简便快速获取人胶质细胞源神经营养因子基因的PCR方法

1、    简便快速获取人胶质细胞源神 经营养因子基因的PCR方法        【摘要】目的：建立简便快速地获取人胶质细胞源神经营养因子（GDNF）基因的PCR方法。方法：根据从GeneBank中调出的人GDNF基因全序列设计引物，提取人基因组DNA做模板行PCR， 经酶切和凝胶电泳鉴定产物。结果：扩增出425bp的人GDNF基因，经EcoR I酶切可见预期的341bp片段，证实获得正确的产物。结论：成功建立了一种简便快速地从人基因组DNA获取人GDNF基因的PCR方

2、法，避免了其他作者为获得GDNF基因而采取收集神经胶质瘤标本，提取RNA，逆转录PCR等较为繁琐的步骤，省时省力，经济实用。【关键词】人胶质细胞源神经营养因子 基因组DNAPCR 1993年Lin1等从胶质细胞中分离出一类新型神经营养因子，能显著促进黑质多巴胺能神经存活，故称胶质细胞源神经营养因子（glial cell line derived-neurotrophic factor,GDNF）。迄今研究表明GDNF对多巴胺能神经元、去甲肾上腺素能神经元、运动神经元和前脑胆碱能神经元等都有营养作用，GDNF在神经变性疾病的动物模型中所取得的效果表明它可望用于治疗一系列神经变性疾病，如帕金森病、

3、与胆碱能神经元衰退相关的痴呆症、肌萎缩侧索硬化症及其它运动神经元变性疾病等2，3。最近还发现GDNF能防止脑缺血后的迟发性神经元死亡4，提示它也可望用于治疗脑卒中。因此，我们建立简便快速地扩增人GDNF基因的PCR方法，为人GDNF因基的克隆和表达及临床应用打下基础。1材料与方法1材料GDNF上游引物：5CGGGATCCATGTCACCAGATAAACAAATG3 BamH I下游引物：5CGGGATCCTCAGATACATCCACACCT3 BamH I由TaKaRa公司合成。Taq DNA polymerase购自TaKaRa公司，EcoR1和Marker /EcoR I-Hind III

4、购自华美公司。2方法2.1提取人基因组DNA：收集人外周血白细胞，加入2ml TE(20mM Tris pH8.0, lmM EDTA)悬浮细胞，再加入0.5% SDS，100mg/L蛋白酶K，37水浴消化2小时，加入等体积酚氯仿抽提，取上相加入2倍体积无水乙醇沉淀，70%乙醇洗，空气干燥后溶于无菌水中，即获得人基因组DNA。2.2PCR扩增：50l反应体系中10x buffer(含Mg2+)5l，2.5mM dNTPs 4l，5M上下游引物各2.5l，人基因组DNA100ng,Taq DNA polymerase U。循环条件为941分钟，541分钟，721分钟，扩增30次。2.3扩增产物的

5、鉴定：取8l扩增产物，加入1l10x buffer, 1l EcoR I(14U/l)，37水浴消化2小时。取消化的扩增产物及未消化的扩增产物行1.5%琼脂糖凝胶电泳，以 /EcoR I-Hind III为分子量标准。2结果1PCR扩增人GDNF基因注：1:/EcoR I-Hind III Marker,2:扩增的人GDNF基因片段，3: EcoR I酶切人GDNF基因片段，4：PCR阴性对照由1可见，人基因组DNA经我们建立的PCR方法扩增后，得到425bp大小片段，该片段经EcoR I消化后可见341bp的片段，与实验设计相吻合。3讨论自GDNF被发现以来，此项研究领域非常活跃。目前国内已

6、有几家在开展这方面的工作，他们均是收集神经胶质瘤标本，提取其RNA后行逆转录PCR而得到GDNF基因5、6。我们通过分析得知人GDNF基因并不含有内含子，因而认为以人基因组DNA为模板即可通过PCR获取编码完整GDNF蛋白的基因，实验结果显示我们获得400bp大小的片段，与其他作者报道：用逆转录PCR得到的GDNF基因大小一致，从而证实了我们设计的正确性。在引物的设计方面，我们从GgneBank 中调出人GDNF基因的全序列485bp，其中81-482bp编码成熟的GDNF蛋白，152bp有单一的EcoR I酶切位点。Lin等的研究结果显示编码成熟的GDNF蛋白的这段片段可在原核系统中表达，且

7、有生物学活性1。因此，我们针对81-428 bp片段设计引物，上游引物为81-98bp，前面加上ATG这一翻译起始密码，下游引物为468-482bp，后面加上TGA这一翻译终止密码，引物5端加上BamH I识别序列及修饰碱基，以利于下一步的克隆。总之，我们成功建立了一种简便快速地扩增人GDNF基因的PCR方法，免除了收集神经胶质瘤标本，提取RNA，逆转录等较为繁琐的步骤，省时省力，经济实用，为我们下一步研究工作的开展提供了有利条件。张玲（430060武汉，湖北医科大学附属第一医院神经内科）王颖群（广州军区武汉总医院医学实验中心）吴佐泉（广州军区武汉总医院医学实验中心）余绍祖（430060武汉，

8、湖北医科大学附属第一医院神经内科）参 考 文 献1，Lin LF,Doherty DH,Lile JD,et al. GDNF,a glial cell line-derived neurotrophic factor for midbrain dopaminergic neurons.Science, 1993,260:11302，Gash DM, Zhang Z, Ovadia A, et al. Functional recovery in Parkinsonian monkeys treated with GDNF. Nature, 1996,380:2523，Gash DM. Neuroprotective and neurorestorative properties of GDNF.Ann Neurol science, 1998,44(3 Suppl 1):S1214，Miyazaki H, Okuma Y, Fujii Y, et al. Glial cell line-derive