白尿症外周血红系的免疫分型